一種作物糊粉層特異表達啟動子PosAL1及其應用的製作方法
2023-12-10 04:37:16
一種作物糊粉層特異表達啟動子PosAL1及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種作物糊粉層特異表達啟動子PosAL1及其應用。本發明還提供了含有該啟動子的表達盒、作物表達載體、宿主菌和轉化子。具體而言，本發明將上述啟動子應用在作物基因工程中。本發明提供的啟動子可以特異地驅動外源基因在作物穎果糊粉層中表達，從而可有效用於種子品質和萌發特性的基因工程改良。用於改善作物穎果糊粉層的性狀。
【專利說明】—種作物糊粉層特異表達啟動子PosALI及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術和作物基因工程【技術領域】。具體而言，本發明涉及一種作物糊粉層特異表達啟動子及其應用，該啟動子能夠在作物基因工程中驅動目標基因在穎果糊粉層中特異表達，從而可在不影響其他組織部位生理活動的情況下達到通過改變糊粉層結構特性改良種子品質或萌發能力的目的。
【背景技術】
[0002]啟動子作為轉錄水平上一個重要的調控元件，通過和眾多轉錄因子的結合進而決定了基因的表達模式與表達強度。深入研究啟動子的結構、功能、作用模式等對於回答分子生物學中的一些基本理論問題具有重大意義。如何讓外源基因在植物體內定向、高效、穩定的表達是植物基因工程研究的出發點和落腳點。用組織特異表達啟動子來驅動目的基因表達可有效的避免用組成型表達啟動子所帶來的一些諸如代謝負擔之類的負面效應。
[0003]主要的單子葉主糧作物如水稻和小麥的表層胚乳會形成糊粉層，在穎果發育過程中，糊粉層將灌漿物質轉運到胚和胚乳細胞內部；籽粒萌發時，分泌水解酶水解胚乳細胞中貯藏的澱粉和蛋白從而發揮重要的水解功能，同時糊粉層細胞也是種子中主要積累脂類、蛋白、維生素、鐵鋅元素的部位，因此，糊粉層細胞是作物基因工程改良的主要靶點。要精確操縱糊粉層細胞的生理生化活性，糊粉層特異表達啟動子將至關重要，但目前僅有少量的特異啟動子的報導，如大麥LTP2啟動子和玉米AL9啟動子，遠遠無法滿足分子設計育種的需求。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種驅動外源基因特異的在作物糊粉層特異表達的啟動子、獲得含有該啟動子序列的轉化子以及該啟動子的應用。其中，本文中所涉及的「作物」是指單子葉作物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優選為水稻。
[0005]為了實現上述目的，一方面，本發明提供一種作物糊粉層特異表達啟動子，所述作物糊粉層特異表達啟動子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ IDNo:1所示的DNA序列為來源於日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的序列，本文中稱為PosALl或啟動子PosALl。具體而言,本申請的發明人發現日本晴水稻(Oryzasativa L cv.Nipponbare)中L0C_0s03g49190基因前包括轉錄起始位點在內的1960bp的DNA序列具有驅動目標基因在作物糊粉層特異表達的作用。並且分離克隆得到了序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。
[0006]優選地，本發明提供的作物糊粉層特異表達啟動子的DNA序列為SEQ ID No:1所示的序列，即PosALl或啟動子PosALl。
[0007]另一方面，本發明提供一種作物糊粉層特異表達啟動子，其DNA序列與SEQ IDNo:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者,所述作物糊粉層特異表達啟動子為在SEQID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物；或者所述作物糊粉層特異表達啟動子具有與SEQ ID No:1所示的DNA序列雜交的產物。這些作物糊粉層特異表達啟動子序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驅動目標基因在作物中表達。
[0008]另一方面，本發明還提供一種包含上述作物糊粉層特異表達啟動子的表達盒。
[0009]又一方面，本發明還提供一種重組表達載體，所述重組表達載體包含上述的作物糊粉層特異表達啟動子，在所述重組表達載體中，所述作物糊粉層特異表達啟動子連接於待表達的基因序列的上遊；優選地，所述待表達的基因為Gus基因，所述重組表達載體為pCAMBIA1391-PosALl，該重組表達載體為將SEQ ID No:1所示的序列即PosALl或啟動子PosALl構建於pCAMBIA1391中得到的重組表達載體，本文中稱為pCAMBIAl391-P0SAL1。
[0010]或者待表達基因可以為任何對作物的糊粉層性狀具有改善能力的基因。通過本發明的啟動子驅動該基因在糊粉層中特異性地集中表達，從而實現改善作物糊粉層相應性狀的功能。
[0011]另一方面，本發明還提供一種宿主菌，所述宿主菌包含本發明提供的上述作物糊粉層特異表達啟動子、上述表達盒、或上述重組表達載體；優選地，所述宿主菌為根癌農桿菌。
[0012]另一方面，本發明提供一種轉化子，所述轉化子包含本發明提供的上述作物糊粉層特異表達啟動子、上述表達盒、上述重組表達載體、或上述宿主菌。其中，所述轉化子優選為轉基因細胞系、愈傷組織或植株。
[0013]再一方面，本發明提供上述作物糊粉層特異表達啟動子在培育轉基因作物中的應用。所述應用包括將本發明提供的上述作物糊粉層特異表達啟動子連接於載體的待表達的基因序列上遊(例如，將所述啟動子序列置於/插入目標基因之前)，從而構建重組表達載體，將所述重組表達載體轉化到作物細胞、組織或器官中進行培育。
[0014]並且優選地，所述應用可以用於改良作物生長特性，所述作物為單子葉作物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優選為水稻。
[0015]本發明中所提供的啟動子的DNA序列為(與序列表中SEQ ID No:1中相同):
[0016]aatcactac2 caataWtt ,gfa^cccaal tlcaagactt accgalcall lgtgcaggag60
gglgigaaac algggalctc UgcUgtcl caagaclcgl algglgccta taligctgcg120
IcaLgcatgg ataacaggia Laaccgcaal caaccacacl gcctcagact IaaLatgcca180
UlgLgaagg ctgccULga cLilaLaagc ctticaggal ctaUlgtac agigclctic240
atatggataa aggcccaatt aaggcttaca clggcagcaa aatlgaatct tutttgtca300
agglcagtga glgaacaagc tgagtlgatl tccalttUc aaaccgcalg cclgcttgtt360
cltaggtagt Utatctgct atgUUata acacctgata tgttggtcaa atgcagtctg420
clatcagccc tgatggaaci cacaUcUg gtggttcgag tgatggcaac gtgtacttat480
ggcaggtagt lgttggalca lgttalcatl tcgcacacgc atlagctgct cUUaciit540
clallcalgc cactactttl tcaclgacat agglggalca gcctgaaaga gglcclalaa600
LUtggaagg ccalgaaggt gaagctactl cagttgactg glatgttcta catacaatlg660
LagUlUtl Uglgia aai cLlatcaacc atccaalgil cagatlicag iacgaUtti720
tcacaaitlt cagglgtgca tcagagglcg ggaagalcgc aacgtcalct gacgatlcca780
aggtgagtal gtgatlaacc UgcaaaUl tgtlcatlca actttcatga atcttatgag840
aatgagaicc UUcttUt ctattacaca cctacatgtt gcaagcgaat ttaaatgcct900
gUttggtat gtagaaaggg gagctgctga taticagtat UtttUaag aaaaccaclg960
alaacaacac Utalgatgt gtalcialca ggtlcgcgla lggaalactg agagaagggi1020
gitcccaaac acaagtlccc caacggtcal ccgcaagaga ataaccgcac caaacactgg1080
aagccgglct gcLagccalg agcLagctac tacctcaaga galgtaggag lagcagcclg1140
caccaglgca gatggtgaaL tgccaactgg Ucacgctci ccccUcagc ccagagLact1200
[0017]
【權利要求】
1.一種作物糊粉層特異表達啟動子PosALl，其特徵在於，所述作物糊粉層特異表達啟動子PosALl包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的作物糊粉層特異表達啟動子PosALl，其特徵在於，所述作物糊粉層特異表達啟動子PosALl的DNA序列為SEQ ID No:1所示的序列。
3.一種作物糊粉層特異表達啟動子PosALl，其特徵在於，所述作物糊粉層特異表達啟動子PosALl的DNA序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者，所述作物糊粉層特異表達啟動子PosALl為在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物； 或者，所述作物糊粉層特異表達啟動子PosALl具有與SEQ ID No:1所示的DNA序列雜交的產物。
4.一種表達盒,其特徵在於,所述表達盒包含權利要求1-3中任意一項所述的作物糊粉層特異表達啟動子PosALl。
5.—種重組表達載體,其特徵在於,所述重組表達載體包含權利要求1-3中任意一項所述的作物糊粉層特異表達啟動子，在所述重組表達載體中，所述作物糊粉層特異表達啟動子連PosALl接於載體中待表達的基因序列的上遊。
6.根據權利要求5所述的重組表達載體，其特徵在於，所述待表達的基因為Gus基因，所述重組表達載體為pCAMBIAl391-PosALl，其中pCAMBIA1391為作物雙元表達載體；或者所述待表達基因是具有改善糊粉層性狀功能的基因。
7.一種轉化子，其特徵在於，所述轉化子包含權利要求1-3中任意一項所述的作物糊粉層特異表達啟動子PosALl、權利要求4所述的表達盒、或根據權利要求5或6所述的重組表達載體。
8.一種根據權利要求1-3中任意一項所述的作物糊粉層特異表達啟動子PosALl在培育轉基因作物中的應用，其特徵在於，所述應用包括:將根據權利要求1-3中任意一項所述的作物糊粉層特異表達啟動子連接於載體中待表達的基因序列上遊，從而構建重組表達載體；將所述重組表達載體轉化到作物細胞、組織或器官中進行培育。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述應用用於作物基因工程改良，所述作物為單子葉作物:水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥。
【文檔編號】C12N15/113GK104073492SQ201410326191
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月9日 優先權日:2014年7月9日
【發明者】魏鵬程, 楊劍波, 李莉, 秦瑞英, 李 浩 申請人:安徽省農業科學院水稻研究所