魚藤酮作為非小細胞肺癌細胞增敏劑的應用的製作方法

2023-12-10 04:12:46 1

專利名稱：魚藤酮作為非小細胞肺癌細胞增敏劑的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及線粒體呼吸鏈抑制劑魚藤酮在逆轉非小細胞肺癌細胞對靶向性抗腫 瘤藥物耐受的新用途。
背景技術：
惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病。江蘇省近幾年開展了以惡性腫瘤為主的全 人口死因回顧性調查，結果顯示男女性第1位死因均為惡性腫瘤，其死亡率佔全部死因的 27. 41 %。資料顯示，2003年江蘇省城市地區位於惡性腫瘤死亡前4位的分別是肺癌、胃癌、 肝癌、食管癌；而農村地區為肝癌、肺癌、食管癌、胃癌。肺癌和胃癌死亡率城市明顯高於農 村。尤其是通過分析1973至2004年幾種主要惡性腫瘤的死亡情況發現，肺癌死亡率大幅 上升，2004年肺癌死亡率是1973年的5. 65倍。由此可見，肺癌已經成為我省惡性腫瘤數一 數二的「殺手」，嚴重威脅著我省人民的生存健康。為什麼在短短的幾十年間，肺癌的發病率及死亡率有如此迅猛的發展趨勢？ 1 大樣品調查研究表明肺癌的主要危險因素為吸菸和大氣汙染，而近年來吸菸人數有增加的 趨勢，汽車尾氣和工業廢氣的大量排放，又加重了大氣環境汙染的程度。因此，隨著我省經 濟的發展，城市化、工業化進程的加快，空氣汙染將會越來越嚴重，這將不可避免地導致肺 癌死亡率進一步增加。2:肺癌在早期時往往沒有明顯的症狀，當有症狀被診斷出來時，常常 已經是局部晚期或晚期無法手術切除的情形。一般而言，新診斷的肺癌僅約不到20%的病 人屬於早期可以有機會接受手術切除的病患。而另外80%的晚期肺癌病人則失去了外科手 術根治的最佳時機。3:到目前為止，對肺癌的治療，尤其是晚期肺癌病人缺乏非常有效的治 療幹預手段。臨床上，肺癌通常分為小細胞與非小細胞肺癌兩種類型，總的肺癌病例中，非小細 胞肺癌(包括肺鱗癌，肺腺癌)約佔80%。因此針對非小細胞肺癌的治療研究是攻克肺癌 的一項極其重要的課題，引起了全世界醫學界的廣泛關注。如上所述，雖然手術治療是治療非小細胞肺癌的重要手段，但對絕大部分晚期肺 癌病人來說手術治療並不能有效解決腫瘤轉移的問題。因此對於這些晚期或已經有遠端轉 移的肺癌病人，全身性的化學治療是非小細胞肺癌多學科綜合治療的主要策略之一。尤其 是化療與手術、放射等療法綜合運用能明顯防止癌腫轉移、復發，提高長期生存率。現在，非 小細胞肺癌化療已經初步形成共識，通常採用順鉬加泰索帝、紫杉醇、健擇、諾維本等中的 一種。根據患者的具體情況，選擇不同的組合，可以達到提高療效，降低毒性反應的目的，特 別是出現了一些極具前景的新型靶向藥物，其作用機制與傳統化療藥物不同。傳統化療藥 物屬於細胞毒性藥物，是通過毒性殺死腫瘤細胞，但同時不可避免會傷害正常細胞。而靶向 藥物進入腫瘤細胞後，可以通過特異性作用於腫瘤生長的細胞信號途徑，抑制腫瘤細胞的 增殖、浸潤、轉移，不良反應輕，患者可以很好耐受。在這些靶向藥物中，TRAIL(腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體)越來越受到人們 的關注。TRAIL是由Wiley於1995年檢索EST時首次發現並克隆的，是一種II型糖蛋白，屬於腫瘤壞死因子家族，與相應受體結合後，可以快速誘導細胞發生凋亡。但與其它凋亡 誘導分子顯著不同的是，TRAIL主要殺傷轉化細胞和腫瘤細胞，而正常細胞可以逃逸它的殺 傷作用。體內研究表明，TRAIL可以明顯抑制腫瘤生長，甚至徹底清除腫瘤。TRAIL的這種 腫瘤細胞選擇性殺傷作用使該蛋白在抗腫瘤方面具有很強的開發價值與潛力。但是值得注 意的是，並非所有的腫瘤細胞對TRAIL都具有很強的敏感性。體外研究表明，有些腫瘤細胞 對TRAIL誘導凋亡作用具有很強的耐受性。這可能與腫瘤細胞表面缺乏TRAIL受體(DR4， DR5)，或分布有假受體(DcRl，DcR2)，或過度表達一些抗凋亡蛋白如bcl_2，FLIP, survivin 有關。因此TRAIL的抗腫瘤作用因不同的腫瘤類型而異。研究表明，非小細胞肺癌細胞對TRAIL有明顯的耐受性，但具體的機理目前並不 清楚。為了充分發揮TRAIL對腫瘤細胞的選擇殺傷作用，有必要尋找新的策略以逆轉非小 細胞肺癌細胞株對TRAIL的敏感性，從而達到運用TRAIL有效治療非小細胞肺癌的目的。魚藤酮(rotenone)是從天然植物中分離出來的化合物，其結構見式1。該物質能 與線粒體呼吸鏈複合物I結合，從而抑制線粒體氧化磷酸化、降低線粒體膜電位、導致細胞 發生損傷，該化學物質是殺蟲劑的重要組成成分之一，能通過抑制昆蟲細胞線粒體功能殺 死昆蟲細胞。但有研究表明長期使用含該化合物的殺蟲劑使農民易患帕金森氏病與老年痴 呆。進一步研究表明，該物質在田間作業，通過農民長期吸入、吸收後能抑制神經元細胞線式1但是近來也有研究表明，魚藤酮能抑制腫瘤細胞增殖，或促進腫瘤細胞凋亡。 如魚藤酮能誘導白血病細胞K562或Jurkat細胞凋亡，或誘導神經瘤細胞SH SY-5Y細胞凋 亡，因而顯示了該物質在抗腫瘤藥物開發上的應用。由上述背景可知，魚藤酮能抑制腫瘤細胞，但該化合物本身也能誘導神經細胞凋 亡而產生諸多毒副作用，如何揚長避短，充分發揮該化合物潛在的抗腫瘤效果是值得深入 研究的問題。遵循這樣的思路，我們發現低劑量的魚藤酮能增強非小細胞肺癌細胞對TRAIL 的敏感性，從而為TRAIL的聯合用藥抗腫瘤提供了一個新的侯選化合物。

發明內容
為了克服非小細胞肺癌細胞對TRAIL的耐受性問題，本發明提供了魚藤酮化合物 的新用途，有效地解決了非小細胞肺癌細胞對TRAIL的耐受性問題。本發明所採用的技術方案是魚藤酮化合物在製備治療非小細胞肺癌的藥物中的
粒體功能，從而誘導神經元細胞凋亡。
4應用。上述所說的應用，具體可以是將魚藤酮與TRAIL製成治療非小細胞肺癌的組合 物。具體地，魚藤酮作為非小細胞肺癌細胞增敏劑的應用。本發明表明魚藤化合物與TRAIL的聯合用藥本身對正常細胞(HEK293)的無明顯 毒副作用，表明魚藤酮與TRAIL是一種新的可用於治療非小細胞肺癌的藥物組合。


圖1魚藤酮聯合TRAIL對A549細胞凋亡的影響；圖2魚藤酮聯合TRAIL對 NCI-H460細胞凋亡的影響；圖3魚藤酮增強TRAIL誘導的A549細胞caspase 3激活；圖4 魚藤酮選擇性增強非小細胞肺癌細胞對TRAIL的敏感性；圖5魚藤酮上調A549細胞表面死 亡受體DR4與DR5 mRNA表達水平；圖6魚藤酮抑制A549細胞FLIP^與FLIPs的表達水平。
具體實施例方式實驗材料A549、NCI-H460非小細胞肺癌細胞株均購自ATCC公司。DMEM細胞培養 液、胰酶購自美國Hyclone公司。MTT、PI、RNAase購自美國Sigma公司。魚藤酮購自美國 Sigma公司。Caspase 3檢測試劑盒購自美國Biovision公司。EGFP標記的Annexin V由 本實驗室自行製備獲得。實施例一魚藤酮對TRAIL誘導的非小細胞肺癌細胞(A549)死亡的影響非小細胞 肺癌細胞A549或NCI-H460於DMEM+10%胎牛血清培養液中培養，培養條件為37°C，5% CO2 的溼潤無菌環境。細胞長至80%-90%融合時，用PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化。按細胞 量6X IO4/孔接種於24孔細胞培養板中。待細胞貼壁生長完全後，加入藥物分別為TRAIL 50ng/ml,TRAIL 100ng/ml，魚藤酮 10nM，TRAIL 50ng/ml+魚藤酮 10nM，TRAIL 100ng/ml+魚 藤酮 10nM，魚藤酮 ΙΟΟηΜ，TRAIL 50ng/ml+魚藤酮 ΙΟΟηΜ，TRAIL100ng/ml+魚藤酮 ΙΟΟηΜ， 魚藤酮 ΙΟΟΟηΜ，TRAIL 50ng/ml+魚藤酮 ΙΟΟΟηΜ，TRAIL100ng/ml+魚藤酮 ΙΟΟΟηΜ，魚藤酮 10 μ Μ, TRAIL 50ng/ml+ 魚藤酮 10 μ Μ, TRAIL100ng/ml+ 魚藤酮 10 μ Μ,每組 3 個孔(圖 1， 2)，細胞經藥物處理12h後收集，用預冷PBS洗2遍，加入EGFP標記的Armexin V(2yL),冰 上孵育20min，迅速加入PI (1 μ g/mL)，於流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況，Annexin V(+)/ PI(-)為早期凋亡細胞。結果採用Armexin V/PI雙染法考察A549細胞對TRAIL的敏感性，發現在無魚 藤酮存在的情況下，TRAIL 50ng/ml或lOOng/ml能引起小部分A549細胞凋亡(圖1)，當 加入魚藤酮濃度彡IOOnM時，對TRAIL誘導的A549細胞凋亡增效作用並不強，但當加入魚 藤酮濃度> IOOnM時，可以明顯看出魚藤酮顯著增強TRAIL誘導的A549細胞凋亡，如在 魚藤酮IOOOnM時，能將TRAIL 100ng/ml誘導的細胞凋亡由15. 3 %提高到26. 8 %，同樣 地，在魚藤酮10 μ M時，能將TRAIL誘導的細胞凋亡由25. 3%提高到72. 5%，由此，魚藤酮 (IOOnM-IO μ Μ)能顯著性增強Α549細胞對TRAIL的敏感性。類似的結果在NCI-H460細胞 中也得到驗證(見圖2)。實施例二TRAIL與魚藤酮對caspase 3水解酶活性的影響非小細胞肺癌細胞A549 於DMEM+10%胎牛血清培養液中培養，培養條件為37°C，5% CO2的溼潤無菌環境。細胞長
5至80% -90%融合時，用PBS洗滌2次，0. 25%胰酶消化。按細胞量6 X IO4/孔接種於24孔 細胞培養板中。加入藥物處理，分別為對照組、TRAIL 100ng/ml, TRAIL lOOng/ml+魚藤酮 1 μ Μ，魚藤酮1 μ Μ，每組重複3個孔(圖3)。處理12h後，將細胞用胰酶消化後，加入FITC 標記的DEVD. fmk 1-2 μ 1，於冰上孵育30min後，PBS洗2遍，流式細胞儀分析FITC螢光強度。結果caspase 3的激活是細胞凋亡的重要指標，無論是死亡受體介導的，還是線 粒體通路所介導的細胞凋亡，最終均體現在caspase 3的激活上，因此通過測量caspase 3 的活性可以作為細胞凋亡的重要指標。在本研究中，採用FITC標記的caspase 3底物，與 細胞共孵育，該底物能穿透細胞膜進入到細胞內部，遇激活的caspase 3時被酶切，釋放出 FITC，從而被流式細胞儀檢測到。結果與免疫螢光相符(圖3)，在單用TRAIL時，細胞內 caspasee3部分激活，而單用魚藤酮對caspase 3酶活性無太大影響，細胞內caspase 3酶 激活不明顯，但是兩藥的聯用，細胞內caspase 3明顯被激活。實施例三毒性實驗HEK293與A549細胞分別於DMEM+10%胎牛血清培養液中培養， 培養條件為37°C，5% CO2的溼潤無菌環境。細胞長至80% -90%融合時，用PBS洗滌2次， 0.25%胰酶消化。按細胞量5X IO3/孔接種於96孔細胞培養板中。加入藥物TRAIL IOOng/ ml+魚藤酮1 μ M處理12h，每組重複3個孔(圖4)，處理12h後，收集細胞，按實施例一檢測 A549與HEK293細胞凋亡。結果為考察TRAIL與魚藤酮的聯用增效作用是否對正常細胞具有毒性副作用。 本研究比較TRAIL100ng/ml+魚藤酮(1 μ M)在正常細胞株(ΗΕΚ293)及腫瘤細胞株(Α549) 上的細胞毒性差異。結果見圖4，在明顯誘導Α549細胞凋亡的情況下，TRAIL+魚藤酮對正 常細胞無明顯的毒性，這些數據說明TRAIL+魚藤酮對腫瘤具有明顯的選擇性，是具有開發 前景的治療方案。實施例四魚藤酮對A549細胞DR4與DR5mRNA的影響1、細胞mRNA的提取所有物品 均提前用DEPC處理並滅菌。非小細胞肺癌細胞A549於DMEM+10%胎牛血清培養液中培養， 培養條件為37°C，5% CO2的溼潤無菌環境。細胞長至80% -90%融合時，用PBS洗滌2次， 0. 25%胰酶消化。按細胞量IX IO5/孔接種於6孔細胞培養板中。鋪細胞於6孔板，等細胞 長到80% -90%後，加藥(分別為魚藤酮1 μ M處理0，2，4，6h ；或魚藤酮0，10，100，IOOOnM 處理12h)，處理後收集細胞，PBS洗滌一次。加入lmLTRIZOL，用槍吹打至細胞完全溶解，室 溫放置5min。加入200 μ L的氯仿，振蕩15s後放置2_3min，2-8°C 12000g離心15min。吸 取上層，轉移到乾淨印pendorf管中，加入500 μ L異丙醇，放置lOmin，2-8°C下12000g離心 lOmin，可見RNA沉澱。棄上清，加入ImL 75%乙醇洗滌沉澱，7500g離心5min，在空氣中晾 幹RNA沉澱，加入30 μ LDEPC處理的DDW溶解。2.、逆轉錄PCR採用20 μ L逆轉錄體系，將提取的模板RNA約Iyg與5Xbuffer 4μ L, dNTP(10mM)2y L, oligo (dT) 18 (10 μ mol/L) 1 μ L, RNase Inhibitor lyL，逆轉錄酶 1 μ L混勻後30°C水浴lOmin，42°C水浴30min，98°C水浴lOmin。取等量的cDNA做模板做 PCR 擴增，採用 20yL PCR 反應體系DDW 15. 2 μ L，10 X Taq buffer 2. 5 μ L, dNTP 2 μ L, Mg2+2 μ L，上遊引物 1 μ L，下遊引物 1 μ L，cDNA 模板 1 μ L，Taq polymeraseO. 3 μ L。PCR 條 件94°C熱變性4min後；94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸40s (循環數為20-45個)； 最後72°C延伸7min。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，EB顯色。
結果TRAIL死亡受體是決定腫瘤細胞對TRAIL是否有敏感性的重要因素，本研究 發現魚藤酮能時間依賴性與劑量依賴性地提高A549細胞內DR4與DR5mRNA的表達量(圖 5)。實施例四魚藤酮對A549細胞FLIP蛋白表達的影響非小細胞肺癌細胞A549於 DMEM+10%胎牛血清培養液中培養，培養條件為37°C，5% CO2的溼潤無菌環境。細胞長至 80% -90%融合時，用PBS洗滌2次，0. 25%胰酶消化。按細胞量IX IO5/孔接種於6孔細 胞培養板中。鋪細胞於6孔板，等細胞長到80%-90%後，加藥(分別為魚藤酮0，10，100， 1000，IOOOOnM)，處理12h後收集細胞。用預冷的PBS將細胞沉澱洗滌一次後，加入細胞裂解液混勻，冰上放置30min後， 12000rpm離心15min，吸取上清，通過考馬斯亮藍法進行蛋白定量，最後加入4X loading buffer沸水浴5min，樣品-20°C長期保存。按照分子克隆中的配方配製12% SDS-PAGE gel, 通過測定的樣品蛋白含量計算，保持各個樣品上樣量一致，上樣量為30-100yg。上層膠 採用80伏恆壓進行壓縮，下層膠120伏電壓分離，然後使用半乾法將PAGE膠中蛋白轉印 至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上，恆壓IOV電轉2h。轉膜結束後麗春紅S(0. 5% ponceaus S in 1% acetic acid)對膜進行染色，確定轉膜效率。配製5%的脫脂奶粉(PBST 配製)對膜進行4°C封閉過夜或者室溫lh。包被結束後，用PBST將牛奶洗去，根據抗體說 明用PBST稀釋FLIP—抗(1 1000)，將膜一抗包被室溫孵育Ih或4°C過夜。將膜放置在 搖床，用PBST洗滌5次，每次5-lOmin。再包被二抗，將HRP (辣根過氧化物酶)標記的二抗 1 2000稀釋(PBST配置的牛奶)，與膜共同孵育Ih後，同樣PBST洗滌5次，每次5-lOmin。 按照產品說明配製發光底物溶液滴加於PVDF膜上，室溫放置l-2min，用濾紙將多餘發光液 吸乾，將膜用保鮮膜包被後放入壓片夾移入暗房，取X光片置於膜上曝光l-5min後，衝洗膠 片，根據曝光條帶判斷蛋白的表達結果。結果FLIP是細胞內重要的抗凋亡蛋白，分為？！^？^與FLIPs兩種形式。它們通過 與Caspase 8競爭結合蛋白，從而抑制細胞凋亡過程中死亡複合物(DISC)的形成，從而抑 制細胞凋亡。FLIP在很多腫瘤如肝癌、乳腺癌均為高表達，它的蛋白質表達受諸多因素調 控，如泛素化、磷酸化等過程。在本研究中發現魚藤酮處理的A549細胞，其FLIPl與FLIPs 蛋白水平的表達呈現逐漸下降的趨勢(圖6)，顯示魚藤酮可能是抑制了 FLIP的表達，從而 增強A549對TRAIL誘導凋亡的敏感性。
權利要求
魚藤酮作為非小細胞肺癌細胞增敏劑的應用。
2.魚藤酮在製備治療非小細胞肺癌的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種線粒體呼吸鏈抑制劑魚藤酮在逆轉非小細胞肺癌細胞對靶向性抗腫瘤藥物耐受的新用途。魚藤酮作為非小細胞肺癌細胞增敏劑，能逆轉非小細胞肺癌細胞對靶向性抗腫瘤藥物耐受性。本發明表明魚藤化合物與TRAIL的聯合用藥本身對正常細胞無明顯毒副作用，是一種新的可用於治療非小細胞肺癌的藥物組合。
文檔編號A61K31/352GK101904837SQ20101024124
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月31日 優先權日2010年7月31日
發明者華子春, 施怡琳, 殷武 申請人:南京大學