一種小麥耐鹽基因的製作方法
2023-12-10 04:09:56 1
專利名稱：一種小麥耐鹽基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種小麥耐鹽基因TaSC(Triticum asetivum L.Salt-tolerant Correlative)，屬於基因科學技術領域。
背景技術：
研究表明，影響農作物生長和產量的最主要因素是環境脅迫，其中又以鹽脅迫和乾旱脅迫最為嚴重。據統計，1939～1978年間，影響作物產量的各種環境因素中乾旱和鹽鹼造成的減產高達40％以上。我國的鹽漬土壤約5億畝，其中鹽漬耕地1億多畝，還有3億多畝鹽漬荒地有待開墾利用，次生鹽鹼化土壤面積還在繼續擴大，給農業生產造成重大損失。如何減輕鹽脅迫對農業生產的影響，從而使大面積的鹽鹼地、荒漠化土地和豐富的鹽水資源可以為農業生產所利用，這是未來農業發展所面臨的一個重要課題。
發明內容
鑑於目前對小麥耐鹽相關基因的研究證明TaSC基因與鹽脅迫下的信號傳導密切相關，本發明的目的在於從小麥耐鹽突變體中分離、克隆小麥耐鹽基因，為進一步研究小麥耐鹽機理，擴大作物在鹽鹼地的種植面積提供科學依據。
為了實現本發明的目的，本發明者從1986年開始利用濮農3665與百農3039雜交後的F1花葯培養，EMS誘變、耐鹽性反覆篩選，從同一單粒的後代中得到小麥耐鹽突變體RH8706-49(該兩個生物材料保存在中國河北省農林科學院糧油作物研究所，公開文獻見《遺傳》1997年19卷，第六期，第7-11頁，「誘發小麥花葯愈傷組織及其再生植株抗鹽性變異的研究」，作者沈銀柱等；《電子顯微學報》2001年第20卷，第二期，98-101頁「近似等位基因系小麥鹽脅迫下葉綠體超微結構的比較研究」，作者秘彩莉、黃佔景、沈銀柱等)，已穩定遺傳15代。最初從小麥耐鹽突變體中獲得TaSC基因經過如下步驟
①利用這兩個材料，將種子消毒後，分別水培至二葉一心，而後移入1/2Hoagland溶液，每一品系分別加入0％的NaCl和1％的NaCl脅迫處理72小時，以每一品系0％NaCl處理為對照，屆時分別取4個處理的第二葉迅速液氮冷凍提取總RNA；②分別用上述4個處理的總RNA反轉錄得到cDNA；③通過cDNA-AFLP技術獲得如下cDNA序列tttaatggtcggaaaatctcgcggaagacagacgtaatagtccatacccatgtgtggtcctgtgtaaaaaaatatgttcattccagggcgggattacttggtgtccgtgtgtgcatagctgaccgcttcctgaaatggacccctagcatcagtactacgtacctacgtgcgtgtttatcctaatttgttgtgagcttgtggtgcttggtggctcgagaggctagcattgagattggatcacgagctgcctgcag將上述cDNA序列在NCBI網站中通過EST比對進行電子克隆，以獲得全長cDNA序列，再以此cDNA序列進行Blastn和Blastx，驗證是否具有完整的ORF區；④根據獲得的全長cDNA序列用DNAStar的Primer Select設計特異引物，並由上海生物工程公司合成。為方便後續操作，引物帶上酶切位點5′端引物I5′TCTAGAGAGGCGAGGGTTTGGTGCGG 3′(下劃線為Xba I酶切位點)3′端引物II5′GAGCTCTCCATTTCAGGAAGCGGTCAG 3′(下劃線為Sac I酶切位點)由上海生物工程公司合成該特異引物，採用上海生物工程公司生產的Pfu酶，按照常規方法在PCR擴增儀上，以小麥耐鹽突變體RH8706-49的雙鏈cDNA為模板進行擴增94℃預變性5min，而後94℃ 30s，66℃ 1min，72℃ 1min，30個循環後，72℃保溫10min。經1％ Agarose電泳後，將該擴增片段(591bp)(見附圖2)回收加A尾、連接重組於PGEM-T質粒轉化大腸桿菌DH5α，通過快速PCR法篩選出陽性克隆，得到重組子，經質粒DNA電泳和酶切電泳鑑定後菌液送往上海生物工程公司測序，結果見附圖4，圖5。
⑤提取RH8706-49總RNA，然後轉膜，用放射性同位素標記的TaSC作探針，進行Northern雜交驗證(見附圖3)。
該基因開放閱讀框(ORF)含426bp，編碼141個胺基酸，該蛋白的分子量為15.32KD，pI為3.96。我們將其命名為TaSC(Triticum asetivum L.Salt-tolerant Correlative)，該基因的核苷酸序列及相應的胺基酸序列如附圖6所示。
該基因的分離方法如下(1)按照常規方法提取小麥耐鹽突變體RH8706-49的總RNA，反轉錄為cDNA；(2)根據TaSC兩端序列設計特異引物；5′端引物I5′TCTAGAGAGGCGAGGGTTTGGTGCGG 3′(下劃線為Xba I酶切位點)3′端引物II5′GAGCTCTCCATTTCAGGAAGCGGTCAG 3′(下劃線為Sac I酶切位點)(3)PCR擴增採用上海生物工程公司生產的Pfu酶，以小麥耐鹽突變體RH8706-49的cDNA(用時稀釋10×)為模板進行PCR擴增；①反應體系(在0.2ml EP管中依次加入以下各成分)
②輕彈管底混合樣品，稍事離心；③在PCR擴增儀上按下列程序進行擴增94℃預變性5min，[94℃ 30s，66℃ 1min，72℃ 1min]×30個循環後，72℃保溫10min；
(4)將上述20μl PCR產物在1％Agarose/EB膠上電泳，結果見圖2。掃描後將特異擴增片段(591bp)在紫外燈下切取，產物按回收試劑盒提供的步驟進行回收；(5)擴增產物的加(A)尾反應(在0.5ml EP管中依次加入以下成份)
將混合物輕彈、混勻後，於70℃水浴15-30min。
(6)與T-載體(PGEM-T)的連接反應(附圖5)
混勻後離心，4℃反應過夜。
(7)大腸桿菌感受態細胞的製備(按1989 Sambrook et al.CaCl2方法製備)(8)用上述載有特異擴增產物TaSC的T載體轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞；(9)通過蘭白斑篩選鑑定轉化子(重組子)，提取轉化子質粒DNA，電泳檢測(見附圖3)。用原初設計的特異引物進行PCR鑑定，挑選陽性克隆(見附圖4)；(10)將陽性克隆擴培後的菌液送往上海生物工程公司測序，所得序列與最初由EST拼接的cDNA片段用DNAStar進行比較，結果完全一致，既說明實驗的可靠性又說明該基因在小麥的DNA中確實存在。
圖1一個典型的cDNA-AFLP選擴結果圖。
圖2小麥耐鹽突變體TaSC基因的PCR結果圖。
圖3小麥耐鹽突變體TaSC基因的Northern雜交圖。
圖4小麥耐鹽突變體TaSC基因陽性克隆的鑑定圖。
圖5pGEM-T-TaSC載體陽性克隆的PCR檢測圖。
圖6小麥耐鹽突變體TaSC基因的核苷酸序列及相應的胺基酸序列圖。
具體實施例方式
以下實施例用以說明本發明。
實施例本發明給出的小麥耐鹽基因開放閱讀框(ORF)含426bp，編碼142個胺基酸，將該基因克隆入原核表達載體，可以在大腸桿菌中表達出一種分子量為15.32KD的原核表達產物即小麥耐鹽相關基因蛋白。
上述TaSC基因及其表達產物，可由以下步驟獲得利用濮農3665與百農3039雜交F1的花粉培養，EMS誘變、耐鹽性反覆篩選從同一單粒的後代中得到小麥耐鹽突變體RH8706-49(耐鹽指數≥1.3)和敏鹽突變體H8706-34(耐鹽指數≤0.5)，經過如下步驟①利用這兩個材料，將種子消毒後分別水培至二葉一心，而後移入1/2Hoagland溶液，每一品系加入0％NaCl和1％NaCl脅迫處理72小時，以每一品系0％NaCl處理為對照，屆時分別取4個處理的第二葉迅速液氮冷凍提取總RNA；②分別用上述4個處理的總RNA反轉錄得到cDNA；③通過cDNA-AFLP技術獲得如下cDNA序列；tttaatggtcggaaaatctcgcggaagacagacgtaatagtccatacccatgtgtggtcctgtgtaaaaaaatatgttcattccagggcgggattacttggtgtccgtgtgtgcatagctgaccgcttcctgaaatggacccctagcatcagtactacgtacctacgtgcgtgtttatcctaatttgttgtgagcttgtggtgcttggtggctcgagaggctagcattgagattggatcacgagctgcctgcag將上述cDNA序列在NCBI網站中通過EST比對進行電子克隆，以獲得全長cDNA序列。再以此cDNA序列進行Blastn和Blastx，驗證是否具有完整的ORF區；④根據獲得的全長cDNA序列用DNAStar的PrimerSelect設計特異引物，並由上海生物工程公司合成。為方便後續操作，引物帶上酶切位點5′端引物I5′TCTAGAGAGGCGAGGGTTTGGTGCGG 3′(下劃線為Xba酶切位點)3′端引物II5′GAGCTCTCCATTTCAGGAAGCGGTCAG 3′(下劃線為Sac I酶切位點)由上海生物工程公司合成該特異引物，採用上海生物工程公司生產的Pfu酶，按照常規方法在PCR擴增儀上，以小麥耐鹽突變體RH8706-49的雙鏈cDNA為模板進行擴增94℃預變性5min，而後94℃ 30s，66℃ 1min，72℃ 1min，30個循環後，72℃保溫10min。經1％Agarose電泳後，將該擴增片段(591bp)回收加A尾、連接重組於pGEM-T質粒轉化大腸桿菌DH5α，通過快速PCR法篩選出陽性克隆，得到重組子，經質粒DNA電泳和酶切電泳鑑定後菌液送往上海生物工程公司測序，結果見附圖2；⑤提取小麥耐鹽突變體RH8706-49總RNA，然後轉膜，用放射性同位素標記的TaSC作探針，進行Northern雜交驗證(附圖3)；上述小麥耐鹽基因及其表達產物，還可由以下簡單步驟獲得(1)按照常規方法提取小麥耐鹽突變體RH8706-49的總RNA，反轉錄為cDNA；(2)根據TaSC兩端序列設計特異引物；5′端引物I5′TCTAGAGAGGCGAGGGTTTGGTGCGG 3′(下劃線為Xba I酶切位點)3′端引物II5′GAGCTCTCCATTTCAGGAAGCGGTCAG 3′(下劃線為Sac I酶切位點)(3)PCR擴增採用上海生物工程公司生產的Pfu酶，以小麥耐鹽突變體RH8706-49的cDNA為模板進行PCR擴增；(4)將上述PCR產物在1％Agarose/EB膠上電泳後回收完整的擴增產物；
(5)擴增產物的加(A)尾反應；(6)與T-載體(PGEM-T)的連接反應；(7)製備大腸幹桿菌感受態細胞；(8)用上述載有特異擴增產物TaSC的T載體轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞；(9)通過藍白斑篩選鑑定轉化子(重組子)，提取轉化子質粒DNA，用原初設計的特異引物進行PCR鑑定，挑選陽性克隆(附圖4)；(10)將陽性克隆擴培後的菌液送往上海生物工程公司測序，所得序列與最初由EST拼接的cDNA片段用DNAStar進行比較，結果完全一致。
權利要求
1.一種小麥耐鹽基因，其特徵在於該基因的核苷酸序列及相應的胺基酸序列如下T 12 CTA GAG AGG CGA GGG TTT GGT GCG GCC ATG GAG AAC CTG GCG ATG CTG TGG GGG ATC ATC 611 M E N L A M L W G I I 1162 GGG CCG GGC GTC GCC GGC GCG CTC TTC GGC GCC GGC TGG TGG TTC TGG GTC GAC GCC GTC 12112 G P G V A G A L F G A G W W F W V D A V 31122 GTC TGC AGC GCC GTC CAG GTC TCC TTC ATC CAC TAC CTG CCC GGG ATC TTC GCG TCG CTG 18132 V C S A V Q V S F I H Y L P G I F A S L 51182 GCC GCG CTC ATG TTC AAT TGC GTC GAC AAG GAT GCC ATC GGG AAC GAC TAC TAC TCG TCC 24152 A A L M F N C V D K D A I G N D Y Y S S 71242 TAT GGG GAT GAT TCC GAG TGG AGG GTG AAG CTT TGG CTT TTC GTC GCC TAC GTC GTC TCT 30172 Y G D D S E W R V K L W L F V A Y V V S 91302 TTC GTC TGC CTG GCT GGA TCG GTG GGT TTG TTG GTG CAA GAC GCC CTG ACA GAC AAG GGC 36192 F V C L A G S V G L L V Q D A L T D K G 111362 CCT TCT GTG TGG ACT GGT GTT GCC GGC GTT CTG CAA TGT GTT TTC GTG TTG ATA AGC GGG 421112 P S V W T G V A G V L Q C V F V L I S G 131422 TTG ACA TAC TGG ACG TGC CAC ACC GAG GAT TAA GGG TCA AAA ATC TCG CGA AGA CAG ACG 481132 L T Y W T C H T E D . 141482 TCT AGT CTA TAC CCG TGT GTG GTC CTG TGT AAA AAA ATA TGT TCA TTC CAG GGC GGG ATT 541542 ACT TGG TGT CCG TGT GTG CAT AGC TGA CCG CTT CCT GAA ATG GAG AGC TC 591該基因開放閱讀框含426p，編碼141個胺基酸，它編碼的蛋白分子量為15.32KD，pI為3.96。
2.按權利要求1所述的小麥耐鹽基因，其特徵在於是從小麥耐鹽突變體中分離得到的耐鹽基因。
3.含有如權利要求1所述的小麥耐鹽基因的重組原核表達載體，其特徵是將小麥耐鹽基因克隆至原核表達載體後獲得的原核表達載體。
4.含有如權利要求1所述的小麥耐鹽基因編碼的蛋白，其特徵是用原核表達載體轉化大腸桿菌細胞，經誘導後表達出的小麥耐鹽基因蛋白。
5.按權利要求1所述的小麥耐鹽基因，其特徵是它導入受體可用於耐鹽作物品系的培育。
6.一種得到如權利要求1所述的小麥耐鹽基因的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)按照常規方法提取小麥耐鹽突變體RH8706-49的總RNA，反轉錄cDNA；(2)根據TaSC基因兩端序列設計特異引物；引物I5′TCTAGAGAGGCGAGGGTTTGGTGCGG 3′(下劃線為Xba I酶切位點)引物II5′GAGCTCTCCATTTCAGGAAGCGGTCAG 3′(下劃線為SacI酶切位點)(3)PCR擴增；採用上海生物工程公司生產的Pfu酶，以小麥耐鹽突變體RH8706-49的cDNA為模板進行PCR擴增；(4)將上述PCR產物在1％Agarose/EB膠上電泳回收完整的擴增產物；(5)擴增產物的加(A)尾反應；(6)與T-載體(PGEM-T)的連接反應；(7)製備大腸桿菌感受態細胞；(8)用上述載有特異擴增產物TaSC的T載體轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞；(9)通過藍白斑篩選鑑定轉化子提取轉化子質粒DNA，用原初設計的特異引物進行PCR鑑定，挑選陽性克隆；(10)將陽性克隆擴培後的菌液送往上海生物工程公司測序，將結果與最初由拼接的cDNA片段用DNAStar進行比較。
全文摘要
本發明通過利用cDNA－AFLP技術所獲得的G09－94號cDNA序列，在NCBI網站中經EST比對後進行電子克隆、設計引物、進行PCR、序列測定，獲得小麥耐鹽突變體鹽脅迫下特異表達基因小麥耐鹽相關基因TaSC(Triticum asetivum L.Salt－tolerant Correlative)。該基因開放閱讀框(ORF)含426bp，編碼141個胺基酸，此基因編碼的蛋白pI值為3.96，分子量為15.32KDa，有4個跨膜區和1個信號肽區，定位在質膜上，與一未知功能的假定膜蛋白同源性為82.2％，與另一未知功能的蛋白家族(UFP220)同源性達79.8％，其表達產物參與了多條信號轉導途徑，將上遊反應信號轉導到下遊反應元件。本發明為進一步研究小麥耐鹽機理，提高小麥耐鹽性，擴大作物在鹽鹼地的種植面積提供了科學依據。
文檔編號C12Q1/68GK1807628SQ20061001232
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月12日 優先權日2006年1月12日
發明者黃佔景, 黃勝和, 趙寶存, 葛榮朝, 沈銀柱 申請人:河北師範大學