一種定量測定作物種子脂肪氧化酶活性的方法
2023-12-10 02:25:16
專利名稱：一種定量測定作物種子脂肪氧化酶活性的方法
技術領域：
本發明屬於生物化學領域，涉及一種對作物種子中脂肪氧化酶活性進行 單粒、定量測定的方法。
背景技術：
小麥是人類最主要的食物來源之一，它可以被多年貯藏並利用。但一直 以來，對小麥的研究主要集中在提高產量、蛋白質品質和抗性方面，而沒有 關注其貯藏品質，小麥作為我國重要的糧食戰略儲備物質，其貯藏品質與產 出同樣重要。小麥在一般貯藏條件下第二年開始陳化變質，在高溫高溼地區 貯藏發生陳化劣變的時間則更短，小麥陳化變質將導致品質降低，商品性下 降，加上黴變，倉儲害蟲危害等影響，嚴重威脅著糧食的貯藏安全。
脂肪氧化酶(Lipoxygenase, EC 1.13.11.12)是一種含鐵的氧化還原酶， 它催化含有順-順-l,4-戊二烯的多不飽和脂肪酸及其酯形成氫過氧化物。脂肪 氧化酶廣泛存在於自然界，已經在植物、動物及真菌中發現，在植物中已發 現多種脂肪氧化酶的同工酶，如在大豆種子中已發現至少有三種由不同基 因編碼的同工酶。脂肪氧化酶的底物為亞油酸和花生四烯酸，亞油酸是許多 植物種子中含量最高的脂肪酸。亞油酸經脂肪氧化酶催化形成C6醛類、醇類 化合物，這些揮發性物質會產生陳味，導致加工食品的品質降低。研究表明 種子保存過程中脂肪酸的降解是導致品質劣變，產生陳味及劣變的根源，脂 肪氧化酶缺失或其活性降低能減少氧化變質，延長種子C藏期。
小麥脂肪氧化酶活性的測定方法已經報導的大約有以下3種。最常應用 的是測定234nm處脂肪氧化酶反應直接產物-氫過氧化物的含量，這種方法對 己經提純的酶很適用，但不適合測定粗酶活性，因為粗酶中含有其它吸收紫 外光的物質會干擾測定；同時，此方法操作繁瑣，因此限制了它的應用。另 一種方法是氧-電極法，這種方法測定很準確，但由於氧電極價格昂貴，同時 需要專業人員，測定繁瑣，推廣很難。第三種方法是單克隆抗體法，這種方
法需要製備專一的抗體，測定準確，但周期長，對實驗設備要求很高，普通 實驗室很難進行。以上3種方法均需要數克以上分析樣品，不能實現單粒定
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種快速、準確、簡便的作 物單粒種子脂肪氧化酶活性定量測定方法。
本發明所述的作物包括小麥、玉米、大豆、水稻、花生、蕎麥、大麥等 農作物。
本發明的單粒小麥種子中脂肪氧化酶活性定量測定方法的主要原理在 一定時間內，脂肪氧化酶的活性大小與其催化反應生成的氫過氧化物的量呈 正比例，氫過氧化物在酸性條件下，能使碘化鉀氧化為碘，碘與澱粉反應生
成藍色物質，該顏色物質在470nm處有特徵吸收峰。因此，測定藍色物質的 量就可以相應計算出脂肪氧化酶的活性。本實驗的反應原理如下-
脂肪氧化酶 亞油酸+02- 氫過氧化物
氫過氧化物+r+H+4 12+亞油酸醇 12+澱粉~>藍色物質
本發明測定作物種子脂肪氧化酶活性的方法，包括以下步驟
(1) 、提取粗酶
取單粒作物種子，磨粉後加入0.6 3.0mlPH6.0 7.0磷酸緩衝液(小麥、 水稻、大麥、蕎麥加入0.6ml，玉米加入l.Oml，大豆加入2.0ml，花生加入 3.0ml)，於0。C靜置1小時，其間振蕩2次，每次30秒；離心，12,000轉/分 鍾，10分鐘，4°C,上清液過三層粗棉布即得粗酶液，立即放入-20。C保存； 採用考馬斯亮藍法測定提取液中可溶性蛋白的含量，標準曲線由牛血清蛋白 (濃度10-60ng/ml)建立。
(2) 、配製亞油酸底物溶液
於800^1蒸餾水中加入15.6|xl吐溫20、 15.6nl亞油酸，搖勻後加入100^1、 lM的NaOH,加蒸餾水定容至5ml。
(3) 、配製澱粉液
於1.0克可溶性澱粉中加入100ml蒸餾水，沸水浴中加熱直到溶液透明，
冷卻後使用。
(4) 、配製碘化鉀溶液 稱取1.5克KI加入1.0ml蒸餾水，緩慢加熱溶解，冷卻後有KI沉澱。
(5) 、配製檸檬酸溶液
稱取52.5克檸檬酸，加入蒸餾水定容至250ml。
(6) 、粗酶活性的測定
取O.lml粗酶提取液，加入0.2ml亞油酸底物溶液，搖勻後再加入0.1ml 澱粉液，0.2ml碘化鉀液和2.4ml檸檬酸液，30'C靜置5分鐘後測定470nm處 的吸光值；另取0.1ml粗酶提取液作為空白對照，在沸水浴中煮10分鐘後， 加入0.2mi亞油酸底物溶液，搖勻後再加入0.1ml澱粉液，0.2ml碘化鉀液和 2.4ml檸檬酸液，3(TC靜置5分鐘後測定470nm處的吸光值。在上述反應條件 下，將每分鐘催化每毫克總蛋白所需的酶量定義為1個活力單位(U)，由此 得出酶活力計算公式為U二(吸光值X1000)/(蛋白質含量mgX時間min)。
本發明方法的用途如下
① 、用於開展控制脂肪氧化酶活性相關基因的遺傳學研究。
② 、用於耐儲藏作物育種的輔助選擇指標。
③ 、供育種學家篩選脂肪氧化酶缺失或高活性的材料，於耐儲藏作物育 種的親本資源。
④ 、作為糧食貯藏部門中長期種子庫，及農民儲糧大戶檢測其耐貯藏性、 食品加工品質的依據。
⑤ 、作為種子部門鑑定品種耐貯藏性的指標之一。 本發明具有如下優點
① 、直接利用小麥等作物種子做材料，僅需單粒種子即可，解決了不能 對作物單個籽粒進行脂肪氧化酶活性的測定的問題；
② 、利用分光光度計對澱粉-碘化鉀的顏色變化進行測定，這樣做不僅具
有簡便、快速的優點，而且能對脂肪氧化酶活性進行定量測定；
③ 、不需要複雜的實驗條件和高精密的實驗儀器。本方法只需可見分光 光度計和離心機即可，儀器設備費用低，能滿足國內的絕大多數實驗室條件,
易於推廣； ④ 、本方法具有時間短，通量高的特點。完成單個樣品的測定只需2-3 小時，完成上百個樣品的測定需要l-2天即可，可滿足耐儲藏小麥等作物育種 過程中對大量分離後代的篩選；⑤ 、本發明提出測定脂肪氧化酶活性的方法，操作簡便、迅速。
具體實施方式
下面結合具體實施例，對本發明作進一步說明。 實施例l:小麥品種脂肪氧化酶活性的單粒測定粗酶的提取取小麥品種日喀則23號種子一粒，磨粉後加入0.6ml PH7.0 磷酸緩衝液，於(TC靜置1小時，其間振蕩2次，每次30秒；l小時後離心， 12,000轉/分鐘，IO分鐘，4°C，上清液過三層粗棉布後即為粗酶液，立即放 入-2(TC保存。提取液中可溶性蛋白含量的測定應用考馬斯亮藍方法，標準曲 線由牛血清蛋白(濃度10-60pg/ml)建立。亞油酸底物溶液的配製於80(^1蒸餾水中加入15.6^1吐溫20， 15.6^1 亞油酸，搖勻後加入10(^1， 1M的NaOH，加蒸餾水定容至5ml。澱粉液的配製於1.0克可溶性澱粉中加入100ml蒸餾水，沸水浴中加熱 直到溶液透明，冷卻後使用。碘化鉀溶液的配製稱取1.5克KI加入1.0ml蒸餾水，緩慢加熱溶解。 檸檬酸溶液的配製稱取52.5克檸檬酸，加入蒸餾水溶解，定容至250ml。 粗酶活性的測定30'C時，在0.11111粗酶提取液中加入0.21111亞油酸底物 溶液，搖勻後再加入O.lml澱粉液,0.2ml碘化鉀液和2.4ml檸檬黢液(另取O.lml 粗酶提取液在沸水浴中煮10分鐘作為空白對照，其它的操作同上)，靜置5 分鐘後測定470nm處的吸光值，由此測出日喀則23號脂肪氧化酶的活性為 179.9U。實施例2:小麥品種脂肪氧化酶活性的單粒測定取小麥品種日喀則54號種子一粒，其它方法同實施例l，測出日咯則54 號脂肪氧化酶的活性為177.3U。實旌例3:玉米品種脂肪氧化酶活性的單粒測定取玉米品種S37種子一粒，磨粉後加入1.0mlPH7.0磷酸緩衝液，其它方 法同實施例1，測出玉米品種S37脂肪氧化酶的活性為149.8U。
實施例4:蕎麥品種脂肪氧化酶活性的單粒測定-取黑水甜蕎地方品種種子一粒，其它方法同實施例1，測出黑水甜蕎地方 品種脂肪氧化酶的活性為83.8U。實施例5:水稻品種脂肪氧化酶活性的單粒測定取水稻品種明恢63種子一粒，其它方法同實施例l，測出明恢63脂肪氧 化酶的活性為126.6U。實施例6:花生品種脂肪氧化酶活性的單粒測定取花生品種天府10號種子一粒，磨粉後加入3.0ml PH7.D磷酸緩衝液， 其它方法同實施例1，測出天府10號花生的脂肪氧化酶的活性為188.6U。 實施例7:大豆品種脂肪氧化酶活性的單粒測定取大豆品種成豆1號種子一粒，磨粉後加入2.0mlPH6.0磷酸緩衝液，其 它方法同實施例1，測出成豆1號脂肪氧化酶的活性為583.6U。 實施例8:大麥品種脂肪氧化酶活性的單粒測定取大麥品種藏青311種子一粒，磨粉後加入0.6mlPH7.0磷酸緩衝液，其 它方法同實施例1,測出大麥藏青311脂肪氧化酶的活性為174.1U。
權利要求
1. 一種定量測定作物種子脂肪氧化酶活性的方法，其特徵是包括以下步驟(1)、提取粗酶取單粒作物種子，磨粉後加入0.6～3.0ml PH6.0～7.0磷酸緩衝液，於0℃靜置1小時，其間振蕩2次，每次30秒，12000轉/分鐘離心10分鐘，4℃，上清液過三層粗棉布即得粗酶液，立即放入-20℃保存，採用考馬斯亮藍法測定提取液中可溶性蛋白的含量，標準曲線由濃度為10-60μg/ml的牛血清蛋白；(2)、配製亞油酸底物溶液於800μl蒸餾水中加入15.6μl吐溫20，15.6μl亞油酸，搖勻後加入100μl、1M的NaOH，加蒸餾水定容至5ml；(3)、配製澱粉溶液於1.0克可溶性澱粉中加入100ml蒸餾水，沸水浴中加熱直到溶液透明，冷卻後使用；(4)、配製碘化鉀溶液稱取1.5克KI，加入1.0ml蒸餾水，緩慢加熱，冷卻後有KI沉澱；(5)、配製檸檬酸溶液稱取52.5克檸檬酸，加入蒸餾水定容至250ml；(6)、粗酶活性的測定取0.1ml粗酶提取液，加入0.2ml亞油酸底物溶液，搖勻後再加入0.1ml澱粉液、0.2ml碘化鉀液和2.4ml檸檬酸液，30℃靜置5分鐘後測定470nm處的吸光值；另取0.1ml粗酶提取液作為空白對照，在沸水浴中煮10分鐘後，加入0.2ml亞油酸底物溶液，搖勻後再加入0.1ml澱粉液，0.2ml碘化鉀液和2.4ml檸檬酸液，30℃靜置5分鐘後測定470nm處的吸光值；在上述反應條件下，將每分鐘催化每毫克總蛋白所需的酶量定義為1個活力單位(U)，由此得出酶活力計算公式為U＝(吸光值×1000)/(蛋白質含量mg×時間min)。
2. 根據權利要求1所述的定量測定作物種子脂肪氧化酶活性的方法，其特徵 是磷酸緩衝液的加入量因作物種類的不同而不同，其中小麥、水稻、大 麥、蕎麥的加入量為0.6ml，玉米的加入量為l.Oml，大豆的加入量為2.0ml， 花生的加入量為3.0ml。
全文摘要
本發明屬於生物化學領域，涉及一種對作物種子中脂肪氧化酶活性進行單粒、定量測定的方法。包括提取粗酶、亞油酸底物溶液的配製、澱粉液的配製、碘化鉀溶液的配製、檸檬酸溶液配製、粗酶活性的測定六個步驟。本發明具有可用單粒種子測定、使用設備簡單、操作簡便、測量迅速、通量高、測定結果準確等優點。
文檔編號G01N21/31GK101210877SQ200610022638
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月25日 優先權日2006年12月25日
發明者波 馮, 徐智斌, 濤 王 申請人:中國科學院成都生物研究所