酸性真菌蛋白酶的製作方法

2023-12-10 02:26:06

專利名稱：：酸性真菌蛋白酶的製作方法
技術領域：
：0002本發明涉及編碼被命名為NSP24家族蛋白酶、NSP25家族蛋白酶和PepA蛋白酶的酸性蛋白酶的多核苷酸；NSP24和NSP25家族蛋白酶多肽；包括所述蛋白酶的組合物以及它們的使用。
背景技術：
：0003蛋白酶是能夠切開肽鍵的酶。酸性蛋白酶(例如具有酸性最適pH的蛋白酶)是由大量不同的生物，包括哺乳動物和微生物產生的。例如，微生物酸性蛋白酶是由細菌菌株諸如芽孢桿菌屬某種(Bacillussp.)的菌株(JP01240184)和真菌菌株諸如根黴屬某種(Rhizopussp.)(EP72978)、Schytalidiumsp.(JP48091273)、Sulpholobussp.、熱原體屬某種(Thermoplasmasp.)(WO/9010072)以及麴黴屬某種(Aspergillussp.)(JP50121486和EP82395)的菌株產生的。0004Berka等(Gene(1990)96313)公開了編碼來自泡盛麴黴(Aspergillusawamori)的天冬氨酸蛋白酶麴黴胃蛋白酶(aspergillopepsin)A的基因。對編碼來自米麴黴(Aspergillusoryzae)的天冬氨酸蛋白酶麴黴胃蛋白酶(aspergillopepsin)O的基因的克隆由Berka等(Gene(1993)125195-198)加以描述。對編碼來自米麴黴的酸性蛋白酶(PepA)的基因的克隆由Gomi等(Biosci.Biotech.Biochem.(1993)57(7)1095-1100)加以描述。0005蛋白酶，具體而言是酸性蛋白酶，被廣泛地應用工業應用中，例如用於製備食品和飼料、用於皮革工業(例如使皮革脫毛)、用於生產蛋白質水解產物、以及用於生產醇類諸如乙醇生產、酒類生產與釀造。0006對於許多不同的應用，特別是在食品和飼料工業中，對蛋白酶仍然有著持續的需求。發明概述0007申請人已發現大量新型蛋白酶基因，其包括編碼NSP24蛋白酶(SEQIDNO2或SEQIDNO10)的新型nsp24基因；編碼NSP25蛋白酶(SEQIDNO9)的新型nsp25基因；和編碼新型PepA蛋白酶(SEQIDNO7)的新型pepA變體基因。0008因此，本發明的特徵是NSP24蛋白酶、NSP25蛋白酶或PepA蛋白酶以及它們的變體的重組的或者基本上純的製劑。0009在本發明的一些方面，蛋白酶是NSP24家族蛋白酶多肽，其包括與SEQIDNO2或SEQIDNO10中的胺基酸序列基本相同的胺基酸序列(下文圖6所示)。在一些實施方式中，NSP24家族蛋白酶多肽是由SEQIDNO8中的核酸編碼(下文圖5所示)，或者由具有與SEQIDNO8的核酸基本相同的核酸序列的核酸編碼。0010在本發明的其它方面，NSP24家族蛋白酶多肽與SEQIDNO10中的序列在胺基酸序列上具有多達10個殘基的差異。在一些實施方式中，NSP24家族蛋白酶多肽與SEQIDNO10中的序列在胺基酸序列上具有多達10％殘基的差異。在一些實施方式中，具有如此的差異，以至於NSP24家族蛋白酶多肽表現出NSP24蛋白酶的生物學活性，例如NSP24蛋白酶保留了天然存在的NSP24蛋白酶的生物學活性。0011在本發明進一步的方面，NSP24家族蛋白酶多肽包括此處所述的NSP24蛋白酶序列以及其它的N-末端和/或C-末端胺基酸序列。0012在本發明的其它方面，NSP24家族蛋白酶多肽包括來自SEQIDNO2或SEQIDNO10的胺基酸序列的全部或片段，在閱讀框中，其與其它胺基酸殘基融合，優選地與由基因組DNA5′至編碼來自SEQIDNO1或SEQIDNO8的序列的基因組DNA所編碼的殘基融合。0013仍在本發明的其它方面，NSP24家族蛋白酶是重組體融合蛋白，其具有第一NSP24家族蛋白酶部分和第二多肽部分，例如具有與NSP24家族蛋白酶不相關的胺基酸序列的第二多肽部分。該第二多肽部分可以是DNA結合結構域或者聚合酶活化結構域。本發明的多肽包括那些由於多基因的存在、選擇性轉錄事件、選擇性RNA剪接事件以及選擇性翻譯和翻譯後事件所產生的多肽。該多肽可以在系統例如培養的細胞中表達，該系統產生與表達的NSP24蛋白酶在天然細胞中表達時基本上相同的翻譯後修飾，或者可以在這樣的系統中表達，該系統導致當在天然細胞中表達時存在的翻譯後修飾的省略。0014仍在其它方面，本發明涉及酶組合物，其包括NSP24家族蛋白酶以及一種或多種其它組分，例如載體、稀釋劑或溶劑。所述其它組分可以是賦予該組合物體外用途、體內用途、藥物用途或獸醫用途的組分。在本方面的一些實施方式中，酶組合物將包括其它酶類。在優選的實施方式中，其它酶將會是葡糖澱粉酶、α澱粉酶或它們的組合。0015仍在進一步的方面，本發明提供了基本上純的核酸，其具有或包括編碼NSP24家族蛋白酶多肽的核苷酸序列，所述多肽包括與SEQIDNO2或SEQIDNO10的胺基酸序列具有至少80％序列同一性的胺基酸序列。0016在一些方面，NSP24家族蛋白酶核酸將包括轉錄調控序列，例如可操縱地連接於NSP24家族蛋白酶基因序列的轉錄啟動子或轉錄增強子序列的至少其中之一，例如以使NSP24家族蛋白酶基因序列適合作為表達載體使用。0017仍在其它方面，編碼本發明的NSP24蛋白酶多肽(例如SEQIDNO2)的核酸在嚴格條件下與核酸探針雜交，該探針對應於來自SEQIDNO8的至少12個連續的核苷酸，更優選地對應於來自SEQIDNO8的至少20個連續的核苷酸。0018本發明的另一方面提供了NSP24家族蛋白酶(例如NSP24)在各種工業設施方面的應用。例如，NSP24家族蛋白酶可以被用於農業廢料的酶促降解以生產醇類燃料和其它重要的工業化學品，用於生產動物或人類食品，或者作為去汙劑組合物的組分，用於皮革加工以及蛋白質基的纖維加工(諸如毛料或絲綢)，用於生物量應用，用於個人護理應用(皮膚、頭髮、口腔護理等)，用於藥物和保健護理應用以及用於生產適用於以上應用的新型肽。0019在進一步的方面，本發明涉及多核苷酸，其編碼具有SEQIDNO7的pepA變體蛋白酶L388M。在一些實施方式中，該多核苷酸具有SEQIDNO5的序列。0020仍在另一方面，本發明涉及NSP25家族蛋白酶。在一些實施方式中，NSP25家族蛋白酶將具有與SEQIDNO9至少85％的序列同一性。在其它實施方式中，NSP25家族蛋白酶將由與SEQIDNO4具有至少85％序列同一性的多核苷酸所編碼。仍在其它實施方式中，NSP25家族蛋白酶將是母體NSP25家族蛋白酶的生物學活性片段。0021圖1舉例說明了糖類的降解(DP+3)％w/v，使用了1)NSP24、2)可商業獲得的蛋白酶，GC106和3)DISTILLASE，其不包括蛋白酶(參見實施例5)。0022圖2描述了糖類的降解(DP2)％w/v，使用了NSP24、GC106和DISTILLASE。0023圖3舉例說明了葡萄糖的形成(DP1)，使用了NSP24、GC106和DISTILLASE。對於NSP24和GC106樣品，在40小時末剩餘的葡萄糖量為0.2％w/v以下，而在48小時末為0.1％w/v以下。相反，對於DISTILLASE，在48小時末以％w/v測量的葡萄糖量稍大於1.0％w/v。0024圖4舉例說明了NSP24、GC106和DISTILLASE的乙醇生產(％v/v)。通過使用兩種蛋白酶樣品產生乙醇的速率和量基本相同。相反，DISTILLASE產生較少的乙醇且速度較慢。0025圖5A-D舉例說明了由裡氏木黴(Trichodermalreesei)獲得的pTrex3g_NSP24cDNA克隆的核苷酸序列(SEQIDNO1)。NSP24基因序列加下劃線，推定的基因內含子序列用黑體加以標識。編碼該蛋白酶的核酸序列用SEQIDNO8的序列加以表示。0026圖6A-B舉例說明了來自裡氏木黴的NSP24的預測的胺基酸序列(407個胺基酸)(SEQIDNO2)(圖6A)，以及NSP24核苷酸序列，其帶有用粗體字母標識的推定內含子(圖6B)(SEQIDNO8)。在圖6A中，信號肽為粗體，前原序列(preprosequence)為粗體加下劃線，而成熟的NSP24蛋白以KYGAPIS...開始並用SEQIDNO10表示。0027圖7舉例說明了pTrex3g_NSP24載體以及圖5核苷酸序列上的限制性酶切位點的位置。0028圖8舉例說明了pepA蛋白酶的核酸序列(SEQIDNO3)。推定的內含子為粗體。0029圖9A-B舉例說明了編碼新型NSP25蛋白酶(399個胺基酸)(SEQIDNO9)的核酸序列(SEQIDNO4)。信號序列為粗體。0030圖10舉例說明了新型pepA蛋白酶變體(L388M)(SEQIDNO7)的核酸序列(SEQIDNO5)，其中圖中加下劃線的′A′是由圖8pepA中的′C′改變而成。0031圖11舉例說明了表達載體，pSL899_pepA。0032圖12A-E舉例說明了表達載體pSL899_pepA的核苷酸序列(SEQIDNO6)。XhoI切割位點用Λ表示，而XbaI位點用*表示。pepA的編碼序列以粗體表示。內含子被加下劃線。0033圖13舉例說明了由SEQIDNO5編碼的蛋白的PepA變體L388M的胺基酸序列(SEQIDNO7)。發明詳述0034現在本發明將僅僅通過參考的方式使用下列定義和實施例來加以詳細描述。本文中所參考的全部專利和出版物，包括在此類專利和出版物中公開的全部序列，被明確併入本文作為參考。0035除非另作說明，本發明的實踐將使用常規的細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因生物學、微生物學、重組DNA以及免疫學技術，其在本領域技術人員的能力範圍內。此類技術在文獻中有所描述。參見例如Sambrook、Fritsch和Maniatis編輯的MolecularCloningALaboratoryManual，第二版(ColdSpringHarborLaboratoryPress1989)；Ausubel等編輯的ShortProtocolsinMolecularBiology(5thEd.2002)；DNACloning，VolumesI和II(D.N.Glovered.，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullis等美國專利號4,683,195；NucleicAcidHybridization(B.D.HamesS.J.Higginseds.1984)；TranscriptionAndTranslation(B.D.HamesS.J.Higginseds.1984)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，APractical-GuideToMolecularCloning(1984)；論文，MethodsInEnzymology(AcademicPress，Inc.，N.Y.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.Miller和M.P.Caloseds.，1987，ColdSpringHarborLaboratory)；MethodsInEnzymology，Vols.154和155(Wu等eds.)，ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker，eds.，AcademicPress，London，1987)；HandbookOfExperimentalImmunology，VolumesI-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)；ManipulatingtheMouseEmbryo，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1986)。同樣，有關蛋白酶的製備、表達、分離和使用的方法的信息可以通過閱讀美國專利號6,768,001而獲得，該專利在此以其整體併入本文作為參考。0036通過下列詳細說明並通過權利要求，本發明的其它特徵和優勢將是顯而易見的。儘管與本文所述相似或等同的任何方法和材料都可以被用於本發明的實踐或測試，但優選的方法和材料還是被加以描述。0037除非在本文中另作定義，此處所用的所有科學技術術語具有與本發明所屬領域普通技術人員所通常理解的相同的含義。Singleton等DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，2DED.，JohnWileyandSons，NewYork(1994)和HaleMarham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，NY(1991)為技術人員提供了本發明中所使用的許多術語的通用字典。0038此處所提供的標題並非是限定本發明的各個方面或實施方式，其可以作為本說明書的參考以整體包含於其中。因此，以下即刻被定義的術語以整體作為本說明書的參考而被更充分地定義。0039數字範圍包括限定該範圍的數字。0040除非另作說明，核酸是按照5′至3′方向從左至右書寫；胺基酸序列是按照氨基至羧基方向從左至右書寫。0041應當注意，如本說明書和所附權利要求中所用的，單數形式「一(a)」、「一(an)」和「該(the)」，除非將其內容另作清楚的描述，包括複數參考。因此，例如，提及含「(一種)化合物(acompound)」的組合物時，則包括了兩種或更多種化合物的混合物。同樣應當注意的是，術語″或(or)″，除非將其內容另作清楚的描述，一般用作包括「和/或(and/or)」的含義。定義0042「蛋白酶」表示來源於微生物，例如真菌、細菌，或者來自植物或動物的蛋白或者蛋白的多肽結構域或者多肽，其具有在蛋白質骨架的一個或多個不同位置催化切開肽鍵的能力(例如E.C.3.4)。0043「酸性蛋白酶」指在酸性條件下具有水解蛋白的能力的蛋白酶。0044如此處所用，「NSP24家族蛋白酶」表示以其天然或野生型形式存在時具有蛋白酶活性的酶(例如圖6的蛋白)；與SEQIDNO2或SEQIDNO10的胺基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％序列同一性的蛋白酶蛋白；SEQIDNO2或SEQIDNO10的胺基酸序列的衍生物，以及蛋白酶序列的生物學活性片段。0045如此處所用，「衍生物」表示來源於前體或母體蛋白(例如天然蛋白)的蛋白質，是通過在C-末端和N-末端之一或者兩者上加入一個和多個胺基酸，在胺基酸序列中的一個或大量不同位點置換一個或多個胺基酸，在該蛋白的單個或兩個末端或者在該胺基酸序列的一個或多個位點缺失一個或多個胺基酸，或者在該胺基酸序列中的一個或多個位點插入一個或多個胺基酸而獲得的。0046如此處所用，「天然序列NSP24」或「野生型NSP24序列」包括與來源於自然的NSP24家族蛋白酶具有相同胺基酸序列的多肽。0047「生物學活性片段」(例如具有SEQIDNO10序列的NSP24家族蛋白酶的生物學活性片段)表示NSP24家族蛋白酶或NSP25家族蛋白酶，其具有蛋白酶活性，但所包含的序列少於NSP24家族蛋白酶或NSP25家族蛋白酶的前體或母體的全序列。0048如此處所用，術語「分離的」或「純化的」指由於將蛋白酶從與其天然相關的一種或多種或所有天然存在的組分中分離出來而改變其天然狀態的蛋白酶。0049「PepA」指酸性蛋白酶，具有與SEQIDNO7至少95％的序列同一性。0050「L388M」指變體PepA，其具有SEQIDNO7序列。0051如此處所用，「NSP25家族蛋白酶」表示與SEQIDNO9具有至少85％序列同一性的蛋白酶及其生物學活性片段。0052「與NSP24家族蛋白酶不相關的」表示具有一種胺基酸序列，其與SEQIDNO10的NSP24蛋白酶具有30％以下的同源性、20％以下的同源性或者10％以下的同源性。0053術語「肽」、「蛋白質」和「多肽」在本文中可以被互換使用。0054如此處所用，有關鑑定的胺基酸或核苷酸序列的「序列同一性百分比(％)」被定義為與感興趣序列(例如NSP24家族蛋白酶序列)的胺基酸殘基或核苷酸相一致的候選序列的胺基酸殘基或核苷酸的百分比，這是經序列比對之後獲得，且如有必要，引入空位，以便獲得最大百分比的序列同一性，而不考慮作為部分序列同一性的任何保守取代。0055如此處所用，術語「α澱粉酶(例如E.C.類3.2.1.1)」指催化α-1，4-糖苷鍵水解的酶。此類酶也被描述為實現含有1，4-α-連接D-葡萄糖單位的多糖中1，4-α-D-糖苷鍵的外切或內切水解的酶。用於描述這些酶的另一個術語是「糖原酶」。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶。0056如此處所用，術語「葡糖澱粉酶」指葡糖澱粉酶類的酶(例如E.C.3.2.1.3，葡糖澱粉酶，1，4-α-D-葡聚糖葡萄糖水化酶)。這些酶為外切作用酶，其從直鏈澱粉和支鏈澱粉分子的非還原性末端釋放出葡糖基殘基。儘管速度大大低於α-1，4鍵，但此酶也水解α-1，6鍵和α-1，3鍵。0057術語「啟動子」表示一種調控序列，其涉及結合RNA聚合酶以啟動基因轉錄。0058如此處所用，「異源啟動子」是與基因或純化的核酸非天然相關的啟動子。0059如此處所用，多肽的「純化的製劑」或「基本上純的製劑」表示多肽已被從細胞、與其天然存在的其它蛋白質、脂類或核酸分離出來。0060如此處所用，在植物或動物細胞的情況下，「純化的細胞製品」指細胞的體外製品，而非整個完整的植物或動物。在培養細胞或微生物細胞的情況下，其由至少10％且更優選地50％的受試細胞的製品組成。0061「基本上純的核酸」，例如基本上純的DNA，是這樣的核酸，該核酸是以下的一種或者兩者其與序列例如編碼序列的之一或兩者並非緊密相鄰，其在所述核酸的來源生物中天然存在的基因組中與所述序列是緊密相鄰的(例如5′末端的序列和3′末端的序列)；或者其基本不含在所述核酸的來源生物中存在的核酸序列。該術語包括，例如重組DNA，其被整合入載體，例如整合入自我複製的質粒或病毒，或者整合入原核生物或真核生物的基因組DNA，或者其以獨立於其它DNA序列的單獨分子(例如通過PCR或限制性內切核酸酶處理而產生的cDNA或基因組DNA片段)存在。基本上純的DNA還包括重組DNA，其為編碼其它NSP24蛋白酶序列的雜合基因的一部分。0062如此處所用，「同源的」指兩種多肽分子之間或者兩種核酸分子之間的序列相似性。當兩條比較序列中的位置都被相同的鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如，若兩DNA分子中每個分子的一個位置都被腺嘌呤所佔據，那麼所述分子在該位置上就是同源的。兩序列間的同源性百分比，是兩序列所共有的匹配位置或同源位置數除以所比較的位置數再乘以100的函數。例如，如果兩序列中10個位置中的6個位置匹配或同源，那麼兩序列則為60％同源。通過舉例的方式，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。一般地，在兩序列比對時進行比較以提供最大同源性。0063如此處所用，術語「載體」指被設計為將核酸導入一種或多種細胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌粒、盒以及類似載體。0064如此處所用，「表達載體」表示一種DNA構建物，其包含被可操縱地連接於合適的調控序列的DNA序列，所述調控序列能夠影響該DNA在合適宿主中的表達。0065術語「表達」表示根據基因的核酸序列產生多肽的過程。0066如此處所用，術語「可操縱地連接」表示將調控區諸如啟動子、終止子、分泌信號或增強子區結合於(attachedto)或連接於(linkedto)結構基因並控制該基因的表達。0067如此處所用，「來源於」微生物的物質(例如多核苷酸或蛋白質)表示該物質對於該微生物而言是天然的。0068如此處所用，「微生物」指細菌、真菌、病毒、原生動物以及其它的微生物或微觀生物(microscopicorganisms)。0069如此處所用，「宿主菌株」或「宿主細胞」表示一種適合於表達載體的宿主，且包括所述細胞的後代，其中所述表達載體包括根據本發明的DNA。0070術語「絲狀真菌」指所有絲狀形式的真菌亞門(Eumycotina)生物(參見Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORYMYCOLOGY，Wiley，NewYorkandAINSWORTHANDBlSBYDICTIONARYOFTHEFUNGI，9thEd.(2001)Kirk等，EdS.，CABInternationalUniversityPress，CambridgeUK)。這些真菌是通過帶有細胞壁的營養菌絲體來加以表徵的，其細胞壁包括幾丁質、纖維素和其它複雜多糖。本發明的絲狀真菌在形態學、生理學和遺傳學上不同於酵母菌。絲狀真菌的營養生長是通過菌絲的延伸進行的，碳的分解代謝是專性好氧的。0071如此處所用，術語「木黴屬」或「木黴屬某種」指以前或目前被分類為木黴屬的任何真菌屬。0072如此處所用，術語「四重缺失(quad-delete)」或「四重缺失的(quad-deleted)」宿主細胞指由木黴屬宿主菌株細胞產生的細胞和原生質體，其缺少至少兩個編碼功能性內切葡聚糖酶(endoglucanases)的基因和至少兩個編碼功能性纖維二糖水解酶(cellobiohydrolases)的基因。0073如此處所用，術語「培養」指使微生物細胞群落在適當條件下在液體或固體培養基中生長。在一種實施方式中，培養指將澱粉底物諸如包含顆粒澱粉的底物經發酵生物轉化為終產物(一般在容器或反應器中進行)。發酵是通過微生物將有機物質酶促厭氧降解以產生較簡單的有機化合物。當發酵過程在厭氧條件下進行時，並非意欲將該術語僅僅限定在嚴格的厭氧條件，因為發酵也在氧存在下進行。0074如此處所用，術語「接觸」指將各種酶(一種或多種)放置於足夠接近各種底物之處，以使所述酶(一種或多種)能夠將該底物轉變成為終產物。本領域的技術人員將認識到酶與各種底物的混合溶液可以實現接觸。0075在關於將核酸序列中插入細胞的上下文中，術語「導入的」表示「轉染」、或「轉化」或「轉導」，且包括涉及將核酸序列整合入真核或原核細胞，其中該核酸序列可以被整合入該細胞的基因組(例如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)中，轉變成自主複製元或者是被瞬時表達(例如，轉染的mRNA)。0076如此處所用，有關細胞所用的術語「轉化的」、「穩定轉化的」和「轉基因的」表示該細胞含有非天然的(例如異源的)核酸序列，該核酸序列或者整合入其基因組或者作為染色體外質粒被保持多代。0077如此處所用，有關多肽或多核苷酸的術語「異源的」指在宿主細胞中並非天然存在的多肽或多核苷酸。0078術語「過量表達」表示在宿主細胞中表達多肽的過程，其中多核苷酸已被導入該宿主細胞中。0079如此處所述，本發明的一個方面的特徵是「基本上純的」(或重組的)核酸，其包括編碼NSP24家族蛋白酶或NSP25家族蛋白酶的核苷酸序列、和/或此類核酸的等價物。0080術語「等價物」指編碼功能上等價的多肽的核苷酸序列。等價的核苷酸序列將包括由於一個或多個核苷酸置換、添加或缺失而有所不同的序列，諸如等位基因變體。例如在一些實施方式中，由於遺傳密碼的簡併性，等價的核苷酸序列包括不同於SEQIDNO8核苷酸序列的序列，所述SEQIDNO8核苷酸序列編碼SEQIDNO2中所示的NSP24蛋白酶。0081如此處所用，術語「糖化作用」指將澱粉酶促轉化成為葡萄糖。0082如此處所用，「澱粉」指由植物的複合多糖碳水化合物組成的任何物質，包括具有式(C6H10O5)x的直鏈澱粉和支鏈澱粉，其中X可以是任何數字。0083術語「顆粒澱粉」指生的未熟化的(生的)澱粉(例如尚未經過糊化的澱粉)。0084如此處所用，術語「凝膠化作用」表示通過熟化將澱粉分子溶解以形成粘性懸浮液。0085如此處所用，術語「液化作用」指澱粉轉化的階段，其間凝膠化的澱粉被水解以提供低分子量的可溶性糊精。0086如此處所用，術語「可溶性澱粉水解物」指由澱粉水解產生的可溶性產物，其可以包含單糖、二糖和寡糖(例如葡萄糖、麥芽糖和更高級的糖)。0087術語「單糖」表示聚合物諸如澱粉的一個單體單位，其中聚合度(DP)是1(例如葡萄糖、甘露糖、果糖和半乳糖)。0088術語「二糖」表示一種包含兩個共價連接的單糖單位的化合物(DP2)(例如蔗糖、乳糖和麥芽糖)。0089術語「DP3+」表示各種聚合度在3以上的聚合物。蛋白酶和編碼它們的多核苷酸0090本發明涉及NSP24家族蛋白酶，諸如酸性蛋白酶，並且還涉及酸性真菌蛋白酶，其與SEQIDNO2蛋白酶或SEQIDNO10蛋白酶(圖6)具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。在一些實施方式中，NSP24家族蛋白酶被命名為NSP24，其包括SEQIDNO10的序列(成熟蛋白序列)或者還包括SEQIDNO2的前蛋白序列。0091在一些實施方式中，本發明涉及NSP24家族蛋白酶的生物學活性片段。在一些實施方式中，生物學活性片段包括具有至少250個胺基酸殘基、至少300個胺基酸殘基、至少350個胺基酸殘基、至少375個胺基酸殘基以及至少400個胺基酸殘基的蛋白酶。0092在其它實施方式中，生物學活性片段包括多肽序列的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％，所述多肽序列與圖6中的蛋白質序列(SEQIDNO2或SEQIDNO10)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性。在一些實施方式中，生物學活性片段將包括多肽序列的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％和至少98％，所述多肽序列與具有SEQIDNO2或SEQIDNO10的母體NSP24蛋白酶具有至少95％的序列同一性。在一些實施方式中，生物學活性片段將包括多肽序列的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％和至少98％，所述多肽序列與具有SEQIDNO2或SEQIDNO10的母體NSP24蛋白酶具有至少99％的序列同一性。0093在一些實施方式中，生物學活性片段為體內存在的多種片段，例如由轉錄後加工所產生的片段或者由選擇性剪接的RNA的翻譯所產生的片段。片段包括那些在天然的或內源性的細胞中表達的片段，例如由於翻譯後加工、例如由於氨基末端信號序列的去除產生的片段，並包括在表達系統例如CHO細胞中產生那些片段。一些優選的片段是這樣的片段，例如活性片段，其由蛋白水解切割或選擇性剪接事件而產生。因為肽諸如NSP24家族蛋白酶通常表現出一定範圍的生理學特性，並且因為此類特性可以被歸因於由該分子的不同部分引起的，所以有用的NSP24家族蛋白酶片段或NSP24家族蛋白酶類似物是在任何NSP24蛋白酶活性生物學試驗中表現出生物學活性的那些。0094在一些實施方式中，生物學活性片段包括具有SEQIDNO2或SEQIDNO10的NSP24的蛋白酶活性的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％和至少100％。在一些優選的實施方式中，片段或類似物在任何體內或體外NSP24蛋白酶試驗中具有NSP24蛋白酶(SEQIDNO2或SEQIDNO10)的蛋白酶活性的至少40％或至少90％。0095NSP24家族蛋白酶或NSP25家族蛋白酶的片段可以通過本領域技術人員所已知的方法生成。表現出蛋白酶生物學活性的候選片段的能力可以通過如此處所述的本領域技術人員已知的方法加以評估。同樣包括在內的是NSP24家族蛋白酶或NSP25家族蛋白酶，其含有對於該肽的生物學活性非必需的殘基或者由於選擇性mRNA剪接或選擇性蛋白質加工事件所產生的殘基。0096在一些實施方式中，本發明所包括的蛋白酶是具有SEQIDNO2或SEQIDNO10的蛋白酶的衍生物。衍生物可以與SEQIDNO10具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。0097本發明也包括多種蛋白酶類似物。蛋白酶類似物是帶有增加肽穩定性的修飾的那些；此類類似物可以在肽序列中含有例如一個或多個非肽鍵(其取代了肽鍵)。同樣包括在內的是包括除天然存在的L-胺基酸以外的殘基例如D-胺基酸，或者非天然存在的或合成胺基酸，例如b或胺基酸的類似物；以及環狀類似物。類似物在胺基酸序列方面或者不涉及序列的方面或者兩個方面，都不同於天然存在的蛋白酶諸如NSP24或NSP25蛋白。非序列修飾包括本發明所包括的蛋白酶的體內或體外的化學衍生作用。非序列修飾作用包括乙醯化作用、甲基化作用、磷酸化作用、羧化作用或糖基化作用的變化。0098在進一步的實施方式中，本發明包括NSP25家族蛋白酶。NSP25家族蛋白酶是與SEQIDNO9的成熟蛋白序列(圖9)具有至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％胺基酸序列同一性的酸性蛋白酶，或者它們的生物學活性片段。一種具體的NSP25家族蛋白酶是具有SEQIDNO9的被命名為NSP25的蛋白酶。在一些實施方式中，NSP25家族蛋白酶將是一種蛋白酶的生物學活性片段，其包括與SEQIDNO9具有至少90％序列同一性的序列的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和至少95％。在另一個實施方式中，NSP25家族蛋白酶將是一種蛋白酶的生物學活性片段，其包括與SEQIDNO9具有至少95％序列同一性的序列的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和至少95％。0099儘管根據本發明的酸性蛋白酶能夠在酸性條件下水解蛋白，但在一些實施方式中，蛋白酶活性的最適pH是在pH3.0至5.5的範圍內。在一些實施方式中，蛋白酶活性的最適pH範圍是在pH3.0至5.0之間，而在其它實施方式中，蛋白酶活性的最適pH範圍是在pH3.0至4.5之間。0100根據本發明的蛋白酶，諸如NSP24家族蛋白酶或NSP25家族蛋白酶，可以包括胺基酸置換諸如使用L-胺基酸進行「保守胺基酸的置換」，其中一種胺基酸被另一種生物學相似的胺基酸置換。保守胺基酸的置換是那些保持了被置換的胺基酸的總電荷、疏水性/親水性、和/或空間體積(stericbulk)的置換。保守置換的實例是在下列各組間進行的置換Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Lys/Arg、Asn/Gln、Glu/Asp、Ser/Cys/Thr和Phe/Trp/Tyr。衍生物可以例如有少至1至10個胺基酸殘基不同，諸如6-10個、少至5個、少至4個、3個、2個或者甚至1個胺基酸殘基不同。表1舉例說明了本領域所公認的示例性的胺基酸置換。此外，置換可以通過一種或多種不破壞蛋白酶生物學活性的非保守性胺基酸置換、缺失或插入來完成。表1保守胺基酸的置換0101在一些實施方式中，本發明的蛋白酶是天然的序列。此類天然序列可以從自然界分離或者可以通過重組或合成的方式產生。術語「天然序列」具體地包括天然存在的截短形式或分泌形式的NSP24或NSP25家族蛋白酶(例如生物學活性片段)，以及天然存在的變體形式(例如選擇性剪接的形式)。0102在一些實施方式中，本發明的酸性蛋白酶是PepA蛋白酶，其與SEQIDNO7具有至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性。在一些實施方式中，該蛋白酶具有SEQIDNO7序列並被命名為「L388M」。在進一步的實施方式中，該蛋白酶由具有SEQIDNO5或SEQIDNO3序列的核苷酸序列所編碼。0103本發明還涉及編碼本發明所包括的蛋白酶的多核苷酸序列。一些此類多核苷酸包括a)編碼NSP24家族蛋白酶的多核苷酸，該蛋白酶與SEQIDNO2或SEQIDNO10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性；b)編碼SEQIDNO2序列的多核苷酸；c)具有SEQIDNO8序列的多核苷酸；d)編碼NSP24家族蛋白酶生物學活性片段的多核苷酸；e)與SEQIDNO8序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性的多核苷酸；f)與對應於SEQIDNO4、SEQIDNO8或者SEQIDNO4或SEQIDNO8片段的DNA序列的核酸探針相雜交的多核苷酸，所述片段具有至少10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或150個連續的核苷酸；g)編碼NSP25家族蛋白酶的多核苷酸，其與SEQIDNO4具有至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性；h)編碼SEQIDNO9蛋白酶的多核苷酸；i)具有SEQIDNO4序列的多核苷酸；j)編碼NSP25家族蛋白酶的生物學活性片段的多核苷酸；k)編碼SEQIDNO7的序列及其生物學活性片段的多核苷酸；和l)具有SEQIDNO3或SEQIDNO5序列的多核苷酸。0104因為遺傳密碼的簡併性，一個以上的密碼子可以被用於編碼一具體胺基酸。因此，不同的DNA序列可以編碼與例如SEQIDNO2多肽具有相同胺基酸序列的多肽。本發明包括編碼此同一多肽的多種多核苷酸。0105當單鏈形式的核酸能夠在適宜的溫度和溶液離子強度條件下與其它核酸進行退火時，則該核酸可與另一核酸序列雜交。對於低、中、高以及極高嚴緊性條件的雜交而言，雜交和清洗條件為本領域所熟知(參見例如Sambrook(1989)supra，具體是第9章和第11章)。一般而言，雜交涉及核苷酸探針和同源DNA序列，其通過互補多核苷酸廣泛的鹼基配對形成穩定的雙鏈雜合體(同樣參見第8章，GeneCloning，AnIntroduction，T.A.Brown(1995)ChapmanandHallLondon)。在一些實施方式中，可以將帶有探針和同源序列的濾膜在2×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5％SDS中，在大約60℃(中等嚴緊性)、65℃(中/高嚴緊性)、70℃(高嚴緊性)和大約75℃(非極高嚴緊性)下進行洗滌(CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileySons，NewYork，1989，6.3.1-6.3.6，在此被併入本文作為參考)。0106包括在本發明內的是等位基因變異；天然突變體；誘導突變體；由在高或低嚴緊性條件下與編碼SEQIDNO2、SEQIDNO8、SEQIDNO9和SEQIDNO10的多肽的核酸雜交的DNA所編碼的蛋白；以及被抗血清特異性結合至具有SEQIDNO2或SEQIDNO10的NSP24蛋白酶的多肽，尤其是被抗血清特異性結合至NSP24蛋白酶的活性位點或結合結構域的多肽。在一些實施方式中，編碼本發明的NSP24家族蛋白酶的核酸，諸如編碼SEQIDNO2的NSP24蛋白酶的核酸，在高嚴緊性條件下，與對應於來自SEQIDNO8的至少12、15或20個連續核苷酸的核酸雜交。0107本發明的核酸和多肽包括由於所公開序列中的測序錯誤而不同於本文所公開的序列的那些核酸和多肽。0108DNA序列的同源性由兩DNA序列間的同一性程度確定。可以用電腦程式來確定多肽序列或核苷酸序列的同源性或者同一性百分比。進行序列聯配以及確定序列同一性的方法是技術人員已知的，可以不經過過多的實驗而進行，並且可以明確地計算出同一性的值。參見，例如Ausubel等eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology，Chapter19(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)inAtlasofProteinSequenceandStructure5Suppl.3(NationalBiomedicalResearchFoundation，Washington，D.C.)。有大量用於比對序列和確定序列同一性的算法是可利用的，包括，例如Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性聯配算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性聯配算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444的相似性搜索法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)；以及BLASTP、BLASTN和BLASTX算法(參見Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410)。使用這些算法的計算機化程序也是可利用的，包括但不限於ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體、或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266460-480(1996))；或者GAP、BESTFIT、BLASTAltschul等，supra、FASTA和TFASTA，可獲自GeneticsComputingGroup(GCG)包，Version8，Madison，Wis.，USA；和PC/Gene程序中的CLUSTAL，Intelligenetics，MountainView，Calif。本領域的技術人員可以確定用於測量聯配的合適參數，包括用於在所比較的序列長度內獲得最大聯配所需的算法。優選地，使用程序確定的默認參數來測定序列同一性。具體而言，序列同一性可以通過Smith-Waterman同源性搜索算法加以測定(Meth.Mol.Biol.70173-187(1997))，如在MSPRCH程序(OxfordMolecular)中使用擬合空位搜索(affinegapsearch)，並使用下列搜索參數所進行的空位開放罰分為12，空位延伸罰分為1。優選地，成對的胺基酸比較可以使用GeneticsComputerGroup，Inc.，Madison，Wis.的GCG序列分析軟體包中的GAP-程序進行，其使用blosum62胺基酸置換矩陣，空位權重為12，長度權重為2。關於兩胺基酸序列的最適聯配，變體胺基酸序列的連續片段相對於參比胺基酸序列而言可以含有額外的胺基酸殘基或缺失的胺基酸殘基。被用於與參比胺基酸序列進行比較的連續片段將包括至少20個連續的胺基酸殘基，並可以是30、40、50、或更多個胺基酸殘基。可以通過指定空位罰分，對衍生物的胺基酸序列中與包含空位有關的增加的序列同一性進行校正。0109在一些實施方式中，本發明所包括的蛋白酶(例如與SEQIDNO2序列具有至少80％序列同一性的NSP24家族蛋白酶)，來源於細菌或真菌諸如絲狀真菌。一些優選的絲狀真菌包括麴黴屬某些種(Aspergillusspp.)和木黴屬某些種(Trichodermaspp.)。一種優選的木黴為裡氏木黴(T.reesei)。然而，根據本發明的蛋白酶和/或編碼蛋白酶的DNA可以是來源於真菌，諸如犁頭黴屬某些種(Absidiaspp.)；枝頂孢黴屬某些種(Acremoniumspp.)；傘菌屬某些種(Agaricusspp.)；Anaeromycesspp.；麴黴屬某些種(Aspergillusspp.)，包括刺孢麴黴(A.aculeatus)、泡盛麴黴(A.awamori)、黃麴黴(A.flavus)、臭麴黴(A.foetidus)、A.fumaricus、煙麴黴(A.fumigatus)、構巢麴黴(A.nidulans)、黑麴黴(A.niger)、米麴黴(A.oryzae)、土麴黴(A.terreus)和雜色麴黴(A.versicolor)；Aeurobasidiumspp.；Cephalosporumspp.；毛殼菌屬某些種(Chaetomiumspp.)；鬼傘屬某些種(Coprinusspp.)；Dactyllumspp.；鐮刀菌屬某些種(Fusariumspp.)，包括F.conglomerans、磚紅鐮刀菌(F.decemcellulare)、爪哇鐮刀菌(F.javanicum)、亞麻鐮刀菌(F.lini)、尖鐮孢菌(F.oxysporum)和茄腐鐮刀菌(F.solani)；粘帚黴屬某些種(Gliocladiumspp.)；腐質黴屬某些種(Humicolaspp.)，包括特異腐質黴(H.insolens)和疏棉狀腐質黴(H.lanuginose)；毛黴屬某些種(Mucorspp.)；脈孢菌屬某些種(Neurosporaspp.)，包括粗糙脈孢菌(N.crassa)和好食脈孢黴(N.sitophila)；Neocallimastixspp.；Orpinomycesspp.；青黴屬某些種(Penicilliumspp.)；顯革菌屬某些種(Phanerochaetespp.)；Phlebiaspp.；Piromycesspp.；根黴屬某些種(Rhizopusspp.)；裂褶菌屬某些種(Schizophyllumspp.)；栓菌屬某些種(Trametesspp.)；木黴屬某些種(Trichodermaspp.)，包括裡氏木黴(T.reesei)、裡氏木黴(T.reesei)(長枝木黴(T.longibrachiatum))和綠色木黴(T.viride)；和接合黴屬某些種(Zygorhynchusspp.)。宿主細胞0110在一些實施方式中，本發明提供了用本文所述的DNA構建物和載體轉化的宿主細胞。在一些實施方式中，被導入宿主細胞的編碼本發明所包括的蛋白酶(例如與SEQIDNO2具有至少95％序列同一性的NSP24家族蛋白酶)的多核苷酸編碼異源性蛋白酶，而在其它實施方式中，該多核苷酸編碼在宿主細胞中過量表達的內源性蛋白酶。在一些實施方式中，本發明提供了在宿主細胞諸如細菌和真菌宿主細胞中發揮功能的基因啟動子控制下，異源性蛋白酶基因的表達或者蛋白酶基因的過量表達。0111一些優選的宿主細胞包括絲狀真菌細胞。絲狀真菌宿主細胞的非限定性實例包括木黴屬某些種(Trichodermaspp.)(例如綠色木黴(T.viride)和裡氏木黴(T.reesei)、紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)的無性型，以前被分類為長枝木黴(T.longibrachiatum))、青黴屬某些種(Penicilliumspp.)、腐質黴屬某些種(Humicolaspp.)(例如特異腐質黴(H.insolens)和灰色腐質黴(H.grisea))、麴黴屬某些種(Aspergillusspp.)(例如黑麴黴(A.niger)、構巢麴黴(A.nidulans)、米麴黴(A.orzyae)和泡盛麴黴(A.awamori))、鐮刀菌屬某些種(Fusariumspp.)(禾赤鐮孢菌(F.graminum))、脈孢菌屬某些種(Neurosporaspp.)、肉座菌屬某些種(Hypocreaspp.)和毛黴屬某些種(Mucorspp.)。進一步地，宿主細胞可以包括芽孢桿菌屬某些種(Bacillusspp.)(例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、緩慢芽孢桿菌(B.Lentus)、脂肪嗜熱芽孢桿菌(B.stearothremophilus)和短小芽胞桿菌(B.brevis))以及鏈黴菌屬某些種(Streptomycesspp.)(例如雜色鏈黴菌(S.coelicolor)和變鉛青鏈黴菌(S.lividans)(TK23和TK21))。分子生物學0112本發明依靠重組遺傳領域的常規技術。公開本發明中的一般使用方法的基本教科書包括Sambrook等MolecularCloning，ALaboratoryManual(2nded.1989)；Kriegler，GeneTransferandExpressionALaboratoryManual(1990)；和Ausubel等，eds.，CurrentProtocolsinMolecularBiology(1994))。0113異源基因，包括例如絲狀真菌的基因啟動子序列，一般在轉化進入宿主細胞諸如裡氏木黴細胞進行複製和/或表達以前，被克隆進中間載體。這些中間載體一般是原核載體，例如質粒或穿梭載體。0114為獲得克隆基因的高水平表達，異源基因與啟動子間的距離優選地同天然存在的基因與啟動子間的距離大約相同。然而，如本領域已知，在不損失啟動子功能的條件下，對此距離的一些變化是可以接受的。0115本領域的技術人員應認識到，在不改變其功能的條件下，天然啟動子可以通過置換(replacement)、取代、添加或消除一個或多個核苷酸而被修飾。本發明實踐包括而不限於對啟動子的此類改變。0116表達載體/構建物一般包含轉錄單位或表達盒，其包含表達異源序列所需的全部額外的元件。因此，典型的表達盒包含被可操縱地連接於異源核酸序列的啟動子和對轉錄物進行有效的多聚腺苷酸化、核糖體結合位點以及翻譯終止所需的信號。盒的其它元件可以包括增強子，且如果基因組DNA被用作結構基因，則還包括攜帶功能性剪接供體位點和受體位點的內含子。0117本發明實踐並不受到對遺傳構建物中啟動子的選擇所限制。但是，示例性的啟動子為裡氏木黴cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1和xln2啟動子。同樣，來自泡盛麴黴和黑麴黴葡糖澱粉酶基因(glaA)的啟動子(Nunberg等(1984)Mol.CellBiol.42306-2315)以及來自構巢麴黴乙醯胺酶的啟動子可以用於所述的載體。被用於枯草芽孢桿菌所用載體的優選啟動子為AprE啟動子；大腸桿菌所用的優選啟動子為Lac啟動子，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)所用的優選啟動子為PGK1，黑麴黴(Aspergillusniger)所用的優選啟動子為glaA，而裡氏木黴(Trichodermareesei)的優選啟動子為cbh1。0118除啟動子序列以外，表達盒應當還包含結構基因的轉錄終止區下遊以提供有效的終止作用。終止區可以從與啟動子序列相同的基因中獲得，或者可以從不同的基因中獲得。0119儘管任何真菌終止子在本發明中都有可能是有用的，但是一些優選的終止子包括來自構巢麴黴trpC基因(Yelton，M.等(1984)PNASUSA811470-1474，Mullaney，E.J.等(1985)MGG19937-45)、泡盛麴黴或黑麴黴葡糖澱粉酶基因(Nunberg，J.H.等(1984)Mol.CellBiol.42306，Boel，E.等(1984)EMBOJ.31581-1585)、米麴黴TAKA澱粉酶基因和米氏毛黴(Mucormiehei)羧基蛋白酶基因(EPO公布號.0215594)的終止子。0120用於將遺傳信息傳送入細胞的具體表達載體並非特別關鍵。用於在真核或原核細胞表達的任何常規載體都可以被使用。標準的細菌表達載體包括噬菌體λ和M13，以及質粒諸如基於pBR322的質粒、pSKF、pET23D，和融合表達系統諸如MBP、GST和LacZ。也可以給重組蛋白添加表位標籤，以提供簡便的分離方法，例如c-myc。適當的表達和/或整合載體實例在Sambrook等(1989)supra、Bennett和Lasure(Eds.)MoreGeneManipulationsinFungi，(1991)AcademicPresspp.70-76與pp.396-428及其所引用的文章；USP5,874,276以及真菌遺傳保藏中心菌株目錄(FungalGeneticStockCenterCatalogueofStrains)(FGSC，www.fgsc.net.)中提供。可以從Promega和Invitrogen獲得有用的載體。一些具體的有用載體包括pBR322、pUC18、pUC100、pDONTM201、pENTRTM、pGEN3Z和pGEN4Z。然而，本發明意欲包括其它形式的表達載體，其具有發揮著等效的功能並且已被或正在被本領域所知曉。因此，大量的各種宿主/表達載體的組合可以被用於表達本發明的DNA序列。有用的表達載體，例如，可以包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列的片段，諸如各種已知的SV40衍生物和已知的細菌質粒，例如來自大腸桿菌的質粒，包括colE1、pCR1、pBR322、pMb9、pUC19以及它們的衍生物、宿主範圍更廣的質粒，例如RP4、噬菌體DNA例如大量的λ噬菌體的衍生物，例如NM989，以及其它DNA噬菌體例如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體、酵母質粒諸如2μ質粒或其衍生物。0121在一些實施方式中，表達載體包括選擇性標記。選擇性標記的實例包括賦予其抗微生物抗性的標記。營養型標記也可用於本發明中，包括那些本領域已知的標記如amdS、argB和pyr4。用於轉化木黴的有用標記是本領域已知的(參見例如Finkelstein，chapter6，inBiotechnologyofFilamentousFungi，Finkelstein等，EDSButterworth-Heinemann，BostonMA(1992)和Kinghorn等，(1992)AppliedMolecularGeneticsofFilamentousFungi，BlackieAcademicandProfessional，ChapmanandHall，London)。在一些實施方式中，表達載體還將包括複製元、編碼抗生素抗性的基因，這使得能夠對包容重組質粒的細菌進行選擇，以及包括質粒非必需區中獨特的限制性位點，以使得能夠插入異源序列。所選的具體抗生素抗性基因並非關鍵性的，本領域已知的許多抗性基因中的任何一個都是適用的。優選地選擇原核序列，這樣，它們便無法幹擾DNA在裡氏木黴中的複製和整合。0122本發明的轉化方法可以導致將全部或部分轉化載體穩定整合入宿主細胞諸如絲狀真菌宿主細胞的基因組中。但是，還考慮的轉化作用是，其導致了自我複製的染色體外轉化載體的維持。0123許多標準的轉染方法可以被用於產生表達大量蛋白酶的細菌或絲狀真菌(例如麴黴屬或木黴屬)細胞系。一些公布的將DNA構建物導入產纖維素木黴屬菌株的方法包括Lorito，Hayes，DiPietro和Harman，(1993)Curr.Genet.24349-356；Goldman，VanMontagu和Herrera-Estrella，(1990)Curr.Genet.17169-174；和Penttila，Nevalainen，Ratto，Salminen和Knowles，(1987)Gene6155-164，也參見USP6,022,725；USP6,268,328和Nevalainen等，″TheMolecularBiologyofTrichodermaanditsApplicationtotheExpressionofBothHomologousandHeterologousGenes″inMolecularIndustrialMycology，Eds，LeongandBerka，MarcelDekkerInc.，NY(1992)pp129-148；對於麴黴屬而言，包括Yelton、Hamer和Timberlake，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA811470-1474，對於鐮刀菌屬而言，包括Bajar，Podila和Kolattukudy，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA888202-8212，對於鏈黴菌屬而言，包括Hopwood等，1985，GeneticManipulationofStreptomycesLaboratoryManual，TheJohnInnesFoundation，Norwich，UK和Femandez-Abalos等，Microbiol1491623-1632(2003)，而對於芽孢桿菌屬而言，包括Brigidi，DeRossi，Bertarini，Riccardi和Matteuzzi，(1990)FEMSMicrobiol.Lett.55135-138。0124然而，將外源核苷酸序列導入宿主細胞的任何熟知的方法都可以被使用。這些方法包括使用磷酸鈣-轉染法、polybrene法、原生質體融合、電穿孔、生物射彈法(biolistics)、脂質體、顯微注射、原生質載體、病毒載體以及任何其它熟知的將克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遺傳物質導入宿主細胞的方法(參見例如Sambrook等，supra)。同樣使用的是美國專利號6,255,115中所述的農桿菌介導的轉染法。唯一必不可少的是所用的具體遺傳工程方法應當是能夠將至少一種基因成功地導入能夠表達該基因的宿主細胞中。在一種實施方式中，本發明涉及一種生產本發明所包括的蛋白酶(例如NSP24家族蛋白酶)的方法，其包括向宿主細胞中導入包含啟動子的多核苷酸，該啟動子被可操縱地連接於編碼蛋白酶諸如NSP家族蛋白酶的核酸；在適於蛋白酶表達和產生的合適培養條件下培養該宿主細胞；並產生所述的蛋白酶。在一些優選的實施方式中，蛋白酶是與SEQIDNO2或SEQIDNO10具有至少95％序列同一性的NSP24家族蛋白酶或者其生物學活性片段。0125當表達載體被導入細胞後，轉染的細胞或轉化的細胞被培養在適於基因表達的條件下，並受到蛋白酶基因啟動子序列的控制。大批量的轉化的細胞可以如下文實施例3中所述進行培養。最後，使用標準技術從培養物中回收產物。0126因此，本發明在此提供了所需多肽的表達和增強的分泌，該多肽的表達是在基因啟動子序列的控制之下，所述基因啟動子序列包括天然存在的蛋白酶基因、融合DNA序列以及多種異源構建物。本發明還提供了表達和分泌高水平的此類所需多肽的方法。蛋白表達0127本發明的蛋白質是由用載體諸如含有基因的表達載體轉化的培養細胞產生的，所述基因的表達是在基因啟動子序列控制之下。本發明對於增強蛋白質諸如本發明所包括的蛋白酶的細胞內和/或細胞外產生特別有用。蛋白質可以是同源的或者異源的。對於所述基因表達的適宜條件包括向培養物中提供本發明的誘導供給組合物(inducingfeedcomposition)。生產該蛋白的最適條件將隨對宿主細胞的選擇以及隨對將要表達的蛋白酶蛋白的選擇而變化。通過常規的實驗和優化作用，本領域的技術人員將會容易地確定此類條件。0128感興趣的蛋白酶蛋白可以在表達後被分離或回收並純化。根據樣品中存在的其它組分，感興趣的蛋白可以按本領域技術人員已知的各種方法加以分離或純化。標準的純化方法包括電泳技術、分子技術、免疫技術和層析技術，所述層析技術包括離子交換層析、疏水層析、親合層析以及反相HPLC色譜和色譜聚焦。例如，感興趣的蛋白可以用標準的抗感興趣蛋白的抗體柱加以純化。結合蛋白質濃縮，超濾和透析技術也是有用的。合適純化技術的一般指南，參見Scopes，ProteinPurification(1982)。必需的純化程度將根據感興趣蛋白質的用途而變化。在一些實例中，將不必進行純化。細胞培養0129宿主細胞和轉化細胞可以培養在常規的營養培養基中。轉化的宿主細胞的培養基可以根據適合於活化啟動子以及選擇轉化體來進行修改。具體的培養條件諸如溫度、pH及類似的條件可以是用於被選擇用來表達的宿主細胞的那些條件，並且對於本領域的技術人員而言將是顯而易見的。此外，優選的培養條件可以在科學文獻諸如Sambrook，(1982)supra；Kieser，T，MJ.Bibb，MJ.Buttner，KFChater，andD.A.Hopwood(2000)PRACTICALSTREPTOMYCESGENETICS.JohnInnesFoundation，NorwichUK；Harwood.等，(1990)MOLECULARBIOLOGICALMETHODSFORBACILLUS，JohnWiley中和/或從美國典型培養物保藏中心(ATCC；www.atcc.org)中找到。真菌宿主細胞諸如木黴細胞的穩定轉化體一般可以根據其較快的生長速度或者在固體培養基上形成帶有光滑而非粗糙輪廓的圓形克隆而區別於非穩定轉化體。表達多肽的回收和純化蛋白酶的方法0130本發明所包括的多肽，諸如由轉化宿主細胞所產生的與SEQIDNO10具有至少80％序列同一性的多肽，可以從培養基中回收，這通過多種常規方法進行，包括通過離心或過濾將宿主細胞從培養基中分離出來，或者如有必要，裂解細胞並從細胞級分或細胞殘骸移取上清。在一些情況下，經過澄清之後，上清或濾液中的蛋白質組分利用鹽例如硫酸銨進行沉澱。然後，將沉澱的蛋白質溶解並可以通過各種層析方法例如離子交換層析、凝膠過濾層析、親合層析以及其它本領域所認知的方法進行純化。肽和蛋白質的抗體可以通過免疫動物例如兔或小鼠來進行製備，並通過現有技術的方法回收抗-NSP24蛋白酶抗體。0131用於本發明的試驗包括，但不限於WO9934011和USP6,605,458中所述的那些試驗。組合物和應用0132在一些實施方式中，本發明涉及包含如此處所述的本發明的蛋白酶的組合物。在根據本發明的組合物以及應用中有用的蛋白酶的一些非限制性實例包括例如NSP24家族蛋白酶或者NSP25家族蛋白酶，更具體地與SEQIDNO2具有至少85％序列同一性的NSP24家族蛋白酶或者其生物學活性片段，諸如與SEQIDNO10序列具有至少90％序列同一性的蛋白酶。在一些實施方式中，酶組合物為單組分蛋白酶組合物。在一些實施方式中，本發明涉及在工業和商業應用中使用本發明的蛋白酶的方法。組合物與工業應用的下列描述意欲為示例性的而非包括性的。0133包括本發明蛋白酶的組合物可以進一步包括其它酶類，諸如，但不限於，葡糖澱粉酶、α澱粉酶、顆粒澱粉水解酶、纖維素酶、脂酶、木聚糖酶、角質酶、半纖維素酶、氧化酶以及它們的組合。0134在一些優選的實施方式中，組合物將包括本發明的蛋白酶和葡糖澱粉酶，所述蛋白酶與SEQIDNO10序列具有至少85％的序列同一性。葡糖澱粉酶可以是從絲狀真菌來源諸如麴黴屬、木黴屬或根黴屬菌株獲得的野生型葡糖澱粉酶，或者葡糖澱粉酶可以是蛋白質工程化葡糖澱粉酶，諸如黑麴黴葡糖澱粉酶的變體。在其它優選的實施方式中，組合物將包括本發明的蛋白酶和α澱粉酶。在一些實施方式中，α澱粉酶可以從細菌來源諸如芽孢桿菌屬某些種或者從真菌來源諸如麴黴屬某些種獲得。在一些實施方式中，組合物可以包括根據本發明的蛋白酶以及葡糖澱粉酶和α澱粉酶。這些酶類的商業來源是已知的，並且可從例如GenencorInternational，Inc.和NovozymesA/S獲得。0135在若干實施方式中，本發明已考慮用於乙醇生產、烘焙、果汁生產、釀造、蒸餾、酒類製造、皮革、油類與脂肪、紙與漿以及動物飼料生產。0136在其它實施方式中，本發明被考慮作為去汙劑和清潔產品的活性「生物學」組分。在此，蛋白酶、澱粉酶和脂酶被用於分解蛋白質、澱粉和脂肪汙漬。本發明的實施方式包括通過進行穩定性研究測試酶類與去汙劑組分的相容性以及在多種配方中測試它們。0137仍在另一實施方式中，本發明考慮了將澱粉液化並糖化為葡萄糖並異構化為果糖的酶促用途。本發明可以被用於將大體積的植物底物，諸如糧食(例如玉米、小麥、蜀黍、黑麥及類似物)轉變為增甜劑，如高果糖玉米糖漿和麥芽糖糖漿。0138本發明的酶(一種或多種)可應用於食品和飼料工業以提高蛋白質的可消化性。蛋白酶還被用於多種工業應用方面，具體而言，用於紡織品、平版印刷、化學工藝、農業、環境廢棄物轉化、生物漿加工、生物量轉化為燃料以及其它化學方法(一種或多種)。進而，該蛋白酶被應用於保健及個人護理產品諸如化妝品、皮膚護理品、牙膏及類似物。飼料0139本文所述的本發明酶被用於動物飼料。所述飼料可以包括植物材料諸如玉米、小麥、高梁、大豆、油菜、向日葵以及任何此類植物材料的混合物或者植物蛋白來源，用於家禽、豬、反芻動物、水產養殖和寵物。應當考慮，各種性能參數諸如生長、飼料攝取和飼料效率，以及改善的均勻性、動物棚舍中降低的氨濃度、隨之提高的動物福利和健康狀況都將得到改善。食品0140食用蛋白質水解產物代表了一個小而重要的市場部分。此類製品被用於術後患者或用於消化系統損傷的個體。此水解產物可以作為本身相對粗的製品被施用(Clegg，1978In″BiochemicalAspectsofNewProteinFood″，J，Adler-Nissen，B，O，Eggum，L，MunckH.S.Olseneds.，p.109-117，Pergamon，Oxford)，或者作為高度純化的胺基酸混合物用於靜脈內施用。乳蛋白的酶水解產物已被用作食用製品。0141瘦肉食品，特別是肉類的酶促嫩化，代表了一個巨大的市場部分，其目前由植物蛋白酶和某些微生物酶類所主導。魚類瘦肉的酶促成熟和嫩化在許多國家也是相當重要的。因此，現在所描述的酶類被用於食品的多種用途中。0142進一步，本發明的酶或酶組合物可以用於由例如植物蛋白如大豆、豌豆、羽扇豆或油菜籽蛋白、奶如酪蛋白、肉類蛋白或魚蛋白來製作蛋白質水解產物。此處所述的酶(一種或多種)可以被用於蛋白質水解產物以改善溶解性、均一性或可發酵性，減少抗原性、減少水解產物的苦味，或者用於製造食品、飼料或醫藥產品的其它目的。此處所述的酶(一種或多種)可以被單獨使用或者與其它肽酶一起或者與其它酶類如外切肽酶一起使用。此處所述的酶(一種或多種)與富含外切肽酶的酶製劑一起使用，將會改善蛋白質水解產物的口味。0143而且，該酶或酶組合物可以被用於魚或肉的加工，例如改變質地和/或粘性。皮革0144工業皮革製造有賴於涉及皮革的清潔、脫毛以及最終的鞣製和乾燥的一系列步驟。酶處理在脫毛步驟中發揮了重要的作用，該步驟是通過應用蛋白水解酶，如本發明的肽水解酶而實現的；由於它們具有高蛋白水解活性和在低pH下具有功效，從而能夠提供皮革製造中目前所用的哺乳動物蛋白酶的有效替代品。毛料與絲綢0145此處所述的蛋白酶被用於工業處理毛料製品以賦予所期望的特性。在一種實施方式中，本發明提供了處理紡織品的組合物。該組合物可以被用於處理例如毛料與絲綢(參見例如RE216,034；EP134,267；US4,533,359；和EP344,259)。0146本發明的方法可以被用於處理含蛋白的纖維，例如角蛋白纖維。其適於處理毛料、毛料纖維或動物毛髮，諸如安哥拉山羊毛(angora)、馬海毛(mohair)、開司米毛(cashmere)、alpacca或其它商業上有用的動物毛髮產品，其可以來源於綿羊、山羊、羊駝、駱駝、兔等。蠶絲、蜘蛛絲或人類毛髮也可以用本發明的方法處理。所述纖維可以是纖維或頂絨(top)、紗線(yarn)或者紡織品或針織品或服裝的形式。清潔0147本發明還涉及含有本發明蛋白酶(一種或多種)的清潔組合物。該清潔組合物可以額外含有通常用於清潔組合物的多種添加劑。它們可以選自，但不限於漂白劑、表面活性劑、助洗劑、酶和漂白催化劑。對於本領域的普通技術人員而言，什麼添加劑適合於包含在組合物中將會是顯而易見的。此處所提供的清單並非詳盡，而應當被視為合適添加劑的實例。對於本領域的普通技術人員而言，僅使用那些與組合物中的酶和其它組分相容的添加劑，例如表面活性劑，也將會是顯而易見的。0148蛋白質，具體而言是本發明的那些蛋白質，可以按重量被配製成大約0.01至大約5％(優選地0.1％至0.5％)水平的已知的粉末去汙劑和液體去汙劑，其具有3.5至7.0之間的酸性pH。在一些實施方式中，此類清潔組合物進一步包括其它酶類諸如澱粉酶、其它蛋白酶、纖維素酶、脂酶或內切葡萄糖苷酶、以及助洗劑和穩定劑。在一些實施方式中，pH是在4.0至6.5之間，優選地在4.0至5.6之間。根據所需的活性水平，儘管由於其最適pH的緣故，這些酶被稱為酸性蛋白酶，但是在pH7-9下使用這些酶也是有可能的。0149將蛋白質加入常規清潔組合物並沒有任何特殊的使用限制。換言之，只要pH在以上範圍內，而溫度在所述蛋白質變性溫度以下，適於去汙劑的任何溫度與pH也都適於本組合物。此外，本發明的蛋白質被用在無去汙劑的清潔組合物中，再者單獨使用或者與助洗劑和穩定劑組合使用。蛋白質加工0150蛋白質原材料的酶促水解經常導致苦味肽(bitterpeptides)的形成(Clegg，1978)。存在於蛋白水解產物中的苦味肽可能代表了相當多的實際問題，如這樣的情況，例如在不同類型奶酪的熟化過程中以及在食用蛋白質水解產物的生產過程中。水解產物的苦味通常是由於特定的肽，且尤其是含有高比例疏水胺基酸的那些肽引起的。通過苦味肽的完全或者部分水解可以有效地減少苦味。因此，此處所述的酶類可用於去除食品的苦味。本發明的酶或酶組合物可以被用於減少食物中蛋白質和/或蛋白質水解產物的苦味。0151根據本發明還考慮到從蛋白質和/或蛋白質水解產物生產游離胺基酸。當游離胺基酸為穀氨酸的情況下，其強化了食品的風味。0152所述蛋白質或蛋白質水解產物可以是動物或植物來源的。在本發明的實施方式中，將要被水解的蛋白是酪蛋白或大豆蛋白。0153該蛋白可以被用於生產食品諸如奶酪和含可可的食品。0154儘管此處所述的酶(一種或多種)以及富集了本發明酶的酶製品在用於生產無苦味的蛋白質或蛋白質水解產物中可能特別是有利的，但是此處所述的酶(一種或多種)還可以被用於大量工業應用，包括含蛋白質物質諸如細胞壁的降解或改性。一些蛋白質如伸展蛋白是植物細胞壁的組分。因此，此處所述的酶(一種或多種)將有助於植物細胞壁的降解和改性。0155本發明酶製品的劑量以及使用該製品時的其它條件可以根據本領域已知的方法加以確定。0156蛋白質沉澱物在某些產品諸如例如啤酒中也提出了相當大的問題，原因在於沉澱導致產品混濁。在啤酒的冷卻儲藏期間，當可溶性蛋白沉澱時，會在啤酒中產生混濁。這一問題有著相當大的經濟重要性，而且除挑選合適的原材料用於製造啤酒外，目前避免此問題的主要方法是向啤酒中加入蛋白水解酶。個人護理0157在一些實施方式中，一旦此處所述的蛋白酶被合成並純化，則將有效的量加入個人護理組合物(一種或多種)，其可用於個人護理產品。個人護理產品可以被劃分/描述為化妝品、非處方(『「OTC」)化合物，其可用於個人護理應用(例如化妝品、皮膚護理、口腔護理、頭髮護理、指甲護理)。在一些實施方式中，此處所述的蛋白酶被加入個人護理組合物諸如頭髮護理組合物、皮膚護理組合物、指甲護理組合物、化妝品組合物或者它們的任何組合。因此，可以在例如用於清洗隱形眼鏡的溶液、牙膏、化妝品和皮膚護理產品中使用該酶或酶製品。增甜劑0158此處所述的蛋白酶可用於生產高麥芽糖或高果糖糖漿以及其它增甜劑。含可發酵糖類或可被轉化為糖類的組分的原材料通常為含澱粉的植物材料，包括但不限於糧食作物(例如玉米、小麥、蜀黍、燕麥和黑麥)的塊莖、根、莖、穗和穀粒以及含糖原材料諸如甜菜、甘蔗、水果材料和糖蜜。益生素(調節腸道微生態平衡用的寡糖類等有機物，Prebiotics)0159酶製品可以用於從蛋白質生產肽，其中使用基本無其它蛋白水解活性的克隆的酶是有利的。0160通過使用此處所描述的酶(一種或多種)(例如純化的酶)來水解合適的蛋白來源，產生高度適於作為微生物底物的游離胺基酸和肽的粗製品是可能的，所述微生物對用於生長的胺基酸有著特殊的要求。0161這是用在工業發酵中的相當大量的微生物的情況。必需胺基酸的供應通常代表了此類發酵過程中的流程節約的一項重要因素。通過應用酶所產生的胺基酸製品不但適合用作實驗室的底物而且適合用作大規模工業發酵的底物。0162此處所述的酶(一種或多種)也可以被用於功能肽、益生素和類似物的原位產生。術語「益生素」指食品或飼料組分，其通過選擇性地刺激消化道內，優選地為結腸內的一種或有限數量的細菌的生長和/或活性而對宿主產生有益的影響。發酵與生物乙醇0163使用本發明的蛋白酶組合物由含澱粉底物的發酵來生產乙醇，可以包括生產燃料酒精或便攜酒精(portablealcohol)。在一些實施方式中，酶組合物也可以被用於促進燕麥、麥芽以及其它原材料的酵母發酵以生產例如啤酒。0164澱粉酶是釀造和烘焙工業的基本酶類。在麥芽製備過程中以及在缺乏添加的糖類或其它碳水化合物的條件下進行的某些烘焙過程中，需要澱粉酶來降解澱粉。獲得此類酶的充分活性是成問題的，尤其在麥芽製備工業。一種用生理學可接受的系統充分提高澱粉酶活性的方法，導致產生了更加迅速的麥芽製備方法，並且由於提高的糖類可利用性，從而導致產生了具有降低的碳水化合物含量的酒精飲料諸如啤酒。0165在一些實施方式中，含澱粉底物諸如穀粒(例如玉米、小麥和高梁)、穗以及其它植物殘留物的水解將會產生酒精諸如乙醇。酒精的生產方法在TheAlcoholTextbook，AReferencefortheBeverage，FuelandIndustrialAlcoholIndustries，3rdEd.，Eds.，K.A.Jacques等，(1999)NottinghamUniversityPress，UK中有所描述。在本發明的一些實施方式中，蛋白酶將與葡糖澱粉酶以及任選的α澱粉酶一起以組合物方式被應用於合併的糖化發酵步驟，也被稱為同步糖化和發酵。同樣參考了Chapter2.1，FermentationAlcohol，S.LewisinIndustrialEnzymology，2nd.Ed.Eds.，T.Godfrey和S.West，(1996)StocktonPress，NY。使用酸性真菌蛋白酶與葡糖澱粉酶相組合通過發酵生產乙醇的方法是已知的。例如，USP5,231,017公開了使用來源於黑麴黴的蛋白酶生產乙醇的方法，包括獲得液化的醪液並在糖化步驟期間將蛋白酶引入此液化醪液中，所述糖化步驟可以與發酵步驟合併在一起。在一些實施方式中，本發明的蛋白酶組合物將被用於在非熟化過程中用顆粒澱粉底物生產醇類例如乙醇，其中該過程是在低於用於生產醇類的底物中澱粉的糊化溫度的溫度下進行。而澱粉水解過程中所用的蛋白酶的數量將決定於蛋白酶的酶促活性。在一些實施方式中，該量將是加入到450g漿液中的範圍為0.001至2.0ml的2％蛋白酶溶液，所述漿液被調節至20-33％幹固體，其中該漿液在糖化作用期間和/或在水解的澱粉中為液化的醪。其它有用的範圍包括0.005至1.5ml以及還有0.01至1.0ml。0166用蛋白酶處理種子和穀粒為通過發酵過程生產麥芽和飲料提供了有利條件。0167同樣期望在糖化作用期間使用蛋白酶以便水解麵粉中的蛋白質，並因此在對隨後的醇類發酵階段的預期中富集含有可溶性氮的麥芽汁。穀物中增強的澱粉酶活性提高了發芽的速度和效率，這在麥芽製備過程中是重要的，其中生產的麥芽具有提高的酶促活性，從而導致澱粉被強化水解為可發酵的碳水化合物，因而，改善了醇類飲料例如啤酒和蘇格蘭威士忌生產過程中的發酵效率。0168在以下的實驗公開內容中，使用了下列縮略語eq(當量)；M(摩爾濃度)；μM(微摩爾濃度)；N(正常的)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；μg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(釐米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；℃(攝氏度)；h(小時)；min(分鐘)；sec(秒)；msec(毫秒)；Ci(居裡)；mCi(毫居裡)；μCi(微居裡)；TLC(薄層色譜)；Ts(甲苯磺醯基)；Bn(苯甲基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺醯基)；Et(乙基)、Me(甲基)、ds或DS(幹固體含量)、SAPU(酸性蛋白酶分光光度單位，其中1SAPU是在試驗條件下每分鐘從酪蛋白底物釋放1微摩爾酪氨酸的蛋白酶活性的量)以及GAU(葡糖澱粉酶單位，其被定義為在pH4.2和60℃條件下每小時從可溶性澱粉底物產生以葡萄糖計算的1g還原糖的酶量)。實施例0169下面的實施例進一步詳細描述了本發明，這些實施例的意圖並不在於以任何方式限制要求保護的本發明的範圍。附圖被認為是本發明的說明書和描述的一個完整部分。所有引用的參考文獻在此特意地併入作為參考，用於在此描述的所有內容。下列實施例被提供用於舉例說明所要求保護的發明，而並非限定所要求保護的發明。實施例1新型蛋白酶NSP24的裡氏木黴DNA克隆0170基因組DNA是從裡氏木黴菌株QM6a中提取的。根據在裡氏木黴基因組的疊連群1-5500中所發現的推定的蛋白酶序列，設計PCR引物(JointGenomeInstitute(JGI)T.reeseigenomev1.0)。正向引物包含用於定向克隆入pENTR/D載體(Invitrogen)的基序。0171afp6f引物的序列為CACCATGCAGACCTTTGGAGCT(SEQIDNO11)，而afp7r引物的序列為TTATTTCTGAGCCCAGCCCAG(SEQIDNO12)。根據InvitrogenGateway系統方案，通過凝膠提取方法來純化1.3kb的PCR產物(凝膠純化試劑盒(GelPurificationkit)，Qiagen)，並克隆進pENTR/D。0172然後，將載體轉化進帶有卡那黴素選擇標記的化學感受態Top10大腸桿菌(Invitrogen)中。將來自若干獨立克隆的質粒DNA用限制性酶消化，從而確認正確大小的插入片段。對來自若干克隆的蛋白酶基因插入片段進行測序(Sequetech，MountainView，CA)。將來自一個克隆的質粒DNA，pENTR/D_55.3與pTrex3g/amdS目的載體DNA加入LR克隆酶反應(InvitrogenGatewaysystem)中。pTrex3g載體基於大腸桿菌pSL1180(PharmaciaInc.，NJ)，其為pUC118噬菌粒基載體並在WO05/001036中有所描述。在LR克隆酶反應中進行的重組，用來自pENTR/D_55.3的裡氏木黴蛋白酶置換目的載體的CmR和ccdB基因。此重組將蛋白酶定向插入目的載體的cbh1啟動子和終止子之間。44和50bp的重組位點序列分別保留在蛋白酶基因的上遊和下遊。將LR克隆酶反應的等份試樣轉化進化學感受態Top10大腸桿菌中並過夜生長，用羧苄青黴素選擇。將來自若干克隆的質粒DNA用限制性酶消化以確認正確的插入片段大小。將來自克隆的質粒DNApTrex3g_55.3.1用XbaI消化以釋放出包括cbh1啟動子NSP24蛋白酶終止子amdS的表達盒。通過瓊脂糖凝膠提取法用標準技術純化此5.8kb盒，並將其轉化進裡氏木黴菌株，其來自於公眾可獲得的菌株QM6a(參見WO05/001036)。參考圖5、6和7。實施例2新型蛋白酶NSP25的裡氏木黴DNA克隆0173基因組DNA是從裡氏木黴菌株QM6a中提取的。根據在裡氏木黴基因組(JGIT.reeseigenomev1.0)的疊連群22-263400中所發現的推定的蛋白酶序列，設計PCR引物。正向引物包含用於定向克隆入pENTR/D載體(Invitrogen)的基序。0174afp8f引物的序列為CACCATGCAGCCCTCATTTGGCAG(SEQIDNO13)，而afp9r引物的序列為CTATTTCTTCTGCGCCCAGCCAAC(SEQIDNO14)。根據InvitrogenGateway系統方案，通過凝膠提取法來純化1.2kb的PCR產物(凝膠純化試劑盒(GelPurificationkit)，Qiagen)並克隆進pENTR/D。然後，將載體轉化進帶有卡那黴素選擇標記的化學感受態Top10大腸桿菌(Invitrogen)中。將來自若干獨立克隆的質粒DNA用限制性酶消化，從而確認正確大小的插入片段。對來自若干克隆的蛋白酶基因插入片段進行測序(Sequetech，MountainView，CA)。將來自一個克隆的質粒DNA，pENTR/D_22.2與pTrex3g/amdS目的載體DNA一起加入LR克隆酶反應(InvitrogenGatewaysystem)中。在LR克隆酶反應中進行的重組，用來自pENTR/D_22.2的裡氏木黴蛋白酶置換目的載體中的CmR和ccdB基因。此重組將蛋白酶定向插入目的載體的cbh1啟動子和終止子之間。44和50bp的重組位點序列分別保留在蛋白酶基因的上遊和下遊。將LR克隆酶反應的等份試樣轉化進化學感受態Top10大腸桿菌中並過夜生長，用羧苄青黴素選擇。將來自若干克隆的質粒DNA用限制性酶消化，以確認正確的插入片段大小。將來自克隆的質粒DNApTrex3g_22.2#1用XbaI(並用EcoRI消化以便將細菌骨架消化成小片段，其在電泳過程中與盒遷移開來)消化，以釋放出包括cbh1啟動子NSP25蛋白酶終止子amdS的表達盒。通過瓊脂糖凝膠提取法用標準技術純化此5.7kb盒，並將其轉化進裡氏木黴菌株，該菌株來自於公眾可獲得的菌株QM6a。除NSP24插入片段用NSP25序列替換外，用於轉化的質粒與圖7中舉例說明的質粒基本相同。實施例3木黴的PEG真菌轉化0175將來自形成孢子的菌絲體的平板的2cm2瓊脂塞(agarplug)接種於250ml4-擋板搖瓶中的50mlYEG肉湯中，並以200rpm在37℃培養16-20小時。通過將液體體積轉移入50ml錐形管中並在2500rpm下離心10分鐘來回收菌絲體。吸去上清。將菌絲體沉澱轉移入裝有40ml過濾除菌的β-D-葡聚糖酶(InterSpexProducts，Inc.)溶液的250ml0.22μmCACorning過濾瓶中，並在200rpm，30℃下溫育2小時。通過無菌Miracloth(CalBiochem，LaJolla，CA)，將菌絲體收集入50ml錐形離心管中，在2000rpm下離心5分鐘，抽氣。將沉澱用50ml1.2M山梨醇洗滌一次，再次離心，抽氣，並用25ml山梨醇/CaCl2洗滌。將原生質體用血細胞計數器計數、離心、抽氣，並重懸於山梨醇/CaCl2中，其體積足以產生1.25×108/ml的原生質體濃度。每一轉化反應使用200μl的等份試樣。將20μgDNA(＞1μg/ul)裝入15ml錐形管，並將錐形管放置於冰上。加入200μl原生質體。加入50μlPEG混合物，並輕輕混勻，在冰上溫育20分鐘。將2mlPEG混合物加入錐形管中，並在室溫下溫育5分鐘。將4ml山梨醇/CaCl2(總共6.25ml)加入到錐形管中。此轉化混合物被分為3等份，每一覆蓋物(overlay)～2ml。將2ml加入到熔化的乙醯胺山梨醇頂層瓊脂的試管中，並將覆蓋物混合物(overlaymixture)倒在乙醯胺山梨醇平皿上，用於選擇能夠依靠乙醯胺作為唯一的氮源來生長的轉化體。將平皿在28-30℃溫育，直至克隆出現。通過在乙醯胺培養基(無山梨醇的乙醯胺山梨醇配方)上對單個克隆重複傳代，轉化體得以純化。材料017640mlβ-D-葡聚糖酶溶液600mgβ-D-葡聚糖酶；400mgMgSO4·7H2O和40ml1.2M山梨醇。0177200mlPEG混合物50gPEG4000(BDHLaboratorySuppliesPoole，England)和1.47gCaCl2·2H2O，在MiIIiQ水中製成。0178山梨醇/CaCl21.2M山梨醇和50mMCaCl0179為了進行amdS選擇，使用乙醯胺山梨醇平皿和覆蓋物。為對孢子進行純化，使用同樣的平皿，但不含山梨醇。乙醯胺山梨醇瓊脂(培養板和頂層瓊脂)0180乙醯胺(Aldrich99％經升華的)0.6g/L；CsCl1.68g/L；葡萄糖20g/L；KH2PO420g/L；MgSO4·7H2O0.6g/L；CaCl2·2H2O0.6g/L；1000×鹽(參見下文)1ml。將pH調至5.5並將體積定容至300ml。用0.22微米濾膜過濾除菌並在烘箱中加熱至55℃。0181向700ml水中加入Noble瓊脂(低熔點用於頂層瓊脂)20g和山梨醇218g，然後高壓滅菌。將此混合物冷卻至55℃，並加入濾膜除菌的乙醯胺混合物。倒入平皿和試管。1000×鹽——FeSO4·7H2O(0.5g/100ml)；MnSO4·H2O(0.16g/100ml)；ZnSO4·7H2O(0.14g/100ml)；CoCl2·6H2O(0.1g/100ml)，並用0.22微米濾膜過濾除菌。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA，DifcoDehydratedCultureMedia)——馬鈴薯，來自200g/L的浸液；葡萄糖20g/L和瓊脂15g/L在50-80％終體積的dH2O中充分混合，然後定容至100％終體積。將此混合物高壓滅菌，冷卻至55℃並傾倒。為了製成用於pH3.5培養基的1％脫脂奶瓊脂，如上製備PDA，並向100ml熔化的PDA中加入1.8ml的10％酒石酸和12.5ml滅菌的8％脫脂奶，並鋪板。為了對脫脂奶進行預滅菌，將8％脫脂奶(Difco)在122-123℃下高壓滅菌10分鐘，暴露期間的室壓為32-35psi。取出混合物，冷卻至室溫並在室溫下儲存。0182在搖瓶中生長3天後的轉化體中，評估蛋白酶的表達。用瓊脂塞接種裡氏木黴培養基(Davis等，(1970)MethodsEnzymol.1779-143)。將培養物在30℃下搖動培養3天。使培養肉湯通過0.22微米濾膜，並將濾液點到1％脫脂奶瓊脂上。經過在室溫下過夜培養，觀察到清澈的區帶。實施例4NSP24、NSP25和L388MPeoA的PH活性圖0183PepA(野生型和L388M)、NSP24和NSR25在裡氏木黴菌株中均過量表達，它們的pH活性圖，使用獲自MolecularProbes(EnzChekPorteaseKit-Greenfluorescence)的螢光標記的酪蛋白試驗進行測定。PepA(野生型和L388M)和NSP是全發酵樣品，而NSP24是在50％甘油中穩定化的純化蛋白。將該酶稀釋為1.0mg/ml、0.5mg/ml和0.25mg/ml。螢光標記的底物在DIH2O中被稀釋為0.1mg/ml。將10ml底物加入50ml各種pH的緩衝液和30ulDIH2O中。通過加入10ml酶啟動反應，並在加入100ul1.0MpH10的磷酸鹽中止反應前使其繼續進行不同的時段。用485激發光在538nm發射處測量樣品的螢光，並在SpectraMAXEM螢光板讀數器中在530nm將發射光用濾鏡截止。NSP24在pH3.7下具有最適活性，野生型PepA在pH3.4下具有最適活性，而L388MpepA在pH3.5下具有最適活性。NSP25在pH4.6下具有最適活性。實施例5在實驗室發酵中裡氏木黴NSP24蛋白酶與GC106的比較0184當今乙醇工業中所使用的標準蛋白酶是由GenencorInternational，Inc.商業銷售的蛋白酶GC106。在糖類降解、葡萄糖形成以及乙醇生產方面，將NSP24的功能性與GC106進行比較。材料DistillaseL-400(Lot#107-04057-901，372GAU/g)GC106(Lot#A01-01300-001，1010SAPU/g)NSP24(Lot#20040423，1165SAPU/g)RedStarRedYeast來自乙醇生產商的醪液和稀釜餾物(MashandThinStillage)(玉米)方法0185從乙醇生產商獲得醪液和稀釜餾物(MashandThinStillage)(在發酵前，也被稱為大淺盒(backset))，並混合至26.5白利(brix)。將pH用1NHCL調至pH4.3。然後將樣品分為3-300克的等份試樣並放入32℃水浴中。平衡後，加入下列酶組合表20186DISTILLASEL-400是來源於黑麴黴的液體葡糖澱粉酶，其可以從GenencorInternationalInc.購得。在加入酶後，加入1.00克/瓶的RedStarRedYeast。在16、24、40和48小時取樣並離心。將500ul每一樣品放入裝有50ul1.1NH2SO4的試管中以停止反應。2分鐘後，將樣品用4.5mlDIH2O稀釋並混合。混勻後，使樣品通過0.45微米濾膜並放入HPLC瓶中進行分析。通過HPLC(PhenomenexRezex8u)分析樣品。結果在圖1-4中列出。NSP24的表現與GC106相似。實驗室6在非熟化過程中NSP24對碎玉米的乙醇產量的影響0187用DIH2O製成碾碎的玉米的30％DS漿液。該碾碎的玉米是典型的用於乙醇工業的#2黃色馬齒形玉米樣品，其被粉碎以使70％以上將通過30目篩。穀粒的含水量用OHAUS，MB35Halogenmoisturebalance(MB35滷素水份平衡)(NJ)進行測量。用6NH2SO4將pH調至4.2。在125ml裝有100g醪液的燒瓶中進行發酵，其中含有1.0GAU/g劑量的STARGEN001並含有或不含有0.5kg/MT劑量的NSP24。0188在45ml水中製備5gRedStarEthanolRed乾酵母(LesaffreyeastCorporation，Milwaukee，WI)，並在接種至發酵罐前在32℃水浴中混合1小時。向每一125ml燒瓶中加入0.5ml酵母漿液。將燒瓶放入32℃水浴中並溫和混合此醪液。在發酵期間，取出樣品進行HPLC分析。(HPLC柱PhenomenexRezex有機酸柱(RHM-Monosaccharide)#00H0132-KO；柱溫60℃；流動相0.01NH2SO4；流速0.6ml/min；檢測器RI；注射體積20uL。72小時後停止發酵。在不同採樣間隔的化合物產量，包括糖類、乳酸、甘油和乙醇，在下表3中表示，其中+表示NSP24被加入燒瓶中，而--表示NSP24未被加入燒瓶中。經測量，所有樣品的乳酸在大約0.01至0.02％w/v之間，而DP-2則測定為0.0。在24小時，乙酸被測定為大約0，而在71小時，對於所有樣品在0.03至0.04之間。表3實施例7使用玉米胚乳進行乙醇生產中不同蛋白酶的比較0189使用胚乳(除菌玉米，75.8％澱粉，99.5％的顆粒大小＜30目)作為顆粒澱粉底物製得29.5％的DS醪液。將一百克每一醪液轉移至125ml燒瓶，並將培養基的pH調至pH4.5。將蛋白酶(NSP24；中性蛋白酶(MULTIFECTNEUTRAL，PROTEINASE-T)和鹼性蛋白酶(SPEZYMEFAN，PROTEX6LMULTIFECTP-3000和PROTEASE899(GenencorInternational))以0.5kg/MT加入，隨後以2.5Kgs/MT加入STARGEN001(GenencorInternational)澱粉。然後用0.5ml20％酵母(RedStarEthanolRed)接種燒瓶，並放入水浴中保持在32℃。在溫育過程中將燒瓶的內容物連續攪拌以獲得均勻的混合。在不同的時間間隔取樣進行HPLC分析。測定72小時發酵罐肉湯中DDGS的殘留澱粉和蛋白質含量。乙醇生產的結果在下表4中表示。表4權利要求1.一種分離的NSP24家族蛋白酶，其與SEQID10具有至少85％的胺基酸序列同一性。2.權利要求1所述的分離的NSP24家族蛋白酶，其與SEQID10具有至少90％的胺基酸序列同一性。3.權利要求2所述的分離的NSP24家族蛋白酶，其與SEQID10具有至少95％的胺基酸序列同一性。4.權利要求3所述的分離的NSP24家族蛋白酶，其與SEQID10具有至少97％的胺基酸序列同一性。5.一種分離的多核苷酸，其編碼NSP24家族蛋白酶。6.權利要求5所述的分離的多核苷酸，其中所述分離的核酸編碼NSP24蛋白酶，其與SEQID2具有至少85％的序列同一性。7.權利要求6所述的分離的多核苷酸，其具有SEQID8的序列。8.一種載體，其包括權利要求5所述的多核苷酸。9.一種宿主細胞，其用權利要求5所述的多核苷酸轉化。10.權利要求9所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是絲狀真菌細胞。11.權利要求10所述的宿主細胞，其中所述絲狀真菌細胞是麴黴屬某些種(Aspergillusspp.)、鐮刀菌屬某些種(Fusariumspp.)或者木黴屬某些種(Trichodermaspp.)。12.權利要求11所述的宿主細胞，其中所述麴黴是黑麴黴(A.niger)、米麴黴(A.oryzae)、構巢麴黴(A.nidulans)或者泡盛麴黴(A.awamori)。13.權利要求11所述的宿主細胞，其中所述木黴是裡氏木黴(T.reesei)。14.權利要求10所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是四重缺失的宿主細胞。15.一種產生蛋白酶的方法，包括a)向宿主細胞中導入多核苷酸，其包括被可操縱地連接於編碼NSP24家族蛋白酶的核酸的啟動子，b)將所述宿主細胞在適於表達和產生NSP24家族蛋白酶的培養條件下培養，並c)產生所述NSP24家族蛋白酶。16.根據權利要求15所述的方法，進一步包括回收所述產生的蛋白酶。17.一種分離的母體NSP24家族蛋白酶的生物學活性片段。18.權利要求17所述的分離的生物學活性片段，其中所述母體NSP24家族蛋白酶與SEQIDNO2具有至少90％的序列同一性。19.權利要求17所述的分離的生物學活性片段，其中所述片段具有NSP24蛋白酶的至少40％的活性，所述NSP24蛋白酶具有SEQIDNO2或者SEQIDNO10。20.一種酶組合物，其包括權利要求1所述的NSP24家族蛋白酶。21.一種酶組合物，其包括權利要求17所述的NSP24家族蛋白酶的生物學活性片段。22.權利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物是清潔組合物。23.權利要求22所述的酶組合物，其中所述清潔組合物是去汙劑組合物。24.權利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物是澱粉水解組合物。25.權利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物是動物飼料組合物。26.權利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物被用於乙醇生產過程。27.權利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物被用於澱粉糖化過程。28.權利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物被用於麥芽糖或果糖的生產。29.權利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物是個人護理組合物。30.權利要求20所述的酶組合物，進一步包括葡糖澱粉酶。31.權利要求21所述的酶組合物，進一步包括葡糖澱粉酶。32.權利要求20所述的酶組合物，進一步包括α澱粉酶。33.權利要求21所述的酶組合物，進一步包括α澱粉酶。34.權利要求33所述的酶組合物，進一步包括葡糖澱粉酶。35.一種水解澱粉的方法，包括將含澱粉底物與權利要求20所述的酶組合物在適於澱粉水解的條件下接觸，並獲得水解的澱粉。36.分離的PepA蛋白酶，其具有SEQIDNO7。37.一種分離的多核苷酸，其編碼權利要求36所述的蛋白酶。38.權利要求37所述的多核苷酸，其具有SEQIDNO5。39.一種分離的NSP25家族蛋白酶，其與SEQIDNO9具有至少90％的序列同一性。40.一種分離的多核苷酸，其編碼權利要求39所述的NSP25蛋白酶。全文摘要本發明涉及新型酸性蛋白酶，更具體地涉及NSP24家族蛋白酶和NSP25家族蛋白酶，包括它們的生物學活性片段，並涉及編碼所述蛋白酶的核酸分子。同樣提供了包括編碼所述蛋白酶的核酸序列的載體和宿主細胞，生產所述蛋白酶的方法，酶組合物以及使用所述蛋白酶的方法。文檔編號C12N5/10GK101094918SQ200580045498公開日2007年12月26日申請日期2005年12月20日優先權日2004年12月30日發明者K·A·克拉森,N·鄧恩－克萊曼,S·E·蘭特斯,C·E·皮爾格林,P·范索林格恩,M·沃德申請人:金克克國際有限公司