一種金黃色葡萄球菌腸毒素d的免疫膠體金快速檢測試紙條及其製備方法
2023-12-10 05:11:36 2
一種金黃色葡萄球菌腸毒素d的免疫膠體金快速檢測試紙條及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條，以及該免疫膠體金試紙條的製備方法，屬於免疫檢測【技術領域】。該試紙條由樣品墊、塗覆金標標記抗SED抗體5F2（CGMCCNo.7212）的金標墊，在檢測線、質控線分別包被有抗SED抗體10F1（CGMCCNo.7213）和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜構成，依次按樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊粘附在PVC底板上。該試紙條操作簡便、快速、準確，檢測全過程只需5分鐘，不受環境條件的幹擾，特異性好，檢測靈敏度高，最低檢測限為0.25ng/mL。本發明適用於海關、企業、醫院、檢驗檢疫單位等，可實現食品或臨床樣本中金黃色葡萄球菌腸毒素D的快速檢測。
【專利說明】一種金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條，以及該免疫膠體金試紙條的製備方法，可以實現金黃色葡萄球菌腸毒素D的快速檢測診斷，適用於大量樣品的現場檢測、食物中毒的快速檢測與應急處理，屬於免疫檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種常見的食源性致病菌,雖然近年來不斷有新型的金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxin, SE)被發現,但腸毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE引起的中毒佔金黃色葡萄球菌食物中毒的95%，葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒以A型居多，D型次之。從生牛乳、生肉及乳酪中分離的金黃色葡萄球菌以產生D型腸毒素為主。
[0003]在食品加工過程中，經過熱處理可以殺滅金黃色葡萄球菌，然而一旦菌體產生外分泌的腸毒素，那麼存在於食物中的腸毒素非常穩定，100°c 30min不被破壞，攝入人體後可以抵抗腸胃液中蛋白酶的分解，並引起人體的嘔吐、腹瀉等症狀。2011年我國公布速凍面米製品新國標GB19295—2011，金黃色葡萄球菌由原來的不得檢出變為限量檢出，因此為了杜絕食品中金黃色葡萄球菌活菌數合格而腸毒素超標的情況，腸毒素的快速檢測對於保障食品安全具有更加重要的意義。
[0004]近年來，ELISA憑藉其靈敏、快速、特異性好、易於推廣的特點越來越多地用於腸毒素的檢測，但膠體金試紙條具有操作簡單、穩定性高、不需要藉助專門儀器、適合現場快速檢測的優點，因此對於大量樣品的現場檢測、食物中毒的快速檢測具有重要的意義。
【發明內容】
[0005]本發明目的在於提供一種檢測金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條，操作簡單，快速方便，靈敏度高，穩定性好，成本低廉。
[0006]本發明另一個目的在於提供一種免疫膠體金試紙條的製備方法，包括抗SED特異性抗體的製備，SED雙抗體檢測抗體的篩選，SED免疫膠體金檢測試紙條的製備。該試紙條操作簡便、快速、準確，檢測全過程只需5分鐘，不受環境條件的幹擾，特異性好，檢測靈敏度聞，最低檢測限為0.25ng/mL0本發明適用於海關、企業、醫院、檢驗檢疫單位等，可實現食品或臨床樣本中金黃色葡萄球菌腸毒素D的快速檢測。
[0007]本發明的技術方案，一種金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條，包括PVC底板，在PVC底板兩端分別設有樣品墊和吸水墊；
PVC底板中部設置有硝酸纖維素膜檢測層，在硝酸纖維素膜檢測層與樣品墊之間設置有金標墊；所述金標墊一端與樣品墊相連接疊放，另一端疊放於硝酸纖維素膜檢測層上；
所述硝酸纖維素膜檢測層上依次設置有檢測線和質控線。
[0008]所述金標墊包被有金標標記的抗SED抗體5F2 (CGMCC N0.7212)。[0009]所述檢測線上包被有抗SED抗體IOFl (CGMCC N0.7213)。
[0010]所述質控線上包被有羊抗鼠IgG。
[0011]所述金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條的製備方法，金黃色葡萄球菌腸毒素D縮寫為SED，步驟如下:
(I)抗SED特異性單克隆抗體的製備:
以北京軍事醫學科學院提供的重組表達的SED為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，經免疫、細胞融合、篩選，共篩選到10個單克隆抗體細胞株；
免疫程序如下:第一周進行首免，IOyg/只，弗氏完全佐劑乳化後皮下多點注射；第四周進行二免，8 μ g/只，弗氏不完全佐劑乳化後皮下多點注射；第六周進行三免，6 μ g/只，弗氏不完全佐劑乳化後皮下多點注射；第七周尾部採血測效價，選擇效價最高的小鼠;第八周進行衝刺免疫，4 μ g/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；衝刺免疫3天後眼眶採血後進行融合。篩選採用間接ELISA進行，共篩選到10個細胞株。
[0012](2)特異性SED雙抗體檢測抗體的篩選:
將步驟(1)純化後的10株單克隆抗體細胞株分別標記辣根過氧化物酶(HRP)，直接法鑑定標記成功後進行雙抗體夾心法配對，確定特異性免疫膠體金快速檢測試紙條所需抗SED抗體；其中5F2為金標抗體，IOFl為包被抗體；
(3)金黃色葡萄球菌腸毒素D免疫膠體金快速檢測試紙條的製備:
a、空白膠體金的製備:
採用檸檬酸鹽還原法製備膠體金顆粒，在錐形瓶中加入200mL去離子水和2mL質量濃度為1%的氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4mL質量濃度為1%的檸檬酸鈉，繼續加熱15~20分鐘，至呈亮紅色，然後室溫中冷卻，4°C冷藏保存；
b、膠體金標記抗體的製備:
空白膠體金溶液用0.1M的K2CO3調節pH值至7.4，攪拌中滴加適量濃度步驟(2)製備的抗體，每毫升空白膠體金溶液加入30 μ g抗體5F2 (CGMCC N0.7212)，繼續攪拌30分鐘，離心，吸取上清液，用金標抗體保存液重旋；
C、金標墊的製備:
調試三維平面點膜噴金儀儀器，將標記好膠體金的抗SED抗體5F2 (CGMCC N0.7212)均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6μL/cm，37°C:烘乾過夜，封袋備用；d、包被膜的製備:
調試三維平面點膜噴金儀儀器，將稀釋好的抗SED抗體IOFl (CGMCC N0.7213)均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將稀釋好的羊抗鼠IgG均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質控線，噴液量為0.6μ L /cm, 37 °C烘乾過夜，封袋備用；
將PVC底板、硝酸纖維素膜檢測層、樣品墊、金標墊、檢測線、質控線和吸水墊組合，SP得產品金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條。
[0013]其適用於海關、企業、醫院、檢驗檢疫單位，可實現食品或臨床樣本中金黃色葡萄球菌腸毒素D的快速檢測,最低檢測限為0.25ng/mL。
[0014]本發明試紙條的工作原理:採用膠體金免疫層析技術，選用SED特異性抗體作為固相物，利用雙抗體夾心法原理檢測樣品中是否含有SED。當待檢樣品中含有SED時，抗原先和膠體金標記的抗SED抗體(5F2)結合，由於層析作用複合物沿包被膜向前移動，當遇到檢測線上的抗SED抗體(IOFl)時，形成抗體-抗原-金標抗體複合物，在檢測線上富集，形成紅色沉澱線。
[0015]本發明與現有技術相比具有如下優點:
1、檢測速度快，全過程只需要5分鐘即可，可以試驗大批量樣品的快速檢測；
2、靈敏度高，最低檢測限為0.25ng/mL ；
3、操作簡便，無需經過專業培訓，易於推廣；
4、不需要儀器，適合現場檢測；
5、過程簡單，直接上樣檢測，樣本量少。
[0016]生物材料樣品保藏:
1、一株單克隆細胞株，細胞株12號，株號為5F2，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，登記編號為CGMCC N0.7212，保藏曰期為2013年I月23日。
[0017]2、一株單克隆細胞株，細胞株13號，株號為10F1，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，登記編號為CGMCC N0.7213，保藏曰期為2013年I月23日。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1是本發明試紙條結構主視圖。
[0019]圖2是本發明試紙條結構俯視圖。
[0020]附圖標記說明:1、PVC底板；2、硝酸纖維素膜檢測層；3、樣品墊；4、金標墊；5、檢測線(T線)；6、質控線(C線)；7、吸水墊。
【具體實施方式】
[0021]實施例1
如圖1-2所示，一種金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條，包括PVC底板1，在PVC底板I兩端分別設有樣品墊3和吸水墊7 ；
PVC底板I中部設置有硝酸纖維素膜檢測層2，在硝酸纖維素膜檢測層2與樣品墊3之間設置有金標墊4 ;所述金標墊4 一端與樣品墊3相連接疊放,另一端疊放於硝酸纖維素膜檢測層2上；
所述硝酸纖維素膜檢測層2上依次設置有檢測線(T線)5和質控線(C線)6。
[0022]所述金標墊4包被有金標標記的抗SED抗體5F2。所述檢測線(T線)5上包被有抗SED抗體IOFl。所述質控線(C線)6上包被有羊抗鼠IgG。
[0023]實施例2
所述金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條的製備方法,金黃色葡萄球菌腸毒素D縮寫為SED，其步驟是:
(I)抗SED特異性單克隆抗體的製備:
以重組表達的SED (北京軍事醫學科學院)為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周進行首免，IOyg /只，弗氏完全佐劑乳化後皮下多點注射；第四周進行二免，8yg /只，弗氏不完全佐劑乳化後皮下多點注射；第六周進行三免，6yg /只，弗氏不完全佐劑乳化後皮下多點注射；第七周尾部採血測效價，選擇效價最高的小鼠；第八周進行衝刺免疫，4yg /只，生理鹽水溶解，腹腔注射；衝刺免疫3天後眼眶採血後進行融合。篩選採用間接ELISA進行，共篩選到10個細胞株。
[0024](2 )特異性SED雙抗體檢測抗體的篩選
將純化後的10株單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶(HRP)，直接法鑑定標記成功後進行雙抗體夾心法配對，確定特異性免疫膠體金快速檢測試紙條所需要抗SED抗體。其中5F2為金標抗體，IOFl為包被抗體。
[0025](3)金黃色葡萄球菌腸毒素D免疫膠體金快速檢測試紙條的製備:
a、空白膠體金的製備:
採用檸檬酸鹽還原法製備膠體金顆粒，在錐形瓶中加入200mL去離子水和2mL 1%氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4mL 1%檸檬酸鈉，繼續加熱15?20分鐘，至呈亮紅色，然後室溫中冷卻，4 °C冷藏保存；
b、膠體金標記抗體的製備:
空白膠體金溶液用0.1M K2CO3調節PH值至7.4，攪拌中滴加適量濃度抗體，每毫升膠體金加入30 μ g抗體5F2，繼續攪拌30分鐘，離心，吸取上清，用金標抗體保存液重旋；
C、金標墊的製備:
調試三維平面點膜噴金儀儀器(HM3055)，將標記好膠體金的抗SED抗體5F2均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6 μ L /cm, 37 °C烘乾過夜，封袋備用；d、包被膜的製備:
調試三維平面點膜噴金儀儀器(HM3055)，將稀釋好的抗SED抗體IOFl均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將稀釋好的羊抗鼠IgG均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質控線，噴液量為0.6 μ L/cm, 37 °C烘乾過夜，封袋備用。
[0026]將PVC底板1、硝酸纖維素膜檢測層2、樣品墊3、金標墊4、檢測線5、質控線6和吸水墊7組合，即得產品金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條。
[0027]本發明試紙條的工作原理:採用膠體金免疫層析技術，選用SED特異性抗體作為固相物，利用雙抗體夾心法原理檢測樣品中是否含有SED。當待檢樣品中含有SED時，抗原先和膠體金標記的抗SED抗體(5F2)結合，由於層析作用複合物沿包被膜向前移動，當遇到檢測線上的抗SED抗體(IOFl)時，形成抗體-抗原-金標抗體複合物，在檢測線上富集，形成紅色沉澱線。
[0028]檢測時如樣品為陰性，則試紙條只有質控線C線顯色；如果樣品為陽性，腸毒素含量值大於0.25ng/mL，則試紙條質控線C線、檢測線T線均顯色。如果試紙條C線不顯色，則說明試紙條質量出現問題。
【權利要求】
1.一種金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條，其特徵在於:包括PVC底板(I)，在PVC底板(I)兩端分別設有樣品墊(3 )和吸水墊(7 ); PVC底板(I)中部設置有硝酸纖維素膜檢測層(2)，在硝酸纖維素膜檢測層(2)與樣品墊(3)之間設置有金標墊(4);所述金標墊(4) 一端與樣品墊(3)相連接疊放，另一端疊放於硝酸纖維素膜檢測層(2)上； 所述硝酸纖維素膜檢測層(2)上依次設置有檢測線(5)和質控線(6)。
2.根據權利要求1所述金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條，其特徵在於:所述金標墊(4)包被有金標標記的抗SED抗體5F2。
3.根據權利要求1所述金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條，其特徵在於:所述檢測線(5)上包被有抗SED抗體IOFl。
4.根據權利要求1所述金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條，其特徵在於:所述質控線(6)上包被有羊抗鼠IgG。
5.權利要求1所述金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條的製備方法，金黃色葡萄球菌腸毒素D縮寫為SED，其特徵在於步驟如下: (1)抗SED特異性單克隆抗體的製備: 以北京軍事醫學科學院提供的重組表達的SED為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，經免疫、細胞融合、篩選，共篩選到10個單克隆抗體細胞株； (2)特異性SED雙抗體檢測抗體的篩選: 將步驟(1)純化後的10株單克隆抗體細胞株分別標記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑑定標記成功後進行雙抗體夾心法配對，確定特異性免疫膠體金快速檢測試紙條所需抗SED抗體；其中5F2為金標抗體，IOFl為包被抗體； (3)金黃色葡萄球菌腸毒素D免疫膠體金快速檢測試紙條的製備: a、空白膠體金的製備: 採用檸檬酸鹽還原法製備膠體金顆粒，在錐形瓶中加入200mL去離子水和2mL質量濃度為1%的氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4mL質量濃度為1%的檸檬酸鈉，繼續加熱15~20分鐘，至呈亮紅色，然後室溫中冷卻，4°C冷藏保存； b、膠體金標記抗體的製備: 空白膠體金溶液用0.1M的K2CO3調節pH值至7.4，攪拌中滴加適量濃度步驟(2)製備的抗體，每毫升空白膠體金溶液加入30 μ g抗體5F2，繼續攪拌30分鐘，離心，吸取上清液，用金標抗體保存液重旋； C、金標墊的製備: 調試三維平面點膜噴金儀儀器，將標記好膠體金的抗SED抗體5F2均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6 μ L/cm, 37 °C烘乾過夜，封袋備用； d、包被膜的製備: 調試三維平面點膜噴金儀儀器，將稀釋好的抗SED抗體IOFl均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將稀釋好的羊抗鼠IgG均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質控線，噴液量為0.6yL /cm, 37 °C烘乾過夜，封袋備用； 將PVC底板(I)、硝酸纖維素膜檢測層(2)、樣品墊(3)、金標墊(4)、檢測線(5)、質控線(6)和吸水墊(7)組合，即得產品金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條。
6.權利要求1所述金黃色葡萄球菌腸毒素D的免疫膠體金快速檢測試紙條的應用，其特徵在於:其適用於海關、企業、醫院、檢驗檢疫單位，可實現食品或臨床樣本中金黃色葡萄球菌腸毒素D的快速檢測,最低檢測限為0.25ng/mL。`
【文檔編號】G01N33/577GK103760354SQ201410051501
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月14日 優先權日:2014年2月14日
【發明者】徐麗廣, 胥傳來, 孔德昭, 匡華, 馬偉, 宋珊珊, 劉麗強 申請人:江南大學