線柵監視設備的製作方法

2023-12-10 00:27:01 1

專利名稱：線柵監視設備的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物傳感器領域，更特別地，涉及子衍射極限生物傳感器。
背景技術：
生物傳感器技術在本領域中是眾所周知的。美國專利申請No.2003/0174992公開了 一種用於提供包括分析物的 零模式波導的方法和設備，所述分析物受電磁輻射的激勵以便對該分析 物進行分析。標題為 "Luminescence sensors using sub-wavelength apertures or slits" 的WO2006/136991公開了一種具有子波長空間解析度的生物傳感器。標題為 "Luminiscence sensor operating in reflection mode ，， 的 WO2007/072415公開了 一種用於檢測孔徑中的分子產生的螢光輻射的方法。這種生物傳感器可以包括設置在透明材料襯底上並且形成用於填 充所述分析物流體的至少 一個孔徑的非透明材料。這些孔徑在孔徑內的 介質中具有低於激發光的衍射極限的第一平面內維度並且在孔徑內的 介質中具有高於激發光的衍射極限的第二平面內維度。孔徑平面由沿著 孔徑的第一平面內維度定向的第一矢量和沿著孔徑的第二平面內維度 定向的第二矢量限定。這種線柵具有透射軸，其中被偏振化使得電場與 由第一矢量和垂直於孔徑平面的第三矢量限定的透射平面平行、以下稱 為T偏振光的光基本上被透射，並且被偏振化使得電場垂直於透射平面、 以下稱為R偏振光的光基本上被阻擋。分析物施加到生物傳感器並且滲透進入孔徑。該分析物包括待分析 的目標分子。目標分子利用發光體(luminophore )來標記，並且發光體 /目標分子的聚合體固定在孔徑的襯底側，而自由發光體和附接到目標分 子的發光體在分析物中存在於孔徑的分析物側。所述固定的發光體相應 於待分析的目標分子的定性或定量表示。來自固定的發光體的發射輻射由檢測器確定。為了將所述固定的發4光體的希望的輻射與自由發光體以及用發光體標記的目標分子的背景 輻射區分開來，必須抑制背景輻射。該背景輻射可能比來自固定的發光 體的有用輻射大幾個數量級。發光背景輻射的充分抑制允許實現基本上 無背景的測量，否則該測量需要沖洗，但是衝洗不可以在例如實時測量 期間發生。對於利用偏振激發光照射的實際的線柵生物傳感器而言，背 景輻射的抑制限於大約三個數量級。該有限的背景抑制最終導致傳感器的精度和表面特異性(surface-specificity)的降低。此外，在本領域中 需要能夠使用非偏振光源的生物傳感器，所述非偏振光源例如發光二極 管(LED),其更加便宜並且可以產生更大的輸出功率。發明內容因此，本發明的目的是單獨地或者以任何組合地緩解、減輕或消除 上述缺陷和缺點中的 一個或多個。依照本發明的 一個方面，提供了用於監視分析物流體中存在的發光 體所發射的輻射的設備，其包括生物傳感器，其具有至少一個設置在 透明材料襯底上並且形成用於填充所述分析物流體的至少一個孔徑的 非透明材料，所述孔徑具有小於該生物傳感器中的有效輻射波長的一半二;面內維度，並且具有透射平面；激^;:其用;激發所述生物傳2器的分析物流體中存在的發光體；檢測器，其用於檢測激發時發光體發 射的輻射；以及偏振濾波器，其設置在所述生物傳感器與檢測器之間。 所述檢測器可以設置在生物傳感器的襯底側。所述激發源可以是發射偏 振光的光源，該偏振光例如具有橢圓偏振(例如圓偏振)或線性偏振的 偏振光，或者所述激發源可以是發射非偏振光的光源。所述偏振濾波器 可以被設置用於充分地衰減其電場與孔徑的透射平面平行的輻射。該偏 振濾波器可以是可旋轉的。在一個實施例中，所述光源包括帶通濾波器，該濾波器用於使具有阻擋具有與所述發光二的丄射波長相應'的波長的輻射。此外,波長通帶 濾波器(pass filter)可以設置在檢測器之前，以便使具有與所述發光體 的發射波長相應的波長的輻射通過並且阻擋所述帶通濾波器通過的輻射。在另一個實施例中，所述偏振濾波器可以包括偏振分束器，該偏振 分束器向所述檢測器傳送具有與孔徑的透射平面平行的偏振平面的輻 射並且向第二檢測器反射或阻擋具有與孔徑的透射平面垂直的偏振的 輻射，或者所述偏振濾波器可以包括二向色鏡，該二向色鏡被設置成將 所述激發輻射導向生物傳感器並且將發射輻射傳送到所述檢測器。在另外的實施例中，來自所述光源的輻射可以被設置成在照射生物 傳感器之前通過所述偏振濾波器。在又一個實施例中，所述光源可以設置在生物傳感器的襯底側，並 且在反射模式下進行檢測。可替換地，所述光源可以設置在生物傳感器 的分析物流體側，並且在透射才莫式下進行檢測。所述光源可以發射具有低相干長度的光，例如具有大於大約lnm的帶寬的光。所述設備可以包括分析物流體並且該分析物可以在介質中包括目 標分子和發光體，例如螢光團(fluorophore),其包含在所述孔徑中。捕 獲分子可以設置在孔徑的襯底端部分的鄰近，所述捕獲分子用來與所述 目標分子和發光體形成聚合體。所述分析物流體可以設置在包括所述孔 徑的襯底的 一 側上並且所迷檢測器和偏振濾波器設置在襯底的另 一 側 上。


根據以下參照附圖對於本發明實施例的詳細描述，本發明的另外的 目的、特徵和優點將變得清楚明白，在附圖中 圖l為用於解釋原理的示意圖； 圖2為生物傳感器的實施例的示意圖； 圖3為生物傳感器的另一實施例的示意圖；以及 圖4為生物傳感器的另外的實施例的示意圖 圖5為本發明的又 一 實施例的示意性框圖； 圖6為本發明的又一實施例的示意性框圖； 圖7為本發明的又一實施例的示意性框圖； 圖8為本發明的又 一 實施例的示意性框圖； 圖9為本發明的又一實施例的示意性框圖； 圖10為本發明的又一 實施例的示意性框圖；圖ll包括兩幅照片，其示出了具有分別與覆蓋有被標記分子模式的線柵平行和垂直地設置的偏振濾波器的檢測器圖片。
具體實施方式
下面將參照附圖描述本發明的若干實施例。描述這些實施例是出於 說明的目的，以便使得本領域技術人員能夠實施本發明並且公開最佳的 模式。但是，這樣的實施例並沒有限制本發明。此外，在本發明的範圍 內，不同特徵的其他組合也是可能的。依照下面描述的實施例的生物傳感器可以包括設置在孔徑中的分 析物，所述孔徑以對於激發光和發光中的至少 一種非透明的材料限定， 典型的實例是鋁、金、銀、鉻，在孔徑內的介質中具有低於激發光的衍 射極限的第一平面內維度並且在孔徑內的介質中具有高於激發光的衍 射極限的第二平面內維度。平面內維度指的是平行於襯底的平面內的維 度。所述分析物可以包含在流體中。流體中存在的發光體將在暴露於激 發能量時發射電磁輻射。發射的輻射由檢測器收集。總的發射的輻射能量，即發光體發射的單獨的發光體的輻射能量之 和，與所述分析物的特性具有預定的關係，例如與所述分析物的分子的 濃度成比例。通過分析發射的輻射，可以定量地和/或定性地確定所述分 析物的特性。在下文中，將描述用於將分析物分子固定在每個孔徑的底部的方 法。向每個分析物分子提供發光體，例如螢光標記。通過激發該發光體 並且收集發射的輻射，可以提供對於分析物分子的檢測。該檢測可以是 定性的和/或定量的。配體或捕獲分子可以設置或固定在孔徑的特定部分，所述配體在被 所述分析物的目標分子接觸時形成發光體。發光體的這樣的形成可以以不同的方式發生，例如S. Weiss的i侖文"Fluorescence spectroscopy of single biomolecules" ， Science, Vol. 283， pp 1676-1683中所描述的， 該文獻的技術內容通過引用合併於此。所述配體可以使發光體固定不 動，使得它們在激發時從固定的位置發射輻射。所述配體可以固定在溝槽內，所述溝槽設置在襯底中與孔徑底部相 鄰的位置。可以以不同的方式激發所述發光體以便發射輻射，例如通過電能或7化學能來激發。發射的輻射可以通過不同的物理過程發生，例如發光、磷光、螢光、拉曼(Raman)散射光、超拉曼散射光或超瑞利散射光等 等。發射的輻射可以是諸如光之類的電磁輻射，包括紅外光。下面將考慮利用電磁輻射激發的發光體，所述電磁輻射特別是光， 包括紫外光、可見光和紅外光，其在相關介質中的波長是孔徑的第一平 面內維度的至少兩倍。有效波長是輻射在真空中的波長除以介質的折射 率。可以在生物傳感器的任一側檢測發光體發射的發光輻射。如果前側 存在分析物流體，那麼可以在襯底的後側檢測輻射。當光源從其後側朝 向襯底時，R偏振激發光將在孔徑內建立消逝場(evanescent field), 而T偏振激發光將在孔徑內建立傳播波。這種消逝場可以激發孔徑內存 在的與襯底側相鄰的發光體。該消逝場在孔徑內從孔徑的襯底側開始將 具有指數衰減。因此，靠近孔徑的襯底側存在的發光體將比孔徑的分析 物側處或之外存在的發光體更有效地被激發。非偏振的激發光或者具有 其他偏振狀態的激發光，例如圓偏振光、橢圓偏振光或者線性偏振光(其 是R和T偏振光的線性組合)，可以分解成R和T偏振光並且將導致 孔徑內消逝激發光和傳播激發光的組合。所產生的發光輻射通常將具有帶有R和T偏振分量二者的偏振狀 態。該發光的T偏振部分將基本上被孔徑透射，而R偏振分量將基本上 -故孔徑抑制。在許多應用中，大約1000的背景衰減將是足夠的，但是人們寧願 使用非偏振光源，例如發光二極體(LED),其通常不比雷射器昂貴並 且仍然可以提供需要的激發功率。圖1公開了依照第 一 實施例的系統。該系統包括例如 WO2007/072241中公開的類型的線柵生物傳感器。生物傳感器1包括若干設置在透明襯底2上的"導線"3。該襯底 可以由玻璃、矽石或者諸如丙烯酸玻璃、環氧樹脂、聚氯乙烯(PVC) 之類的其他類似材料製成。為了充分透明，該材料應當具有虛部小於 10~4的折射率。所述導線可以由諸如金、鋁、銀、鉻之類的金屬製成， 其經過腐蝕或電鍍以便獲得希望的結構，即多個孔徑4。這樣的導線和 線柵的形成在本領域中是已知的，參見例如WO2006/136991。多個孔徑4在導線3之間形成。孔徑在第一平面內方向上具有子衍射極限維度。該第一平面內維度小於激發輻射的有效波長的一半。如果孔徑中存在水(n=1.3)並且激發輻射在真空中具有633nm的波長，那 麼有效波長將是487nm並且孔徑的第一平面內維度小於該有效波長的 一半(243nm)。該第 一平面內維度可以小於有效波長的0.25倍或者 121nm。該第一平面內維度可以小於有效波長的0.2倍或者97nm。該第 一平面內維度可以小於有效波長的0.15倍或者73nm。孔徑的第二平面 內維度大於有效波長的一半，例如有效波長的至少0.5倍或者至少 243nm。該第二平面內維度可以為有效波長的10-100倍或者4.9-49pm。 該第二平面內維度可以為有效波長的100-1000倍或者49-490|um。該第 二平面內維度可以為有效波長的至少1000倍或者至少490|tim。可以在生物傳感器的孔徑中引入分析物流體5。該分析物可以包括 目標分子7,所述目標分子設有能夠在激發時發射電磁輻射的發光體或 焚光團8的標記。襯底2可以設有捕獲分子或配體6,所述捕獲分子或配體表現出和 目標分子7的親和性並且在孔徑的底部或襯底側固定在所述襯底2的表 面上。當目標分子7充分靠近配體6時，該目標分子被配體捕獲並且形 成包含配體6、目標分子7和螢光團8的聚合體9。所述目標分子和附 接於其上的標記或螢光團變成固定在靠近孔徑4的襯底側的位置處。生物傳感器1暴露於來自外部輻射源的激發輻射10,該激發輻射包 括例如大約700nm的波長的光。也可以使用其他波長的輻射，例如微波、 紅外光、近紅外(NIR)光、可見光、紫外光、X射線等等。在圓偏振光的情況下，所述激發輻射可以分解成(大約)50°/。的T 偏振輻射和(大約)50%的R偏振輻射。結果，(大約)50%的激發輻 射基本上被透射並且另外(大約)50%的激發輻射在孔徑內產生消逝場， 該消逝場呈指數衰減並且基本上不被透射。因此，遠離線柵的樣本小平 面(facet)的位置的激發光的充分抑制要求光基本上是R偏振的。所述生物傳感器可以工作於反射模式。該生物傳感器暴露於朝向孔 徑的襯底端的激發輻射10。鄰近襯底側固定的包含螢光團8的聚合體9將吸收激發能量並且在 所有方向發射螢光輻射，取決於躍遷偶極矩的方向，螢光在某些方向更 顯著或更不顯著，如箭頭lla和llb所示。發射的輻射的一部分lla朝 向設置在襯底2之下的檢測器12,而另一部分llb朝向孔徑的分析物側。9即使當使用了適當偏振的激發光時，激發光的一小部分ri (對於如 上所述的典型孔徑，透射的R偏振激發光是入射的R偏振激發光10的 1/1000)仍然被孔徑透射。該透射的部分ri可以被流體5中存在的、孔徑 的分析物側的螢光團8吸收並且激發這些螢光團發射輻射，如箭頭14a 和14b所示。發射的輻射通常具有T偏振分量和R偏振分量。所述流體 可以包含設有螢光團8的自由目標分子7以及自由螢光團8。所述輻射 的箭頭14a所示的部分將穿過孔徑，與R偏振分量形成對照的是，該輻 射的T偏振的部分將被孔徑透射並且？I起不希望的背景輻射。如果在流體5中孔徑的分析物側存在未與配體6結合的大量外部熒 光團8,那麼這種背景輻射將是大的。這樣的外部螢光團可以通過沖洗 來減少，但是沖洗不可以在例如實時測量期間發生。應當指出的是，通常，來自流體5中分析物側存在的螢光團並且穿 過襯底側的孔徑的輻射14a的最大部分是T偏振光。穿過孔徑的輻射14a 的一小部分(其大約為0.5*")為R偏振光。偏振濾波器33設置在檢測器12之前。該偏振濾波器對於T偏振光 具有高的抑制，其等於或優於孔徑的抑制1/t),例如超過10000。因此， 來自流體6中存在的螢光團的輻射14a的大部分將被濾波器33阻擋。 因此，取決於濾波器33的抑制，背景輻射將按照0.5^與ri之間的因子 減少，這是相當大的減少。有用的輻射或者待檢測的輻射lla也會被減 少，但是只按照小的因子減少。因此，藉助於濾波器33獲得了 0.5/"與 1 /r|之間的信號-背景比的改善。濾波器33可以具有至少與所述線柵衰減因子ri相同的衰減因子，但 是可以具有還要更大的超過大約10ri的衰減因子。這樣的偏振濾波器可 在商業上獲得，例如具有典型的衰減因子100000的格蘭雷射 (Glan-laser)偏振器。偏振濾波器33可以是與生物傳感器1類似的線柵，在該情況下， 偏振濾波器33具有與所述線柵相同的抑制ri。在這種情況下，抑制將僅 僅為理論上最大的可獲得改進的50%。背景輻射的進一步減少可以通過使用R偏振激發輻射來獲得。在這 種情況下，激發輻射將在穿過孔徑時按照所述衰減因子ri衰減，這意味 著到達檢測器12的背景輻射將按照因子0.5*t)a2到"a2來減少，這取決 於濾波器33的衰減因子，即在上面所示的情況下按照因子500000來減少。相同的偏振濾波器33可以用於激發輻射以及用於阻擋背景輻射到 達檢測器，如圖1中的虛線33a所示。從襯底2和線柵反射的激發輻射也將作為背景輻射到達檢測器。這 種激發背景輻射可以通過不同的措施來減少，例如藉助於僅讓螢光發射 的輻射通過的濾波器來減少。也可以使激發輻射以 一 定角度朝向所述生 物傳感器，使得反射的輻射不到達檢測器。在這種情況下，朝向檢測器 的散射的激發輻射可以由透射螢光輻射並且阻擋激發輻射的波長濾波 器37去除。圖2公開了一個實施例，其包括設有諸如鋁、金、銀、鉻之類的金 屬的線柵3的玻璃襯底2。所述線柵包括狹槽形式的孔徑，所述狹槽具 有小於衍射極限寬度270nm的第一平面內維度(寬度)，例如70nm。 所述狹槽具有大於衍射極限寬度的第二平面內維度(長度)，例如lmm。 具有螢光團20的目標分子固定/結合在孔徑的村底端，並且另一螢光團 21存在於流體5中且存在於孔徑的分析物端。箭頭10b所示的激發輻射，例如在真空中具有大約700nm的波長的 光，從源導向二向色鏡31。從二向色鏡31開始，激發輻射穿過所述偏 振濾波器33到達用於將經過偏振的激發輻射10b聚焦到生物傳感器表 面的透鏡32。激發輻射影響螢光團發射輻射。來自孔徑的襯底側存在的螢光團20 的發射的輻射20a將穿過透鏡32並且穿過偏振濾波器33,從而僅讓R 偏振輻射20b通過。通過的輻射20b將由二向色鏡31反射到透鏡34和 檢測器22。孔徑的襯底側的R偏振激發輻射10b在孔徑內形成具有指數衰減的 消逝場。該激發輻射將按照所述衰減因子ri衰減，並且只有一小部分激 發輻射將到達孔徑的分析物側的螢光團21。螢光團21將發射輻射21a, 該輻射將穿過孔徑並且到達透鏡32和偏振濾波器33。來自螢光團21的 輻射的T偏振分量21b將穿過孔徑，但是將被偏振濾波器33阻擋。來 自螢光團21的輻射的R偏振分量在穿過孔徑時將按照所述衰減因子ri 衰減並且將穿過透鏡32、偏振濾波器33並由二向色鏡31導向透鏡34 和檢測器22。因此，與沒有偏振濾波器33的情形相比，來自螢光團21 的背景輻射將按照因子riA2衰減。可以在裝配生物傳感器時通過測量孔徑的分析物側的激發輻射的水平來將偏振濾波器33與線柵對準。當這種方式測量的激發輻射水平 最小時，偏振濾波器33與線柵對準，這意味著偏振濾波器僅讓具有與 線柵垂直的偏振的輻射通過。通過旋轉偏振濾波器，可以使得背景的減少是可變化的。這提高了 靈活性，因為可以旋轉外部偏振濾波器的取向，其允許不僅抑制背景而 且測量背景並且確定結合的螢光團的偏振狀態。圖3公開了另一個實施例，其中偏振濾波器24僅被螢光團發射的 輻射穿過。在這種情況下，偏振濾波器24不必對於激發輻射透明，其 對於具有大的斯託克斯位移(Stokes shift)(例如大於100nm)的螢光 團可能是有意義的。激發輻射可以具有圓偏振。可替換地，激發可以是 線性偏振輻射，在這種情況下，偏振應當如上所示地對準。圖4公開了另外的實施例，其中圖3的實施例的偏振濾波器24被 偏振分束器35代替。偏振分束器35將R偏振輻射20b傳送到透鏡34 和檢測器22,同時偏振分束器35將T偏振輻射20c和21b導向第二透 鏡36和第二檢測器23。因此，可以估計背景信號。圖5示出了生物傳感器1的另一個實施例，該生物傳感器暴露於來 自外部輻射源的激發輻射10,所述激發輻射包括例如紫外光、可見光或 紅外光。輻射源包括在檢測設備30中，該檢測設備與上面限定的生物 傳感器1是分開的。在該實施例中，4吏用了非偏:派光源，例如一個或多個LED。與雷射 光源相比，這種光源可以發射更大的激發輻射功率並且便宜得多。光源單元40包括一個或多個發射大約630nm波長的輻射的LED 41、透鏡42以及用於通過激發光並且用於去除與螢光標記的發射帶和 發射濾波器54的通帶重疊的光的通帶濾波器43。因此，該濾波器可以 具有通常為20-30nm寬的通帶並且透射與螢光標記的吸收帶或激髮帶重 疊的光10。這些LED的適當通帶波長範圍的實例是620-650nm;適當 的通帶濾波器是可從Omega Optical公司獲得的3RD Millenium 620-650 濾波器。光從襯底側以一定角度被導向生物傳感器，並且光部分地被線柵反 射，如光束15所示。因此，基本上沒有激發光到達傳感器71。只有一 小部分散射的激發光被導向傳感器71,如虛線16所示。12成像功能框50與生物傳感器基本上成直角地設置在生物傳感器的 後側。該成像功能框50包括用於經由偏振器53將發射輻射17導向檢 測器71的第一透鏡51和第二透鏡52以及一個或多個發射濾波器54, 所述發射濾波器通過發射輻射17並且阻擋激發輻射16 (如果有的話)。 對於諸如具有頻語寬度大約為50nm、分別以700nm的波長和650nm的 波長為中心的發射頻譜的atto-680染料或氟石633染料之類的螢光標記 而言，發射濾波器54的適當的透射波長具有660nm或者更大的最小透 射波長，例如可從Omega Optical公司獲得的695AF55 Emitter XF3076 濾波器，其具有665nm的最小透射波長。檢測器71可以是照相機，包括CCD或CMOS檢測器。另外的可替 換方案在下面給出。在非偏振光的情況下，激發輻射可以分解成T偏振輻射和R偏振輻 射。結果，大約一半的激發輻射基本上透過線柵，另一半激發輻射在孔 徑內產生呈指數衰減的消逝場並且基本上不被透射。只有一小部分R偏 振輻射將穿過孔徑。因此，線柵基本上作為偏振濾波器而工作。通過線柵的輻射與撞擊線柵的輻射之比稱為消光比，並且對於典型 的線柵而言對於R偏振輻射通常約為0.001。所述輻射將激發螢光標記發射螢光輻射。對於螢光團集合而言，所 述標記可以發射大約75%的與激發輻射偏振相同的偏振。孔徑中位於孔徑的襯底端鄰近的焚光標記61由具有T偏振和R偏 振的激發輻射激發，其中對於非偏振激發光而言T通常近似等於R。總 的激發輻射為T+E，其導致來自標記的螢光發射。該發射將沿所有方向 並且假設50%將導向檢測器。孔徑外位於生物傳感器的前側或樣本側鄰近的螢光標記62將由幾 乎無衰減地通過線柵的激發光的T分量激發。此外，激發光的R分量將 按照消光因子n衰減。因此，T分量和R分量將導致發射輻射。該發射 將沿所有方向並且假設50%將朝著檢測器重新進入孔徑。然而，R分量 將按照消光因子n衰減。最後，偏振濾波器將按照因子N減少T分量。 偏振濾波器之後的檢測的來自標記61和62的螢光之比為(N + 1) / [(N*3/4 + n*l/4) + n*(n*3/4+N*l/4)] 如果假設N=n,那麼該比值將為l/n，其證明本發明的第一實施例導致 與線柵的消光比類似的背景抑制。如果N n,那麼所述比值將大約為4/n。線柵的典型消光比為n=0.001。偏振濾波器53可以具有至少與所述線柵消光因子n相同的消光因 子N，但是可以具有還要更小的小於大約0.1*n的消光因子。這樣的偏 振濾波器在商業上可獲得，例如具有典型的消光因子10A-5的格蘭雷射 偏振器。偏振濾波器53可以是與線柵1類似的線柵，在這種情況下，偏振 濾波器53具有與該線柵相同的消光因子n。從襯底2和線柵散射的激發輻射也將作為背景輻射到達檢測器。這 種激發背景輻射由發射濾波器54減少，所述發射濾波器衰減波長短於 發射波長的光並且因而基本上阻擋了激發光。依照圖5的實施例工作於反射模式，其中光源和檢測器都設置在生 物傳感器的後側並且待檢測的流體在襯底上的導線的相對側。光以大於 第一透鏡51的數值孔徑的角度被導向襯底以便以不同於朝向檢測器的 另 一方向反射。圖6公開了另一實施例，線柵具有與第一實施例類似的孔徑，工作 於透射模式，其中光源設置在生物傳感器的前側並且檢測器設置在生物 傳感器的後側。操作與依照圖5的實施例類似。LED 41發射的光由透鏡42聚焦並且在通過通帶濾波器43之後照射 柵格的某個孔徑或多個孔徑。具有T偏振的激發光將基本上無衰減地通 過孔徑，而具有R偏振的激發光將基本上被阻擋。穿過孔徑的激發光將基本上是T偏振激發光，其基本上被偏振濾波 器53阻擋。任何仍然穿過偏振濾波器53並且按照消光比N衰減的T偏 振激發光以及任何仍然穿過線柵並且按照消光比n衰減的R偏振激發光 在到達檢測器71之前將被通帶濾波器54阻擋，該通帶濾波器可以包括 若干級聯的濾波器。位於孔徑的襯底端的焚光標記61將基本上僅由激發光的T分量激 發，這意味著它將發射圖5中的第一實施例的發射輻射的大約一半。孔徑外位於孔徑的樣本端鄰近背景標記62將發出發射輻射。T分量 將通過並且R分量將按照消光因子n減少。因此，到達檢測器的襯底端標記61和樣本端標記62的發射之比將為(N*3/4+l/4+n*3/4+N*n*l/4) / (N+n)如果N二n並且rK〈l(n的典型值為0.001 ),那麼該比值將大約為l/(8*n)。 如果11<<1並且N"^cn(換言之，偏振器53具有遠小於線柵的消光比)， 那麼該比值將大約為l/(4*n)。在另一個實施例中，激發輻射基本上與襯底平行地被導向線柵，如 圖7所示。二向色鏡91設置在例如LED光的光路中並且將光重定向成 垂直於襯底。該二向色鏡被設計成反射波長為620-650nm的激發光並且 通過波長大於670nm的發射光。因此，可以如圖7所示省去發射濾波器 54,但是如果二向色鏡仍然通過一小部分激發光，那麼可以包括發射濾 波器54。可以在裝配生物傳感器時例如通過從樣本端(即從上面經由流體) 照射線柵並且最小化檢測器71上的功率來將偏振濾波器53與線柵對 準。當這種方式測量的功率最小時，偏振濾波器53與線柵對準，即設 置成垂直於線柵，這意味著該偏振濾波器僅通過具有與線柵的透射平面 垂直的R偏振的輻射。通過旋轉偏振濾波器，可以使得背景的減少是可變化的。這提高了 靈活性，因為可以旋轉外部偏振濾波器的取向，其允許不僅抑制背景而 且測量背景並且確定結合的螢光團的偏振狀態。圖8公開了另外的實施例，其中與圖5的實施例相比，偏振濾波器 93設置在另一個位置，即設置在成像功能框50與襯底2之間。此外， 偏振濾波器93設置在光單元40與襯底之間，使得來自LED 41的光在 到達襯底之前穿過該偏振濾波器93。因此，從LED到襯底的激發光以 及來自螢光標記的發射光穿過相同的偏振濾波器93。該偏振濾波器設置 在這樣的位置，使得非偏振的激發光穿過偏振濾波器93,所述偏振濾波 器93通過R偏振輻射但是按照因子N衰減T偏振輻射，所述因子N可 以是10~3到10A-6。位於孔徑的襯底端的螢光標記61以及位於孔徑的 樣本端的螢光標記62將發出發射輻射。當向後穿過孔徑時，R分量將 進一步按照因子n衰減，並且當穿過偏振濾波器時，T分量將按照因子 N衰減。偏振濾波器之後來自標記61和標記62的發射輻射之比為(3/4+N*l/4) + (N*N*3/4+N*l/4) /(n*n*3/4+N*n*l/4) + (N*N*3/4+n*N*l/4) 如果N二n,那麼該比值將為3/(8*n*n) 如果lsK〈n,那麼該比值將大約為l/(n*n)。偏振濾波器93被設置成偏振方向垂直於線柵的方向。如果偏振濾 波器93是線柵，那麼該濾波器的柵格方向應當垂直於所述線柵的柵格 方向。如圖9所示，圖7的實施例的偏振濾波器53可以被偏振分束器92 代替。該偏振分束器92將R偏振輻射18傳送到檢測器71,同時該偏振 分束器92將T偏振輻射19導向第二檢測器94。因此，可以測量背景信 號。偏振分束器92也可以在依照圖1和圖2的實施例中代替偏振濾波 器53。圖10示出了與圖7或圖9類似的另外的實施例，其中偏振濾波器 設置在與圖8的實施例相同的位置，即靠近襯底。因此，來自非偏振的 光源41的激發光被導向二向色鏡91並且經由偏振濾波器93反射到襯 底，所述偏振濾波器93基本上只通過R偏振輻射。該激發輻射導致來 自螢光團標記61的螢光發射輻射，其穿過偏振濾波器93、 二向色鏡91 到達檢測器71,所述激發輻射還導致來自螢光團標記62的螢光發射輻 射，其穿過孔徑、偏振濾波器93、 二向色鏡91到達檢測器71。來自熒 光標記61和62的發射輻射之比的計算與圖8的實施例相同。在上述實施例中，可以使用具有簡單而廉價的構造的線柵生物傳感 器，這意味著所述線柵可以是一次性的。偏振濾波器設置在生物傳感器之外並且可以多次使用。偏振濾波器 被設置成不與待檢查的分析物接觸。偏振濾波器總是設置在透明襯底與 傳感器之間。因此，可以使用功能更多的偏振濾波器，導致非常大的背 景輻射衰減，而基本上不增加每次分析的總成本。光源單元40和成像功能框50的不同元件可以以不同於以上所示的 其他順序設置。因此，激發輻射通帶濾波器43可以設置在光源41與透 鏡42之間。在圖7的實施例中，二向色鏡可以設置成實現通帶濾波器 43的操作，該通帶濾波器變得多餘並且可以省略。在成像功能框50中， 元件的順序可以不同。例如，偏振濾波器可以設置在襯底與檢測器71 之間的任何位置。依照圖5的實施例用於具有以下特性的測試環境中為了展示背景抑制，已經通過在線柵上噴濺棋盤模式的Si02間隔 材料、接著在與孔徑4重疊且不被間隔材料覆蓋的透明襯底2部分上固 定用氟石633染料標記的蛋白質來製造具有蜂巢模式的被標記蛋白質的樣本。在製造的樣本之上附接了 0.5mm厚的雜化室，這些雜化室填充了 非常高濃度(例如4.5微摩爾)的染料溶液，例如可以從Atto-TecGmbH 獲得的atto-680染料。這些樣本的特徵在於與圖l的設置類似的設置， 使用4個光譜濾波的紅色LED來將激發波長限制在620-650nm之間。 通過旋轉偏振器的透射軸，有可能將檢測體積從基本上消逝場或近場切 換到基本上整個雜化室。圖11示出了測量的焚光圖像在左邊，對應與線柵的透射軸平行 的偏振器的測量的螢光圖像，在右邊，則對應與線柵的透射軸垂直的偏 振器的測量的螢光圖像。檢測體積限於基本上僅僅孔徑的襯底端的被標 記蛋白質以及高度僅為20-30nm的染料溶液的小消逝體積。左圖的積分 時間約為右圖的1/500。由圖ll顯然可知，線柵上面的螢光流體產生的 背景可以有效地被抑制。左圖的積分時間大約小500倍這一事實清楚地 證明，抑制比信號大得多的背景螢光是可能的。此外，在依照圖5的實施例中，使用了線柵的暗場照射，其中入射 光的入射角大於與用於在檢測器上成像的集光透鏡的數值孔徑相應的 角度。通過這種方式，鏡面反射的光沒有成像到檢測器上。當前的實施例具有 一 個或多個以下優點不再需要激發源的偏振軸與線柵的透射軸之間的嚴格對準。在先前 的實施例中，源的偏振軸必須調整成與線柵的透射軸垂直以便在導線之 間的空間中產生完全的消逝場。雷射器通常比非偏振源更昂貴。對於諸如螢光之類的應用而言，標 記分子的吸收帶非常寬，這允許使用LED。 LED是特別吸引人的，因為 它們在低得多的成本下提供與雷射器類似的功率水平。此外，可以預期 的是，將來LED的光功率將顯著增大。典型雷射器的偏振純度為100:1，而線柵生物傳感器概念中使用的 線柵的典型消光優於1000。這意味著每個雷射器需要其消光等於或優於 線柵的消光的專用偏振器。雷射器的長相干長度意味著散斑並且這限制了照射的均勻性。在當 前的實施例中，使用了具有低相干長度的光源，例如帶寬大於lnm(請 回顧該部分)。這些實施例可以用在不同的應用中，例如高背景環境中的測量所需 的用於測量的具有高表面特異性的光學生物傳感器，所述高背景環境例如具有高復用數的DNA雜化試驗。這些實施例可以用作顯微鏡，其中傳感器71實際上由用戶的眼睛代替。儘管上面已經參照特定實施例描述了本發明，但是其並不意在限於 本文所述的特定形式。確切地說，本發明僅由所附權利要求所限制，並 且不同於以上特定實施例的其他實施例同樣可能處於這些所附權利要 求的範圍之內。在權利要求中，措詞"包括/包含"並沒有排除存在其他的元件或步 驟。此外，儘管被單獨地列出，但是多個裝置、元件或方法步驟可以由 例如單個單元或處理器來實現。另外，儘管單獨的特徵可能包含在不同 的權利要求中，但是這些特徵可能有利地加以組合，並且包含在不同的 權利要求中並不意味著特徵的組合不是可行的和/或有利的。此外，單數 引用並沒有排除複數。措詞"一"、"第一"、"第二"等等並沒有排 除複數。權利要求中的附圖標記僅僅作為澄清的實例而被提供，絕不應 當被視為限制了權利要求的範圍。
權利要求
1.一種用於監視分析物流體中存在的發光體所發射的輻射的設備，包括生物傳感器，其具有至少一個設置在透明材料(2)襯底上並且形成用於填充所述分析物流體的至少一個孔徑(4)的非透明材料(3)，所述孔徑具有小於該生物傳感器中的有效輻射波長的一半的第一平面內維度以及大於該生物傳感器的有效輻射波長的一半的第二平面內維度，並且具有透射平面；激發源(10，41)，其用於激發所述生物傳感器的分析物流體中存在的發光體；檢測器(22，71)，其用於檢測激發時所述發光體發射的輻射；以及偏振濾波器(33，53)，其設置在所述生物傳感器與檢測器之間。
2. 依照權利要求l的設備，其中所述檢測器(22, 71)設置在所述 生物傳感器的襯底側。
3. 依照權利要求1或2的設備，其中所述激發源是發射偏振光的光源 (10),該偏振光例如具有橢圓偏振例如圓偏振或線性偏振的偏振光，或者所述激發源是發射非偏振光的光源(41)。
4. 依照權利要求l、 2或3的設備，其中所述偏振濾波器(33, 53 ) 被設置用於充分地衰減其電場與孔徑的透射平面平行的輻射。
5. 依照前面的權利要求中任何一項的設備，其中所述偏振濾波器 (33, 53 )是可旋轉的。
6. 依照權利要求3、 4或5的設備，其中所述光源(41)包括帶通濾 波器(43 ),該《應的波長的輻射。
7. 依照權利要求6的設備，其中波長通帶濾波器(54)設置在檢測通過並且阻擋所述帶通濾波^！ (43)通過的輻射:'、、'''
8. 依照前面的權利要求中任何一項的設備，其中所述偏振濾波器包 括偏振分束器(92),該偏振分束器向所述檢測器(71)傳送具有與孔 徑的透射平面垂直的偏振平面的輻射並且向第二檢測器(94)反射或阻擋具有與孔徑的透射平面平行的偏振的輻射，或者其中所述偏振濾波器 包括二向色鏡(91)，該二向色鏡被設置成將所述激發輻射導向所述生 物傳感器並且將發射輻射傳送到所述檢測器。
9. 依照權利要求3-8中任何一項的設備，其中來自所述光源(10, 41 )的輻射被設置成在照射所述生物傳感器之前通過所述偏振濾波器(33, 93 )。
10. 依照權利要求3-9中任何一項的設備，其中所述光源(10, 41) 設置在所述生物傳感器的襯底側，並且在反射模式下進行檢測，或者所 述光源(10, 41 )設置在所述生物傳感器的分析物流體側，並且在透射模式下進行檢測。
11. 依照權利要求3-10中任何一項的設備，其中所述光源發射具有 低相干長度的光，例如具有大於大約lnm的帶寬的光。
12. 依照前面的權利要求中任何一項的設備，其中該設備包括分析團，其包含在所述孔徑中。、 " 〃
13. 依照權利要求12的設備，其中捕獲分子設置在孔徑的襯底端部 分的鄰近，所述捕獲分子用來與所述目標分子和發光體形成聚合體。
14. 依照權利要求12或13的設備，其中所述分析物流體設置在包 括所述孔徑的襯底的一側上並且所述檢測器和偏振濾波器設置在襯底 的另一側上。
全文摘要
用於監視線柵生物傳感器的分析物流體中存在的發光體所發射的輻射的設備。該監視設備包括非偏振光源(41)，該光源用於照射線柵生物傳感器以便激發設置在所述生物傳感器的分析物流體中的螢光標記。檢測器(71)檢測激發後所述標記發射的輻射。偏振濾波器(53)設置在透明襯底與檢測器之間，以便抑制來自分析物流體中位於線柵中的孔徑之外的標記的背景發射輻射。
文檔編號G01N21/64GK101606054SQ200880004780
公開日2009年12月16日 申請日期2008年2月12日 優先權日2007年2月12日
發明者D·J·W·克倫德, H·R·斯塔珀特, M·M·J·W·范赫彭 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司