檢測蛋白酶的活力的製作方法
2023-12-10 02:28:21 5
專利名稱：檢測蛋白酶的活力的製作方法
技術領域：
本發明涉及檢測液體樣品中至少一種蛋白酶活力的方法以及實施這種方法的裝
置，所述液體樣品中除了含有需要測定其活力的至少一種蛋白酶之外，還含有該蛋白酶相對應的至少一種蛋白酶抑制劑。
背景技術：
檢測組織勻漿液或如血清等體液中酶的濃度，可以採用酶法測定和免疫測試(例如ELISA)。 醫學文獻報導溶酶體蛋白酶參與腫瘤生長、腫瘤侵潤和代謝，例如半胱氨酸蛋白
酶組織蛋白酶B、H和L。在這些過程中，能證明如組織蛋白酶B整合到原生質膜上並且分
泌到胞外空間中，而在胞外空間中這些蛋白酶參與降解和分解胞外基質。 在患有各種不同癌症的腫瘤患者中，受腫瘤影響的組織和體液(血液、尿、唾液、
腦脊髓液等)中出現蛋白酶的活力上升，這些蛋白酶可以作為非常有效的腫瘤標記物，這
樣一方面可以有助於這些疾病的診斷和預後，另一方面可以作為治療幹預的出發點。例
如，文獻中已經討論用組織蛋白酶B(—種半胱氨酸蛋白酶)作為腫瘤標記物(Cancer
Research 2005， 65 (19) ， 2005年10月1日，第8608頁，Kopitz等)。 非常需要有一種檢測組織和體液中這些酶含量的可靠檢測方法。 理論上來說，免疫測定方法(如ELISA)和酶活力測試可以用於檢測生物樣品中酶
的濃度。 例如，從Kos等的文章(Clinical Cancer Research第3巻，1815-1822， 1997年
10月(Kos等))中，已經知道能用ELISA方法(免疫學測定)檢測組織蛋白酶B。 本文所討論的酶是蛋白酶，其具有以下兩個在測定其濃度時所必須考慮的特性 1.在生物樣品中，蛋白酶總是與它們的前體(即它們的酶原)共同存在。 2.在生物樣品中，蛋白酶部分或完全地被它們內源性的抑制劑所抑制。 根據血清實驗，如果要檢測組織蛋白酶B的活力，在檢測酶活力之前必須先進行
去抑制。 用免疫學方法來檢測樣品中這些蛋白酶的量，由於方法本身的原因，只能測定活性酶、被抑制的酶、變性的酶和酶原的總量。 然而，如果在生物樣品中同時存在活性酶和被抑制的酶兩種形式，採用本發明涉
及酶活力檢測的方法和裝置，可以分別測定活性酶和被抑制的酶的活力。 在專利EP0776374中公開了用於測定如組織勻漿液等生物樣品中酶活力的方法
和裝置，其中列舉了通過將生物樣品通過裝滿了共價結合有木瓜蛋白酶的瓊脂糖凝膠的親
和層析柱，從而將屬於胱抑素超家族的內源性抑制劑從組織蛋白酶中去除。木瓜蛋白酶也
屬於半胱氨酸蛋白酶，其對胱抑素的結合親和力比組織蛋白酶更強，所以木瓜蛋白酶可以
從組織蛋白酶上拉走抑制劑。 在如ELISA等免疫學測試中，利用抗體特異性地檢測樣品中的酶。儘管免疫學測試通常要比酶法測試靈敏度更高，但抗體不能區分活性酶、被抑制劑抑制的酶、酶原和變性 的酶，例如對半胱氨酸蛋白酶而言。由於在測定生物樣品中的酶時，通常主要考慮酶的活 力，因為酶的活力將最終觸發或催化生物學行為，前面提到的測試結果中的許多免疫學測 試的意義都不足以用於醫學分析和診斷。 文獻報導中，通常採用螢光發光底物(AMC)來檢測組織樣品(勻漿液)中的組織 蛋白酶活力。 然而，也有用AMC來檢測體液(腦脊髓液)中組織蛋白酶活力。在這兩種檢測中都採用了螢光發光底物Z-Arg-Arg-AMC，而沒有去除抑制劑。 在上述文獻報導的結果中證明，作者相信他們檢測了組織樣品和體液中的組織蛋
白酶總量。 然而，對組織樣品而言，只有在成功地去抑制之後，才能用酶法測定活性酶和被抑 制的酶的總量。 其他引文中報導了對血清中酶活力的檢測。 Skrzydlewska，E.等，"評估血清中組織蛋白酶B和D與大腸癌臨床病理分級之間 的關係"(World J. Gastroenterol. 2005， 11 (27)，第4225-4229頁)中，描述了用酶法檢測 血清中的組織蛋白酶B，從Bz-DL-精氨酸-pNA上酶切除對硝基苯胺(pNA)，通過採用光學 檢測方法測定來檢測酶的活力。 Siewinski， M.等，"比較孕婦血清中半胱氨酸肽酶活力及其抑制劑"(Pakistan Journal of Medical Sciences, 2004， 20 (4)，第381-384頁)中，描述了使用螢光測定法測 定組織蛋白酶B的酶活力，其中從底物Z-Arg-Arg-AMC上切下螢光發光的AMC(7-氨基-4 甲基香豆素)。 然而，在上述兩個案例中，並沒有進行特異性抑制劑的對照實驗來證明這些釋放 的螢光團確實是由半胱氨酸蛋白酶或組織蛋白酶B引起的。在兩個案例中都沒有在活力檢 測前去除抑制劑。 在我們的對照實驗中，採用了半胱氨酸蛋白酶的特異性抑制劑E64和組織蛋白酶
B的特異性抑制劑CA-074 (這兩種抑制劑都是合成的抑制劑並且市場有售)，發現只有在去
抑制之後，才能在腫瘤患者和有遺傳病家族史的健康人的血液中檢測屬於組織蛋白酶B的
蛋白酶活力，因此血清中的所有組織蛋白酶B都被半胱氨酸蛋白酶抑制劑所抑制。 然而，當用組織樣品作為測定蛋白酶活力的生物樣品時，其缺點在於只有通過外
科手術或活組織檢查(為了腫瘤早期診斷而採用的一種困難的取樣方法)才能獲得樣品。
通常在已經診斷為腫瘤或至少根據某些指數能有理由假設存在腫瘤的階段，才提取組織樣
品。因此需要有一種方法能夠檢測例如血液、或尿或唾液等容易取得的生物樣品中的蛋白
酶濃度。然而，顯然很多可以作為標記物(尤其是腫瘤標記物)的蛋白酶在血液中是被各
自的抑制劑所抑制的。 發明目的 本發明的目的是獲取一種方法以及實施該方法的可行裝置，以簡單的方式(並且 對於相關疾病的早期診斷比本領域的現存方法準確性更高，無論如何都要有足夠的準確 性)能可靠的檢測生物樣品或液體(尤其是血清)中的蛋白酶濃度，所述檢測也包括與內 源性抑制劑結合而被抑制的這些蛋白酶。這樣做的話，沒有能檢測到蛋白酶的變性形式和酶原。
發明內容
本發明的任務可以通過權利要求1的特性以及與權利要求1相關聯的權利要求11 和12的特性得以解決，權利要求1的特性如下 測定液體樣品中至少一種蛋白酶的活力的方法，所述樣品中除了需要測定活力的 至少一種蛋白酶之外，如有必要，還含有所述蛋白酶相對應的至少一種蛋白酶抑制劑，該方 法包含下列步驟 通過將樣品與以共價或者吸附方式結合了抑制劑結合物質的載體相接觸，去除樣 品中蛋白酶上的蛋白酶抑制劑，所述抑制劑結合物質對蛋白酶抑制劑的親和/結合強度要 高於蛋白酶本身； 從樣品中將載體以及載體上結合的蛋白酶抑制劑一起分離出來； 向樣品中加入所述需要測定活力的至少一種蛋白酶的底物，並且記錄底物與蛋白
酶的蛋白水解反應； 權利要求11和12的特性如下 在本發明的一個實施方式中，所述至少一種蛋白酶選自半胱氨酸蛋白酶家族，優 選於組織蛋白酶B、H、K、L和/或S。所述至少一種蛋白酶尤其優選為組織蛋白酶B。
從醫學角度來說，檢測組織蛋白酶B相當重要，因為文獻中已經論證了可以用血 液中組織蛋白酶B的濃度上升作為腫瘤的標記物(參見上文)。 在本發明的另 一個優選實施方式中，液體樣品為血液樣品、血漿或血清。更優選以
血清作為液體樣品。在本發明的一個可選實施方式中，液體樣品為尿或唾液。 在本發明方法的另一個實施方式中，所述至少一種蛋白酶的底物包括一個C-端
直接或通過連接基團結合有螢光發光團的二肽或寡肽序列，所述螢光發光團可被蛋白酶切
下。在本方法中，螢光發光團在蛋白水解反應的過程中被切下，優選從二肽或寡肽序列上被切下。 被半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶B識別並且切割的二肽序列的例子有精氨酸_精氨 酸(Arg-Arg)。因此，例如Z-Arg-Arg-AMC是合適的底物，其中Z代表結合在肽序列N-端的 保護基團。 根據本發明，優選包含二肽或寡肽序列和螢光發光團的未切割底物的螢光發射波
長最大值與在蛋白水解反應中被蛋白酶切下的螢光發光團的螢光發射波長最大值相差至
少20nm，優選至少40nm或至少60nm或至少80nm，尤其優選至少100nm。(如果發射光譜沒
有明顯的最大值，也可以用發射光譜的代表值(例如統計學代表值))。 如果未切割底物和切下的螢光發光團的螢光發射波長或波長最大值是相同的，或
者兩者相當接近，那麼未切割底物的自身螢光和切下的螢光發光團的螢光發射都在檢測中
被記錄了下來。這些螢光發射波長相同的底物和螢光團是本領域已知的。即使螢光發射波
長一致，如果螢光發光團在同一或相近波長的螢光發射強度要顯著強於未切割底物，還是
可以用這些底物進行測定的。(在這種情況下，通過分析與不含有酶的陰性對照相比的信號
放大，可以定量酶活力)。這些底物的缺點在於，只有當酶活力強因而螢光發射能有相當顯
著的提高的情況下，才能得到明顯的結果。因為在酶活力弱的情況下，通常信號太弱，不足以與未切割的底物的自身螢光區分開來。因此，信號被背景噪音所掩蓋或者至少不能以顯 著的方式從中凸顯出來。 底物和切下的螢光發光團的螢光發射間檢測波長的變換具有特定的優勢，因為在
該波長下只有從底物上切下的螢光發光團被記錄了下來，從而只有確實發生的酶反應被記
錄了下來。切下的螢光團的發射波長與底物的螢光發射波長的變化越大，對蛋白酶活力檢
測的靈敏度越高。只有在加入底物後，被切下的螢光發光團的濃度開始隨時間線性增高。 用AMC-底物檢測血清中蛋白酶活力的情況下，由於在酶切下的AMC-螢光發光團
的檢測波長460nm下血清本身具有很強的自身螢光，使得問題更加複雜化。 我們的實驗中，通過用螢光分析儀和AMC底物檢測微孔板中血清內組織蛋白酶B
的活力，結果清楚地表明在460nm下給定的檢測時間內沒有信號從背景螢光中凸現出來，
在這個波長下背景螢光是血清的自身螢光和轉而被血清部分淬滅的AMC-底物自身螢光的總和。 然而，令人驚奇的是，用AFC底物，隨著酶反應的進行在508nm檢測信號出現線性 增高，這是由在酶反應中被切下的AFC-螢光發光團產生螢光發射引起的。
在AFC-螢光發光團的螢光發射波長508nm，血清的自身螢光要遠遠小於在460nm， 並且在508nm AFC-底物的自身螢光為零。 因此，在這樣的檢測條件下，用AFC-底物檢測血清中的組織蛋白酶B活力要比用 AMC-底物靈敏度高至少IO倍，而且至此才可以用螢光分析儀來檢測血清中組織蛋白酶的 活力。 因此，本發明的更優選底物為帶有螢光發光團7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC) 的Z-Arg-Arg-AFC(市場有售)。 Bissell， E. R.等，"7_氨基_4_(三氟甲基)-香豆素及其胺基酸和肽衍生物的合 成和化學性質"(J. Org. Chem. 1980， 45，第2283-2287頁)，講述了螢光發光底物AFC (7-氨 基-4-三氟甲基-香豆素)的合成。 例如，用C-端共價結合了螢光團7-氨基-4-三氟甲基香豆素的二肽Arg-Arg製成 的底物適用於檢測半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶B的濃度。該底物的二肽Arg-Arg的N_端 有保護基團Z。該底物也可用下式Z-RR-AFC表示。而底物Z-RR-AFC底物的螢光發射波長 為約400nm，純螢光團AFC的螢光發射波長為505nm。 此外，還可以使用螢光團7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)連接到二肽Arg-Arg上 的Z-RR-AMC，用於組織蛋白酶B的活力檢測。然而，這個底物具有前面說過的缺點，即底物 Z-RR-AMC和未結合的螢光發光團AMC的螢光發射波長都是同一波長即約460nm。在這種情 況下，只有通過信號的強度才能區分未切割的底物和切下的螢光團，而不能通過發射波長 區分。在某些情況下，在預先去抑制之後，檢測的靈敏度的足夠的，尤其是如果樣品中的酶 濃度較高(如組織樣品)或樣品體積較大。當採用AMC時，使用螢光計(激發輻射和發射 輻射間成90。)有額外的優勢，因為與發射光方向上的檢測(螢光分析儀)相比，它的靈敏 度更高。 在專利EP0776374中，公開了對液體樣品中蛋白酶去抑制的方法和裝置。將液體 樣品流過一個裝滿了共價結合了抑制劑結合物質的瓊脂糖凝膠柱。在連續親和層析中，樣 品酶-抑制劑複合物中的抑制劑傳遞給抑制劑結合物質，而含有不帶抑制劑的酶的樣品從柱上被洗脫，可轉而用於活力檢測。 由於瓊脂糖膠(agarose gel)對蛋白的非特異性吸收要比瓊脂糖凝膠(s印harose gel)少，所以將瓊脂糖膠用於親和層析分離抑制劑，在隨後檢測酶活力的測定靈敏度方面 有相當優勢。 然而，用以共價或非共價(吸附)方式結合了抑制劑結合物質的剛性載體來代替
瓊脂糖凝膠或瓊脂糖膠則更有優勢。由於剛性載體易於操作和應用，用箔或膜作為抑制劑
結合物質的載體具有決定性的優勢。箔或者膜形式的剛性載體，可以通過將載體浸沒到樣
品中很容易的與樣品相接觸，而不需要如液流過柱等精心製作的裝置和組合。 在去抑制之後，可以從樣品中取出已經轉移上抑制劑的結合有抑制劑結合物質的
剛性載體。 抑制劑結合物質可以通過共價或者吸附的方式結合到剛性載體上。在將剛性載體
與液體樣品相接觸的情況下，使用共價結合了抑制劑結合物質的載體尤其有優勢，因為抑
製劑結合物質不會從剛性載體上釋放出來進入到樣品中並且誤導測試結果。 載體可以是能夠以共價或吸附方式足夠強地結合抑制劑結合物質的任何材料，所
述抑制劑結合物質通常是肽或蛋白質。 在本發明的優選實施方式中，載體包括尼龍或硝酸纖維素或由上述材料製成。能 以共價或非共價方式結合複合物(尤其是肽或蛋白質)的合適的尼龍或硝酸纖維素箔或膜 在市場上有售。 需要根據待測的蛋白酶和樣品中存在的一種或數種抑制劑來選擇抑制劑結合物 質；這個選擇並不是確定的。半胱氨酸蛋白酶家族具有下列特性它們的抑制劑對植物蛋 白酶木瓜蛋白酶要比對組織蛋白酶B的親和力更高、結合強度更大，這也被我們的實驗所 證實。 因此，從樣品中去除抑制劑，可以用很簡單的方法在臨床實驗室的微孔板中實現， 也可以不很費力地在醫學實踐中(從血清中)立刻實現。 因此，從樣品中去除抑制劑，可以在臨床實驗室中很容易的實現，也可以在醫學實
踐中立刻不很費力的實現。尤其優選抑制劑結合物質共價結合到載體上。 將剛性載體與液體樣品相接觸，不存在抑制劑結合物質從固體載體上釋放出來、
進入到樣品中並且可能誤導檢測結果的危險。載體可以是能夠適用於以共價或吸附方式足
夠強地結合抑制劑結合物質的任何材料，所述抑制劑結合物質通常是寡肽或蛋白質。 抑制劑結合物質是根據待檢測的蛋白酶和樣品中存在的一種或多種抑制劑來進
行選擇的，這個選擇並不是確定的。半胱氨酸蛋白酶家族具有以下特性它們的抑制劑對植
物蛋白酶木瓜蛋白酶要比對組織蛋白酶B的親和力更高、結合強度更大。 下面用具體的實施方式和比較實驗進一步描述和闡明本發明。螢光團和螢光發光
團具有相同的含義。
實施例 用血液或血清中的溶酶體半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶B的實施方式或實驗進一
步闡明本發明。
檢測結果
a、檢測組織蛋白酶B的催化活力
al、導言 組織蛋白酶B的活力檢測基於二肽底物的切割
Z-Arg-Arg-螢光團一Z_Arg-Arg+螢光團
(Z =保護基團；Arg =鹼性胺基酸精氨酸) 在螢光方法檢測組織蛋白酶B活力的靈敏度檢測中採用了 2種不同的螢光團，稱 為AMC(Biomol)和AFC (Biovision)。 游離的AMC與底物在相同的波長發出螢光，但是螢光量子產率更高。因此催化切 割伴隨著螢光的增高。 基於AFC的方法靈敏度更高。該靈敏度的提高是由於游離螢光團的螢光波長與底
物波長之間的差異。這樣，底物的螢光可以從記錄中被消除，並且獲得更小的"背景螢光"。 —般而言，將下列差值的倍數定義為活力檢測的靈敏度 Z X (檢測讀數_背景值) 檢測讀數必須是"顯著地"不同於背景。 a2、活性檢測 用螢光分析儀進行96孔微孔板的螢光檢測(AMC檢測激發光355nm，螢光450nm) (AFC檢測激發光400nm，螢光508nm) 在AMC方法中，測試反應是室溫下在微孔板中進行的，為了避免蛋白結合到塑料 上，該微孔板預先用白蛋白孵育進行脫敏。 在AFC方法中，對測試樣品檢測活力的測試是在37t:下進行的。在檢測螢光前才 將測試樣品轉移到微孔板中。 a3、游離螢光發光團AMC和AFC的螢光與濃度線性相關。
結果AMC和AFC的螢光與所用測試的輪數/設備(r2 = 0. 9999)成線性
a4、對這兩種底物而言，純化的組織蛋白酶B的活力與酶的濃度線性相關。
結果純化的組織蛋白酶B活力的檢測讀數與所用的酶的濃度成正比。
a5、檢測活力與反應時間線性相關 結果在兩輪測試中測試90分鐘內從底物上釋放的螢光團呈線性增加。
b、人血清中存在組織蛋白酶B的抑制劑 用純化的組織蛋白酶B檢測沒有病理學表現的人血清中是否存在組織蛋白酶B的 抑制劑。 結果隨著("正常")人血清濃度的上升，純化的組織蛋白酶B的表觀活力顯著下 降(當有10%血清存在時，最大達到< 40%，參見圖2a)。 由於血清的自吸收/光散射作用引起螢光淬滅，在有10%血清的情況下導致螢光 降低30-35%，這已經通過血清對游離AMC螢光的影響得到驗證(參見圖2b)。
然而，在沒有血清的情況下，可以用AMC系統進行檢測。
c、胱抑素A對組織蛋白酶B的抑制 在兩個不同的組織蛋白酶B濃度下，體外測試已知抑制劑胱抑素A對組織蛋白酶 B的抑制作用。 結果胱抑素A的抑制作用對組織蛋白酶B濃度的依賴很小(圖3)。
d、通過用固定化的木瓜蛋白酶處理解除胱抑素A對組織蛋白酶B抑制作用的研允。 固定化的木瓜蛋白酶(共價結合的交聯的6%瓊脂糖小球，裝載有木瓜蛋白酶) 預處理一份懸浮液用5-10份測試緩衝液洗滌5次，用離心法分離上清。在最後一步洗滌步驟之後，用吸水紙小心地吸乾沉澱物，然後用測試緩衝液重懸到原來懸浮液的體積。 注意原則上，必須區分最初所述的用木瓜蛋白酶處理純化的組織蛋白酶B，以及
後來所述的在室溫和較短時間進行的血清樣品的處理。
dl、處理的實施 將各自體積的50%木瓜蛋白酶-瓊脂糖懸浮液轉入聚丙烯管內，用離心分離固體相，小心地用移液管和吸水紙去除上清液。向固化相中加入160 i！ 1酶溶液並進行孵育。
然後進行離心，取上清液轉入測試中(可以轉入預處理的微孔板或轉入0.5ml管)。向上清液中加入一定體積的緩衝液-底物溶液，並且孵育120分鐘，然後進行螢光測定。 d2、在木瓜蛋白酶存在下組織蛋白酶B穩定性與時間的關係。 在固定化的木瓜蛋白酶存在下研究組織蛋白酶B的穩定性，條件是4t:、120分鐘(圖4)。 結果實施組織蛋白酶B的處理時，固定化的木瓜蛋白酶的量要儘可能少，而且時間要儘可能短。 d3、通過用固定化的木瓜蛋白酶處理，解除胱抑素A對組織蛋白酶B的抑制作用 在兩個獨立實驗中(每輪測試中採用5和10ng組織蛋白酶B，復孔進行測試)，通
過提高固定化的木瓜蛋白酶的濃度，研究特異抑制劑胱抑素A對組織蛋白酶B的抑制作用
的解除，胱抑素A濃度為700nM。在這個抑制劑濃度下，抑制作用> 95%。 在兩個實驗中，加入100iU沉澱的凝膠/測試(對應於200iU懸浮液，如圖中所
示)，就可以實現抑制作用的完全解除(圖5)。 結論用合適量固定化的木瓜蛋白酶處理，可以解除特異性抑制劑胱抑素A對組織蛋白酶B的抑制作用。 e、血清組分對組織蛋白酶B的抑制作用、以及用固定化的木瓜蛋白酶處理解除該抑制作用 el、在存在或不存在正常人血清的情況下，組織蛋白酶B濃度與螢光的相互關係
在不存在血清的情況下，來自外源性組織蛋白酶B的測試信號的線性增高與加入的組織蛋白酶B的量有關(圖6)。而在血清存在(佔測試體積的比例為50%或25% )的情況下，也可以觀測到線性相關性，但是增高量只是不存在血清的條件下增高量的約25%。
因此，在低濃度的組織蛋白酶B條件下，能夠觀測到血清引起的酶活力的顯著抑制。 e2、用固定化的木瓜蛋白酶處理，解除對血清中組織蛋白酶B活力的抑制作用
在沒有預處理的條件下，用AFC測試系統測得血清中的"自發性"蛋白酶活力為0. 12±0.02納摩爾/分鐘/毫升。在用固定化的木瓜蛋白酶孵育15分鐘後，活力提高係數為1. 9±0. 4，中間值達到0. 23±0. 03。如果測試中組織蛋白酶活力小，約為0. 5納摩爾/分鐘/毫升(即幾乎被完全抑制)。然而，在用木瓜蛋白酶處理後，能完全測到標稱活力0. 52納摩爾/分鐘/毫升。 血清含有能抑制內源性的組織蛋白酶B等蛋白酶以及加入的外源性組織蛋白酶B的組分。通過用木瓜蛋白酶處理，可以從血清中去除這些抑制組分。 e3、半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64或組織蛋白酶B抑制劑對自發性或恢復活力的蛋白酶活力的作用 使用半胱氨酸蛋白酶的非特異性抑制劑E64或組織蛋白酶B抑制劑CA-074，測定組織蛋白酶B的活力來說明這些蛋白酶的性質。 在使用和不使用固定化的木瓜蛋白酶進行預處理的兩份"正常"人血清中檢測低濃度的組織蛋白酶B的酶活力(圖7)。 如其他相似實驗中可見，預處理15分鐘，導致組織蛋白酶B活力降低約15% 。組
織蛋白酶B的活力被這兩種抑制劑完全抑制(進行或不進行預處理)。(為了能夠客觀地
評價檢測的靈敏度，在圖示中並沒有從測試讀數中減去背景螢光的檢測值)。 不經預處理，在兩種血清中都檢測到了少量蛋白水解活力。這些活力即不被E64
也不被CA-074所抑制。因此，它們不能被歸為組織蛋白酶B，並且可能也不能歸為其他半胱
氨酸蛋白酶。 用固定化的木瓜蛋白酶預處理，使得兩種血清中的蛋白酶活力增高。E64和CA074
都能將這種活力降低到未被預處理的樣品的檢測值。
結論 不經過固定化的木瓜蛋白酶預處理(即不經過去抑制)，在兩種血清中都檢測不到組織蛋白酶B的活力。 e4、固定化木瓜蛋白酶對血清中組織蛋白酶B活力作用的時間依賴關係 為了簡化用固定化木瓜蛋白酶預處理的程序，在室溫下研究對血清中組織蛋白酶
活化作用的時間依賴關係。檢測到的活力隨時間的變化如圖8所示(背景值已減去)。在
t = 0分鐘的值代表沒有經過預處理的測定值。在t = 5分鐘的值代表最短時間的值，這段
時間內的孵育(即將樣品加入到固定化的木瓜蛋白酶中)、離心和取樣等流程按照常規操
作進行。在這個時間測得的活力是最理想的。 結論血清中組織蛋白酶B的活化是相當快的過程。
MLl 用AMC方法進行螢光分析活力測試螢光隨時間的增高；在測試中使用的組織蛋白酶B(從牛脾中純化，10單位/毫升)按照 1/5000稀釋。圖表對應於兩個酶活力有微小差異的獨立測試系列。
Ml (a)用AMC測試系統檢測組織蛋白酶B活力，以及(b)在血清存在下用AMC螢光進行檢測。 用由AMC底物和血清造成的背景螢光值校正測定值。測試中牛組織蛋白酶B的稀釋係數為1/5000。
Ml 隨著胱抑素A的濃度增高，對組織蛋白酶B活力的抑制作用。
用AMC方法進行檢測。測試中組織蛋白酶B的稀釋係數為1/2500。
圖4 用固定化的木瓜蛋白酶處理，對組織蛋白酶B去活化作用的時間依賴關係。
用AMC方法進行檢測。測試中組織蛋白酶B的稀釋係數為1/2500。
Ml 通過提高固定化的木瓜蛋白酶的量，解除由胱抑素A造成的對組織蛋白酶B的抑制作用。 測試採用AFC方法進行。
在存在或不存在(實心圓)兩種不同濃度的人血清的情況下，檢測加入的外源性
組織蛋白酶B的活力。 測試採用AFC方法進行。 Ml 在進行或不進行固定化木瓜蛋白酶處理的情況下，抑制劑E64和CA074對純化的組織蛋白酶B活力或血清中蛋白酶活力的作用。
測試採用AFC方法進行。
用固定化的木瓜蛋白酶處理，人血清中蛋白酶活力隨時間的變化。
測試採用AFC方法進行。檢測值取兩個檢測系列的平均值。 在醫學常規檢查(醫療實踐或臨床)中採用本發明的方法進行蛋白酶活力的檢測，下面是一些優選實施方式。 根據專利W0 97/00969，本領域已知在檢測一些在樣品中主要被抑制的酶的活力時，需要採用這樣的方式首先將樣品通過一個柱，從樣品中去除抑制酶的抑制劑。然後將不含抑制劑的酶加入測試容器，在加入合適的底物後檢測酶的活力，例如通過檢測該底物的至少一種切割產物濃度隨時間的增高。 如果採用AFC作為螢光團，這樣的裝置在實踐中尤其具有優勢，因為切下的螢光團的發射光譜轉移到長波區段，這樣就可以在其他的發光都不會再影響檢測結果的波長區段下檢測切下的螢光團的螢光。通用裝置和下述的這種裝置混合使用在實踐中具有優勢。
此外，通過使用兩次活力檢測的旁路，即檢測過柱之後的樣品的活力以及檢測樣品通過旁路之後的樣品的活力，除了測定樣品中酶的總活力以外，還可以測定抑制劑的濃度。 圖9顯示了本發明的一個基本實施方式。 在親和交換層析柱1周圍裝上一個帶有至少一個珀耳帖元件(Peltierelement)的恆溫器2。柱1基本上由填滿了多孔性物質、結合有抑制劑結合物質的載體的圓柱組成。交換型注射器4的尖端8伸入到柱1的上方開口 3中，在柱1的下端優選加上鎖緊閥6，注射器4在體積5中包含帶有酶-抑制劑複合物的樣品。 當注射器4壓緊時，體積5事實上變為O，其內容物被注入到裝有(優選為緊緊填滿)載體的柱l中。 通過第二注射器7將為樣品體積的約100-103倍體積的洗脫緩衝液完全或部分地 注入到柱1中。 第一流程如下所述在一個明確的溫度(例如，約4t:)下將樣品與一部分洗脫緩 衝液在柱l中一起孵育一段時間，實踐中為約10-18分鐘。尤其以15分鐘最為理想。然後 用注射器7進一步加入洗脫緩衝液，游離的酶被洗脫，並且如圖9所示，當鎖緊閥6打開時， 洗脫下來的溶液向下流入到模塊B中。 在第一流程中，閥門6最初是開啟的，直到柱緩衝液部分進入到柱1中或直到樣品 沿柱長分布。到這個時候，可以釋放一個在檢測中不被考慮在內的體積(如圖io所示，經 由排放管28)。在孵育一段時間後，打開閥門6進行洗脫，然後再關閉，這樣殘餘體積不會破 壞檢測值。也可以通過排放管28排出殘餘體積。 在可選的第二流程中，樣品和加入的柱緩衝液一起向下流過柱子，其速率能夠確 保樣品中所有酶_抑制劑複合體中的抑制劑都轉移到柱上的固定化物質上，該固定化物質 與抑制劑的結合要比酶與抑制劑的結合更強。這是一個類似遷移的孵育過程。這樣，游離 的酶被洗脫，並且如圖9所示洗脫下來的溶液向下流入到模塊B中。 在這個流程中，一開始也釋放了一個體積(如圖10所示，經由排放管28);這在類 似最佳檢測體積通過後也同樣發生。 因此，圖9的模塊A是一個用於去除抑制劑的裝置，位於檢測箱模塊B上方，如圖 9所示，柱1中的釋放體積是通過一個穿透蓋板11進入螢光測試管10的導管或管子釋放 進入模塊B的。(為了吸收穿過檢測樣品的雷射，將蓋板塗成黑色)。和酶活力測試中一 樣，游離的酶作為蛋白水解酶，從加入到檢測管10中的底物上切下一個在游離形式能夠發 螢光的片段。根據螢光強度隨著時間而升高，可以在明確的溫度條件(通過珀耳帖元件19 來調節)下測定游離化的酶的酶活力。在下方的檢測箱(模塊B)中有一個激發該螢光的 雷射二極體13。雷射二極體用於發射波長對應於發螢光的底物片段最大激發的光。光電二 極管17在與雷射電子束方向成直角的位置檢測發射螢光14。邊緣濾光片15和幹涉濾光片 16過濾了激發光中的幾乎所有散射光，並且確保只有螢光能夠到達光電二極體17。
模塊A中的親和層析柱1的溫度控制調節到3-2(TC，優選為4-5°C，由於伴隨著抑 製劑結合到柱中的親和層析材料上，蛋白水解酶被解放出來並且能夠消化自己，即在較高 的溫度下一個蛋白水解酶分子攻擊另一個酶分子。 在37t:的調控溫度下(為了人類醫學目的)，實施模塊B中酶活力的檢測。(為了
這個目的，可以使用一個附加裝置通過珀耳帖元件(恆溫器19)來控制溫度)。 在最基本的情況下，測試管10也是一次性產品的形式。(開始時測試管中裝滿了
測試緩衝液和酶活力測試的成分)。然而，可以直接將該混合物加入到測試管10中，或由於
環境情況通過附加的閥和泵經過通道9加入，如有需要，還可以加入合適的檢測緩衝液。在
洗脫完成後，加入底物開始酶反應。這可以是，例如，如圖IO所示，經由閥門26從底物容器
18中加入，或者如圖9所示經由一個穿過蓋板11的注射器(未顯示)加入。 組件1、5、4、10可以是便宜的一次性產品形式。可替換的組件的優點在於，一個患
者的樣品部分不會與另一個患者的樣品相接觸。必須考慮到，當一個患者的體液作為樣品
加到柱1上，並且在洗脫過程中酶抑制劑主要留存在柱中，然而，並不清楚是否其他組分也留存在柱中。在任何情況下，螢光測試管10中的樣品不僅包含游離酶還包含原始體液中的 大多數其他組分。這個理念的另一個優點在於，如閥/泵等複雜的機械組件不是必需的。
用檢測緩衝液稀釋洗出液可能有利於獲得好的檢測結果，可能是必需的。直接位 於檢測管上的雷射二極體和/或光電二極體的組合會導致高的檢測限。在圖9的最基本情 況下，可以實施下列流程用底物(加入過量)的檢測緩衝溶液對模塊A的柱1進行洗脫， 這樣，每個酶分子都能結合一個底物分子(底物飽和)。 圖10顯示了一個功能上比圖9更為先進、並且可以半自動化的裝置，但在兩種方 法中柱1都如圖9所示操作。因此，柱1的上端和下端帶有多向閥門22，26。它們的組件也 可以和圖9的裝置混合使用。 圖10也有一個帶有溫度調控部件6(如珀耳帖元件)的親和層析柱l，優選溫度調 節為4°C 。柱中緊緊填滿了結合特定物質的材料，該物質對抑制劑的親和力要高於待測樣品 中酶_抑制劑複合物，例如結合在填充材料瓊脂糖凝膠上的物質為木瓜蛋白酶，並且樣品 包含如組織蛋白酶B的酶-抑制劑複合物。通過管23經閥門22(用旋轉箭頭表示)從容 器中輸入樣品，從注入口 24將柱緩衝液注入到柱1中，其中需要調節閥門22。
管23可以是一次性的或/和可以作為用於進一步檢測的容器的注入口 。通道24 可以是塑料製成的一次性的第二注射器，其容積通常是樣品體積的數倍，或者它能作為柱 緩衝液儲槽或者是能通向這樣一個儲槽，在柱1注入口的閥門22的相應位置，開放柱緩衝 液的攝取流動。 將泵25安裝在閥門22的下遊，如有需要，能夠產生過柱的最佳流速所需的任何壓 力(包括P = 0)。閥門22的位置也可以調整為，樣品和/或柱緩衝液通過旁路27到達經 過柱1的流程的下出口或到達閥門26。為了下列附加的目的，可以在柱1的出口提供一個 附加的閥26(也用旋轉箭頭表示)當樣品流過柱1時，體積的第一部分通過出口 28被排 掉。然後轉動旋轉閥使液流通過方向30進入到檢測箱B中，因為後面的體積更適用於準確 的檢測。然後可以再次通過出口 28將剩餘的洗脫下的液體棄去。 為了能夠確認棄去的體積的量，在通過柱1後測定樣品的稀釋程度。可能需要有 簡單的裝置來進行測定經由通道28棄去的體積，並且根據這個值與通過24加入的洗脫緩 衝液的體積的差值，能夠確定含有游離酶的洗脫下的樣品的體積。 在通過通道30進入到容器10 (例如立方體形或長方體形)中後，酶已經從抑制劑 上游離出來的樣品流入到容器10中，該容器10中預先充滿檢測緩衝液和酶活力測試的成 分。從儲槽18中加入最佳量的底物，以啟動酶反應。 容器10也可以是滿足簡單需求的一次性產品，其中立方體10是由如塑料等製成 的。 它也可以是螢光測試管，其中，在模塊B中有一個波長為A = 400nm的雷射二極 管33。 從33發出的雷射光束與降落方向成直角，即與經由通道29或30的液流方向成 90° 。螢光偏振光束34與其垂直(從觀察者的角度來看，向右成90。)，該偏振光束是由切 割產物發出的，並且落到了邊緣濾光片15和與15平行排布的幹涉濾光片16上，然後落到 也與15平行排布的光電二極體17上，能夠在17的輸出端檢測螢光輻射的強度(如圖1)。 因此光束34、35位於一個優選與降落方向垂直的平面上。
在螢光測試管10下，磁力攪拌器44環繞著軸45進行旋轉，使得混合物能夠盡可 能的均勻。樣品顆粒與底物接觸後立刻發射出螢光，其強度與切割產物的濃度成正比，並且 可以成比例地檢測酶的活力。 圖13中的發射螢光強度測定曲線在起始階段之後變為直線，並且圖表一變為直 線就測定其斜率，以獲得所需要的結果dl/dt。圖13是所有其他圖示的代表。
在最基礎的情況下，模塊A是一次性的層析柱，在它的上端插入了一個含有樣品 的一次性第一注射器，然後插入一個含有柱緩衝液的第二注射器，它的出口 9可以直接通 過閥門6與檢測箱10相連，它也可以是預製的便宜的一次性產品(如前所述)。模塊B，尤 其是檢測箱IO，是溫度受控的，並且在檢測箱10附近和周圍提供了另一珀耳帖元件16 (出 於人類醫學目的，它必須能夠調節到37°C )。因此，可選的，底物儲槽18配備有一個通向檢 測箱10的直接通道。然而，優選地，輸送是從底物儲槽經過通道9或29或30間接進入檢 測箱10。 在最基礎的情況下，模塊B是便宜的一次性產品，裝滿了檢測緩衝液和其他成分， 例如非離子表面活性劑加二硫蘇糖醇或半胱氨酸。 如果樣品是通過流動的方法從柱上被洗脫，那麼閥是不可缺少的，因為在這個情 況下洗脫液的第一部分是被棄去的。如果樣品在柱上孵育一段時間，那麼閥門也是不可缺 少的，為此，在將樣品裝到柱上之後必須向柱內注入一定量的柱緩衝液，並且通過柱的出口 釋放出等量的部分；由此，樣品滲入柱中，並且樣品中的酶_抑制劑複合物與固定化在柱上 的物質相接觸，該物質能夠與抑制劑更牢固地結合。 而在如圖9的裝置中，雷射光束和發射螢光和檢測螢光燈與模塊A相平行或位於 模塊A的繪圖平面或剖面上，在圖10中這些光束34、35與模塊A的剖面相垂直，即通常與 部件1的降落方向或流經方向相垂直。 因此，在檢測管10或模塊B的下方，有一個將測試管10的內容物混勻的混合器， 優選設置為容易操作的例如磁力攪拌器44、45。 在這些附圖的說明中，採用相同的數字表示功能相同的組件或相同組件。此外，模 塊A用平面剖面視圖表示，而模塊B用三維顯示。 圖11是本發明的另一個獨立變體，其中省略了模塊A，並且檢測功能完全轉移到 了模塊B。檢測管為類似的帶有塗黑(如前所述)的蓋板111的檢測容器100的形式，其中 蓋板lll上優選帶有能夠(尤其是可自動化地)注入必需物質的開口。在這樣的情況下， 親和層析吸附劑(例如木瓜蛋白酶+載體)作為凝膠和酶活力測定的其他成分一起加入到 檢測容器中，檢測容器可以設計成如螢光測試管。在一定溫度(如5t:)加入生物樣品，5t: 是孵育的最理想溫度，通過珀耳帖元件將溫度保持恆定，樣品孵育一段最佳時間，這樣不含 抑制劑的酶釋放進入螢光測試管中。然後，將混合物轉入酶活力測試所需的溫度(出於人 類醫學目的為37t:)，在達到溫度時注入螢光發光底物，可以檢測螢光強度和游離蛋白水 解酶的酶活力(參見圖13)。 如圖11操作的方法是設計成這樣的首先在某一位置(在模塊B的檢測容器中) 在低溫下進行孵育，然後提高溫度(例如到37°C )，然後加入底物。 圖12代表本發明的另一個獨立變體，其中省略了模塊A，並且檢測功能完全轉移 到了放置樣品的模塊B。如圖11所示，檢測管設計成類似於檢測容器100。在這樣的情況下，將剛性元件71上的親和層析吸附劑(如木瓜蛋白酶+壓緊的載體)沿著箭頭72/70的方 向浸沒到檢測容器中的樣品裡，檢測容器也設計成螢光測試管。在孵育一段最佳時間(去 抑制)後，沿箭頭73的方向移出剛性元件。然後，將樣品轉入酶活力測試所需的溫度(出 於人類醫學目的為37°C )，在達到溫度時加入、注入螢光發光底物，可以檢測螢光強度和遊 離蛋白水解酶的酶活力(參見圖13)。 如圖12操作的方法是設計成這樣的首先在某一位置(在模塊B的檢測容器100 中)在低溫下進行孵育，然後提高溫度(例如到37°C )，然後加入底物。
權利要求
一種檢測液體樣品中至少一種蛋白酶活力的方法，所述樣品中除了需要檢測活力的至少一種蛋白酶之外，如有必要，還含有所述蛋白酶相對應的至少一種蛋白酶抑制劑，該方法包括下列步驟通過將樣品與以共價或者吸附方式結合了抑制劑結合物質的載體相接觸，去除樣品中蛋白酶上的蛋白酶抑制劑，所述抑制劑結合物質對蛋白酶抑制劑的親和/結合強度要高於蛋白酶本身；從樣品中將載體以及載體上結合的蛋白酶抑制劑一起分離出來；將需要測定活力的至少一種蛋白酶的底物加入到樣品中，並且記錄蛋白酶與底物的蛋白質水解反應。
2. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述至少一種蛋白酶選自半胱氨酸蛋白酶 家族，優選選自組織蛋白酶B、H、K、L和/或S其中之一，其中蛋白酶優選為組織蛋白酶B。
3. 如上述權利要求之一所述的方法，其特徵在於，所述液體樣品為血液樣品、血漿或血 清，優選為血清。
4. 如上述權利要求之一所述的方法，其特徵在於，所述至少一種蛋白酶的底物包括c-末端結合了螢光發光團的二肽或寡肽序列，其中螢光發光團在蛋白水解反應中被切下。
5. 如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述包含二肽或寡肽序列以及螢光發光團 的底物，其螢光發射波長最大值與蛋白水解反應中被蛋白酶切下的螢光發光團的螢光發射 波長最大值相差至少20nm，優選至少40nm或至少60nm或至少80nm，更優選至少100nm。
6. 如權利要求4和/或5之一所述的方法，其特徵在於，所述螢光發光團為7-氨 基-4-甲基香豆素(AMC)或7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)。
7. 如權利要求4-6之一所述的方法，其特徵在於，所述二肽或寡肽序列的N-端帶有保 護基團。
8. 如上述權利要求之一所述的方法，其特徵在於，記錄蛋白酶對底物進行蛋白水解反 應的產物(即被切下的螢光發光團)的濃度隨時間的變化，優選採用螢光測定方法。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，在37t:的線性範圍內檢測濃度的變化。
10. 如上述權利要求之一所述的方法，其特徵在於，向樣品的一個等分試樣中加入蛋白 酶的底物，並且在沒有預先去抑制的情況下檢測酶活力；而對樣品的另一等分試樣進行酶 活力檢測前，先將其與結合有抑制劑結合物質的載體相接觸，從而可以通過兩個測定值的 差異得出被抑制的酶的活力。
11. 一種用於實施如上述權利要求之一所述方法、具體是如權利要求1所述方法，檢測 液體樣品中酶活力的裝置，所述液體樣品中含有至少一種酶以及所述酶相對應的至少一種 酶抑制劑，其中，提供了用於去除抑制劑的裝置(例如層析柱(l))，其包含載體以及結合在 載體上的能夠與所述至少一種酶抑制劑相結合的物質；第一模塊A中優選的溫度控制器安裝在第二模塊B上方的中央； 提供了樣品儲槽和柱緩衝液儲槽； 模塊B包括設計成檢測管(10)的測量容器；檢測裝置帶有圍繞著所述檢測管的光源，以及用於記錄至少一種底物切割產物的濃度 隨時間上升的檢測部件；所述測量容器接受樣品、如果有需要與其混合的緩衝液和/或底物，而且可以是溫度受控的；用於向從所述裝置上洗脫下來進入檢測管(10)的液體樣品中加入底物和/或檢測緩 衝液的底物儲槽和/或檢測緩衝液儲槽；所述檢測管(10)，優選設計為立方體，具有至少2個相互具體成直角的光透壁面，輻射 源(13、33)和用於檢測輻射(如激發輻射14、34)強度的檢測部件(15、 16、 17)位於與其垂 直的位置；優選立方體的一個面是不透明的。
12. —種檢測含有至少一種酶和至少一種該酶相對應的酶抑制劑的樣品中酶活力的方 法，具體是如權利要求1所述的方法，其中，該方法包括下列階段在優選為中空圓柱形內空間並含有樣品的檢測容器(100)中，浸入結合有能與所述至 少一種酶抑制劑結合的物質的剛性載體，在去抑制完成後移除載體；測量杯形式的檢測容器是溫度受控的(優選在兩個階段中)； 然後加入底物和測試緩衝液；檢測容器(100)設置在輻射測量裝置內，優選當加入底物時啟動該裝置； 優選為立方體形狀的檢測容器(100)具有兩個透明的壁面(113、114)，輻射源(13、33)和檢測發光(例如激發輻射14、34)的光吸收的檢測部件(15、16、17)安裝在與這些壁面垂直的位置。
13. 如權利要求ll所述的裝置，其中，所述樣品儲槽為第一注射器(4)形式，所述柱緩衝液儲槽為顯著更大的第二注 射器(7)形式，所述底物儲槽為另一注射器。
14. 如權利要求11-13之一所述的裝置，其中，在檢測管(10)或檢測容器(100)的底部中心提供磁力攪拌器，並且在水平面上 發生了線偏振光束(14、34)。
15. 如權利要求ll所述的裝置，其中，在柱(1)的上方，樣品儲槽和柱緩衝液儲槽都帶有輸送通道(23、24)，具體是經 由第一閥裝置(22)，以便能將它們的體積輸送到柱(1)中；其中，具體是經由模塊A下遊的 第二閥裝置(26)，將洗脫下來的溶液釋放到模塊B中(通道29、30)，優選在第二閥裝置處 有附加的通道(27 、28 、18)。
16. 如權利要求11或13所述的裝置，其特徵在於，所述檢測緩衝液儲槽為另一注射器 形式。
17. 如權利要求11、12或15之一所述的裝置，其特徵在於，存在從柱(1)上方的第一閥 裝置(22)通向所述第二閥裝置(26)的旁路(27)。
18. 如上述權利要求之一所述的方法，其特徵在於，所述載體為剛性的或膠狀的。
19. 如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述剛性載體包括尼龍或硝酸纖維素，或 由這些材料製成；並且優選為箔或膜的形式。
20. 如上述權利要求之一所述的方法，其特徵在於，所述抑制劑結合物質為木瓜蛋白酶。
21. 如上述權利要求之一所述的方法，其特徵在於，在膠狀載體的情況下，樣品與載體 相接觸直到從樣品分離載體的時間最多為5分鐘，優選最多2分鐘；溫度為15-4(TC之間， 優選為20-35t:之間，更優選為20-3(TC之間。
22. 如上述權利要求之一，尤其是權利要求21所述的方法，其特徵在於，在剛性載體 的情況下，時間值要比權利要求21中所指定的更長，具體的說，在剛性載體的情況下，樣 品與載體相接觸直到從樣品分離載體的時間為約10分鐘，優選為約4分鐘；溫度範圍為 15-4(TC之間，優選為20-35t:之間，更優選為20-3(TC之間。
23. 用於實施如上述權利要求之一所述方法的試劑盒，至少包含下列組件a. AFC-底物(為純物質或溶解在檢測緩衝液中)b. 固體形式的AFC作為校正標準品c. (共價或吸附)結合了木瓜蛋白酶的載體d. 特異性、合成的抑制劑(半胱氨酸蛋白酶的特異性抑制劑E64;或組織蛋白酶B的 抑制劑CA-074)
24. 如權利要求21所述的方法，其特徵在於，在4t:，時間跨度為10-18分鐘，具體是15 分鐘。
25. 用於實施如上述權利要求之一所述方法，尤其是如權利要求12所述方法的裝置， 其特徵在於，所述結合了抑制劑結合物質的剛性載體連接於剛性適配器(71)，該剛性適配 器可以平行於所述檢測容器(100)的縱軸向兩個相反的方向(72、73)移動，並且優選通過 能平行於所述方向(72,73)移動的剛性適配器(81)將所述底物加入到檢測容器(100)中， 其中所述適配器具有底物計量和輸送系統。
26. 如權利要求25所述的裝置，其特徵在於，所述剛性適配器(71)和/或所述剛性載 體(81)是螢光計或螢光分析儀的組件，優選浸入微孔板的孔或螢光計的測量元件中。
27. 如權利要求25或26所述的裝置，其特徵在於，所述檢測容器是微孔板的孔。
28. 如權利要求25-27所述的裝置，其特徵在於，所述剛性適配器(81)具有對應於微孔 板的矩形平面組件。
29. 如權利要求28所述的裝置，其特徵在於，所述剛性適配器(71)具有相應的平面組件。
全文摘要
本發明公開了一種通過預先去除抑制後檢測酶活力來確定蛋白酶的總量的方法和儀器。在生物樣品中，溶酶體蛋白酶是完全(例如在血清中)或部分(例如在組織勻漿液中)被抑制的。去抑制的方法需要將以共價或吸附方式連接了抑制劑結合物質的如塑料帶等固體支持材料(如尼龍或硝酸纖維素)浸入到檢測樣品中，其中抑制劑結合物質與蛋白酶相應的抑制劑的結合要比蛋白酶更強。在發生去抑制之後，從檢測的液體樣品中移除塑料帶，然後將檢測樣品轉入酶活力的檢測。可以從其上切下螢光發光團7-氨基-4-三氟甲基香豆素的螢光發光底物被證明在活力檢測中具有相當優勢。用這些底物結合螢光分析儀在微孔板中進行血清檢測，能夠獲得比傳統AMC底物高至少10倍的靈敏度，並且這種廣泛用於臨床實驗室的檢測裝置能夠有效地對血清中這些酶的活力進行螢光測定。
文檔編號C12M1/36GK101730746SQ200880023430
公開日2010年6月9日 申請日期2008年7月7日 優先權日2007年7月6日
發明者H·J·邁耶, H·W·霍弗 申請人:帕普斯特許可有限兩合公司