一種測定sds敏感蛋白酶活力的酶譜方法
2023-12-10 02:28:11
專利名稱：一種測定sds敏感蛋白酶活力的酶譜方法
技術領域：
本發明屬於生物蛋白酶檢測技術領域，具體涉及一種測定SDS敏感蛋白酶活力的酶譜方法。
背景技術：
酶譜法(zymography)是一種在SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術的基礎上通過特異性底物和丙烯醯胺共聚合來測定酶活性的電泳檢測技術。明膠酶譜法是測定蛋白酶活性的一種常用手段，因該技術能測定多種降解明膠的蛋白酶活性，且具有方法簡單、 檢測結果直觀和定量等優點，近年來被廣泛應用於生物蛋白酶檢測技術領域。然而，大量的檢測數據顯示該方法仍存在一些缺點。如1、缺乏一種能夠適用於多數蛋白酶的通用方法。2、缺乏特異性更高且能和丙烯醯胺偶聯的底物。3、難以測定一些 SDS敏感蛋白酶的活性。4、難以測定一些含鹼性蛋白酶的組分的活性。相關文獻
相關的美國專利包括7，153，660 B2, US2003/0171271 Al。相關日本專利包括 JP20010023781, JP20010131, JP20040299951, JP20041014。相關文獻包括Choi NS et al. ， 2006， J. Microbiol. Biotechnol. 16:457-464; Boonyaras Kim SH and Choi NS, 2000，Biosci.，Biotechnol. , Biochem. 64:1722—1725; Cristiane Μ. C. de Salles et al. , 2006, Anal. Biochem. 357:153-155; Christa Heussen and Eugene B. Dowdle, 1980， Anal. Biochem. 102:196—202; Eiichi Saitoh et al. ， 2007， Anal. Chem. Insights 2:51-59; Choi NS and Kim SH, 2000， Anal. Biochem. 281(2):236-8; Choi NS et al. , 2005, J. Microbiol. Biotechnol. 15:35-39; Jeff Wilkesman and Liliana Kurz, 2009, Recent Pat. Biotechnol. 3:175-184; Choi NS et al., 2009, Anal. Biochem. 386:121-122; Choi NS et al. , 2001, J. Biochem. Mol. Biol. 34:531-536;Choi NS et al. ， 2003， J. Biochem. Mol. Biol. 37:298-303; PA Snoek-van Beurden and Jff Von den Hoff, 2005， BIOTECHNIQUES 38:73—83; Choi NS et al. ， 2005， J. Microbiol. Biotechnol. 15:537—543; R. Porcel et al. ， 2001， J. Colloid Interface Sci. 239:568-576； A Granel1i-Piperno and E Reich, 1978, J. Exp. Med. ； TM Leber and FR Balkwill, 1997，249:24-28;騫愛榮等，2003，解放軍醫學雜誌，28 =282-283;姜微波等，2002，植物學通報，19:607-610。
發明內容
技術問題本發明的目的在於解決酶譜測定時SDS敏感酶活性難以檢測的問題，提供了一種用來測定SDS敏感蛋白酶的明膠酶譜方法。技術方案一種測定SDS敏感蛋白酶活力的酶譜方法，包括凝膠配製步驟和電泳步驟，電泳用聚丙烯醯胺凝膠由兩種不同組分配比的聚丙烯醯胺凝膠組成聚丙烯醯胺凝膠I由3質量份丙烯醯胺混合溶液I和1質量份濃縮膠緩衝液組成，其中(1)丙烯醯胺混合溶液I由丙烯醯胺、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為6. 67%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%，pH 6.8; (2)濃縮膠緩衝液為0.5 mol/L Tris-HCL 溶液，pH 6.8;聚丙烯醯胺凝膠II由3質量份丙烯醯胺混合溶液II和1質量份分離膠緩衝液組成，其中丙烯醯胺混合溶液II由丙烯醯胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為13. 33%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%、明膠質量體積比 0. 133%，pH 8.8;分離膠緩衝液為1.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 8.8;上述兩種聚丙烯醯胺凝膠分別配製完成後，按照體積比聚丙烯醯胺凝膠I 聚丙烯醯胺凝膠11=2:5，用於製備電泳用聚丙烯醯胺凝膠。所述電泳緩衝液中含有0. 5%0 SDS。凝膠製好後，按照生物化學常規電泳方法製備所需要的其它溶液，並參照常規操作或根據情況適當調整進行蛋白酶電泳和酶譜分析。本發明可以應用於微生物、植物和動物體中得到的SDS敏感蛋白酶或普通蛋白酶的電泳和酶譜分析。有益效果與Neutral-PAGE酶譜法相比，Neutral-PAGE酶譜法只能定性的觀測蛋白酶活力，並不能準確測定蛋白酶的分子量大小。本方法不但能夠很好的檢測SDS敏感蛋白酶的活性，且能確定蛋白酶的分子量大小，並克服普通酶譜方法酶活條帶易呈點狀擴散， 形成重疊的缺陷，提高酶譜的解析度。
圖1本方法測SDS敏感蛋白酶活性(泳道1)和基於非變性凝膠電泳的蛋白酶譜測定SDS敏感蛋白酶活性(泳道幻結果比較。符號M下面的數字是蛋白質分子量標記，單位是千道爾頓(KD)。圖1 (泳道1)簡稱為圖1 (1)，圖1 (泳道2)簡稱為圖1 (2)。圖2酶譜測定層析純化組分蛋白酶活性。符號M以下的蛋白條帶為蛋白質分子量標記，圖左邊和符號M下面的蛋白條帶對應的數字標記出了各蛋白條帶的分子量大小。圖3層析純化組分SDS-PAGE圖譜，作為圖2的對照。符號M以下的蛋白條帶為蛋白質分子量標記，圖左邊和符號M下面的蛋白條帶對應的數字標記出了各蛋白條帶的分子量大小。圖4三株高溫菌胞外蛋白酶的酶譜比較。(a)圖為使用本方法檢測得到的結果， (b)為使用基於SDS變性蛋白電泳(SDS-PAGE)的酶譜方法檢測得到的結果。
具體實施方式
實施例中所述的質量體積比單位為g/mL，體積比單位為mL/mL。實施例1
現採用該方法，對一株芽胞桿菌分泌的SDS敏感蛋白酶的粗酶液進行了酶譜檢測，比較了不同方法對該菌株的發酵液進行酶譜分析的差異，作為該方法檢測實例。菌株一株地衣芽孢桿菌(CGMCC No. 1. 807)，這些菌株均為普通微生物保藏中心可以購買到的菌株。培養條件55°C培養M小時。發酵產酶條件基礎培養基30°C培養48小時左右。樣品製備用基礎培養基發酵地衣芽孢桿菌(CGMCC No. 1. 807)，培養48小時後將菌液離心收集粗酶液。粗酶液蛋白組分對SDS敏感，用普通SDS-PAGE進行酶譜實驗後無法正常檢測到蛋白酶活性。蛋白酶活性檢測
1、聚丙烯醯胺凝膠的配製 a.聚丙烯醯胺凝膠I由3質量份丙烯醯胺混合溶液I和1質量份濃縮膠緩衝液組成， 其中
(1)丙烯醯胺混合溶液I由丙烯醯胺、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為6. 67%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、 N, N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%。(2)濃縮膠緩衝液為 0. 5 mol/L Tris-HCL 溶液，pH 6. 8。b.聚丙烯醯胺凝膠II由3質量份丙烯醯胺混合溶液II和1質量份濃縮膠緩衝液組成，其中
(1)丙烯醯胺混合溶液II由丙烯醯胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為13. 33%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%、明膠質量體積比 0. 133%。(2)分離膠緩衝液為 0. 5 mol/L Tris-HCL 溶液，pH 8. 8。c.上述兩種聚丙烯醯胺凝膠分別配製完成後，按照體積比聚丙烯醯胺凝膠I 聚丙烯醯胺凝膠11=2:5，用於製備電泳用聚丙烯醯胺凝膠。2、凝膠製好後，取粗酶液樣品與樣品緩衝液(樣品緩衝液由蔗糖、溴酚藍、 Tris-HCl組成，該溶液中蔗糖質量體積比為2%，溴酚藍質量體積比為0.2% ； Tris鹼質量體積比為0.6%，pH 6.8)按一比一混合均勻後點樣。上樣後，將冰浴的電泳槽放入4°C冰箱，以60V電壓使樣品壓成一條直線並進入分離膠，然後將電壓增至100V，繼續電泳至溴酚藍前沿泳出分離膠時，停止電泳。取下凝膠，將膠置於洗脫液(該溶液由聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、CaCl2、Tris_HCl 組成，其中 Triton X-100 質量體積比為 2. 5%，Tris 鹼質量體積比為0. 6%，CaCl2質量體積比為0. 05%, pH7. 5)中振蕩洗脫2次，每次30分鐘， 然後用漂洗液(除不含Triton X_100外其餘同洗脫液)漂洗2次，每次10分鐘，接著， 將膠置於孵育液(該溶液由CaCl2、NaCl, Tris-HCl組成，其中CaCl2質量體積比為0. 05%, Tris鹼質量體積比為0. 6% NaCl質量體積比為0. 87%，pH7. 5)中55°C恆溫孵育2_汕。孵育結束後經染色液(該溶液由考馬斯亮藍、甲醇、冰乙酸組成，其中考馬斯亮藍質量體積比為0. 1%、甲醇質量體積比為45%、乙酸質量體積比為10%)染色20min，及脫色液A、B(甲醇體積濃度分別為30%、20%，乙酸體積濃度分別為10%、10%)分別脫色0jh、lh後，顯示出蛋白酶為位於深色背景上的清晰透亮條帶。於凝膠成像系統進行圖像採集見圖1(1)。同時，使用基於非變性凝膠電泳(Neutral-PAGE)的酶譜法測定該蛋白樣品，作為圖1 (1)的對照見圖1 (2)。由圖1(1)和(2)中蛋白條帶的差異，可見基於非變性蛋白電泳(Neutral-PAGE) 的酶譜法得到的條帶要少於本方法，這是由於在非變性凝膠電泳過程中一些蛋白會從點樣口逃逸。 實施例2
現採用該方法，對一株芽胞桿菌分泌的SDS敏感蛋白酶經離子層析柱純化後的SDS敏感組分進行了酶譜檢測和變性蛋白質電泳(SDS-PAGE)分析，比較了不同方法對該SDS敏感組分分析的差異，作為該方法檢測實例。菌株一株地衣芽孢桿菌(CGMCC No. 1. 807)，這些菌株均為普通微生物保藏中心可以購買到的菌株。培養條件55°C培養M小時。發酵產酶條件基礎培養基30°C培養48小時左右。樣品製備用基礎培養基發酵地衣芽孢桿菌(CGMCC No. 1. 807)，培養48小時後將菌液離心收集粗酶液。粗酶液經硫酸銨沉澱後，通過離子交換層析分離到耐熱蛋白酶組分。 經層析得到的蛋白組分對SDS敏感，用普通SDS-PAGE進行酶譜實驗後無法正常檢測到蛋白酶活性。蛋白酶活性檢測
1、聚丙烯醯胺凝膠的配製 a.聚丙烯醯胺凝膠I由3質量份丙烯醯胺混合溶液I和1質量份濃縮膠緩衝液組成， 其中
(1)丙烯醯胺混合溶液I由丙烯醯胺、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為6. 67%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、 N, N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%。(2)濃縮膠緩衝液為 0. 5 mol/L Tris-HCL 溶液，pH 6. 8。b.聚丙烯醯胺凝膠II由3質量份丙烯醯胺混合溶液II和1質量份濃縮膠緩衝液組成，其中
(1)丙烯醯胺混合溶液II由丙烯醯胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為13. 33%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%、明膠質量體積比 0. 133%。(2)分離膠緩衝液為 0. 5 mol/L Tris-HCL 溶液，pH 8. 8。c.上述兩種聚丙烯醯胺凝膠分別配製完成後，按照體積比聚丙烯醯胺凝膠I 聚丙烯醯胺凝膠11=2:5，用於製備電泳用聚丙烯醯胺凝膠。2、凝膠製好後，取層析樣品5 μ L、10 μ L、20 μ L分別與樣品緩衝液Wt蔗糖， 0. 2% wt溴酚藍，50mmol/L Tris-HCl, pH 6.8)按一比一混合均勻後點樣。上樣後，將冰浴的電泳槽放入4°C冰箱，以60V電壓使樣品壓成一條直線並進入分離膠，然後將電壓增至 100V，繼續電泳至溴酚藍前沿泳出分離膠時，停止電泳。取下凝膠，將膠置於洗脫液(該溶液由聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、CaCl2、iTris-HCl組成，其中Triton X-100質量體積比為2. 5%，Tris鹼質量體積比為0. 6%，CaCl2質量體積比為0. 05%, ρΗ7· 5)中振蕩洗脫2次，每次30分鐘，然後用漂洗液(除不含Triton X_100外其餘同洗脫液)漂洗2次，每次10分鐘，接著，將膠置於孵育液(該溶液由CaCl2、NaCl、TriS-HCl組成，其中CaCl2質量體積比為0. 05%, Tris鹼質量體積比為0. 6% NaCl質量體積比為0. 87%，ρΗ7· 5)中550Cfl 溫孵育2-池。孵育結束後經染色液(該溶液由考馬斯亮藍、甲醇、冰乙酸組成，其中考馬斯亮藍質量體積比為0. 1%、甲醇質量體積比為45%、乙酸質量體積比為10%)染色20min，及脫色液A、B(甲醇體積濃度分別為30%、20%，乙酸體積濃度分別為10%、10%)分別脫色0. 5h、 Ih後，顯示出蛋白酶為位於深色背景上的清晰透亮條帶。於凝膠成像系統進行圖像採集見圖2。同時，使用變性凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測該蛋白組分，作為圖2的對照見圖3。圖2 泳道3、2、1中的蛋白均為通過離子交換層析分離到耐熱蛋白酶組分，該組分對SDS敏感，樣品上樣量分別為5 μ L、10y L、20 μ L。圖2泳道3、2、1分別對應圖3泳道1、2、3，可以明顯的發現本方法中蛋白酶條帶的亮度和蛋白酶的上樣量有很好的正相關性。同時，SDS-PAGE 對照上的蛋白質分子量標記(圖3泳道Μ. MASS)和本方法中的蛋白質分子量標記(圖2泳道M. MASS)位置完全一致。非變性蛋白電泳(Neutral-PAGE)酶譜法只能定性的觀測蛋白酶活力，並不能準確測定蛋白酶的分子量大小。由圖2和圖3可見本方法不但能夠很好的檢測SDS敏感蛋白酶的活性，且能確定蛋白酶的分子量大小。
實施例3
現採用該方法，對3株高溫菌分泌的受到0. 1%質量體積比SDS強烈抑制的蛋白酶粗酶液進行酶譜檢測，比較了不同方法對該菌株的發酵液進行酶譜分析的差異，作為該方法檢測實例。菌株3株地衣芽孢桿菌(CGMCC No. 1.洸5)、枯草芽孢桿菌(CGMCC No. 1. 892)和枯草芽孢桿菌(CGMCC No. 1.354)，這些菌株均為普通微生物保藏中心可以購買到的菌株。培養條件55°C培養M小時。發酵產酶條件基礎培養基30°C培養48小時左右。樣品製備用基礎培養基發酵地衣芽孢桿菌(CGMCC No. 1. 265)、枯草芽孢桿菌 (CGMCC No. 1. 892)和枯草芽孢桿菌(CGMCC No. 1. 354)，培養48小時後將菌液離心收集粗酶液。粗酶液經0. 1%質量體積比SDS,分別殘留20. 73%、19. 91%,9. 07%的活力。蛋白酶活性檢測
1、聚丙烯醯胺凝膠的配製
a.聚丙烯醯胺凝膠I由3質量份丙烯醯胺混合溶液I和1質量份濃縮膠緩衝液組成， 其中
(1)丙烯醯胺混合溶液I由丙烯醯胺、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為6. 67%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、 N, N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%。(2)濃縮膠緩衝液為 0. 5 mol/L Tris-HCL 溶液，pH 6. 8。b.聚丙烯醯胺凝膠II由3份丙烯醯胺混合溶液II和1份濃縮膠緩衝液組成，其中
(1)丙烯醯胺混合溶液II由丙烯醯胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為13. 33%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%、明膠質量體積比 0. 133%。(2)分離膠緩衝液為 0. 5 mol/L Tris-HCL 溶液，pH 8. 8。c.上述兩種聚丙烯醯胺凝膠分別配製完成後，按照體積比聚丙烯醯胺凝膠I 聚丙烯醯胺凝膠11=2:5，用於製備電泳用聚丙烯醯胺凝膠。2、凝膠製好後，取層析樣品5 μ L、10 μ L、20 μ L分別與樣品緩衝液Wt蔗糖， 0. 2% wt溴酚藍，50mmol/L Tris-HCl, pH 6.8)按一比一混合均勻後點樣。上樣後，將冰浴的電泳槽放入4°C冰箱，以60V電壓使樣品壓成一條直線並進入分離膠，然後將電壓增至 100V，繼續電泳至溴酚藍前沿泳出分離膠時，停止電泳。取下凝膠，將膠置於洗脫液(該溶液由聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、CaCl2、iTris-HCl組成，其中Triton X-100質量體積比為2. 5%，Tris鹼質量體積比為0. 6%，CaCl2質量體積比為0. 05%, ρΗ7· 5)中振蕩洗脫2次，每次30分鐘，然後用漂洗液(除不含Triton X_100外其餘同洗脫液)漂洗2次，每次10分鐘，接著，將膠置於孵育液(該溶液由CaCl2、NaCl、TriS-HCl組成，其中CaCl2質量體積比為0. 05%, Tris鹼質量體積比為0. 6% NaCl質量體積比為0. 87%，ρΗ7· 5)中550Cfl 溫孵育2-池。孵育結束後經染色液(該溶液由考馬斯亮藍、甲醇、冰乙酸組成，其中考馬斯亮藍質量體積比為0. 1%、甲醇質量體積比為45%、乙酸質量體積比為10%)染色20min，及脫色液A、B(甲醇體積濃度分別為30%、20%，乙酸體積濃度分別為10%、10%)分別脫色0. 5h、 Ih後，顯示出蛋白酶為位於深色背景上的清晰透亮條帶。於凝膠成像系統進行圖像採集見圖4 (a)。同時，使用基於SDS變性凝膠電泳(SDS-PAGE)的酶譜法測定該蛋白樣品，作為圖 4 (a)的對照見圖4 (b)。比較圖4 (a)和圖4 (b)我們可以發現，改進型明膠酶譜的效果明顯要優於基於SDS-PAGE的明膠酶譜，特別是對受到SDS強烈抑制的蛋白酶，如枯草芽孢桿菌(CGMCC No. 1.892)和枯草芽孢桿菌(CGMCC No. 1. 3M)，效果更加明顯。增加蛋白酶的上樣量可以抵消一部分SDS的影響，但是基於SDS-PAGE的酶譜方法依然受到其最高上樣量的限制，進一步濃縮蛋白費時費力。特別是遇到特別不耐受SDS的蛋白酶如枯草芽孢桿菌 (CGMCC No. 1.892)，增加上樣量的方法也無法應對。同時，我們還能發現，圖4(a)條帶的形狀要明顯優於圖4(b)，這表明普通酶譜方法酶活條帶易呈點狀擴散，形成重疊，降低酶譜的解析度。
權利要求
1.一種測定SDS敏感蛋白酶活力的酶譜方法，包括凝膠配製步驟和電泳步驟，其特徵在於電泳用聚丙烯醯胺凝膠由兩種不同組分配比的聚丙烯醯胺凝膠組成a.聚丙烯醯胺凝膠I由3質量份丙烯醯胺混合溶液I和1質量份濃縮膠緩衝液組成， 其中(1)丙烯醯胺混合溶液I由丙烯醯胺、過硫酸銨、N，N，N',N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為6. 67%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、 N，N，N'，N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比 0. 133%，pH 6. 8;(2)濃縮膠緩衝液為0.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 6. 8;b.聚丙烯醯胺凝膠II由3質量份丙烯醯胺混合溶液II和1質量份分離膠緩衝液組成，其中(1)丙烯醯胺混合溶液II由丙烯醯胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N',N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為13. 33%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%、明膠質量體積比 0. 133%, pH 8. 8;(2)分離膠緩衝液為1.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 8. 8;c.上述兩種聚丙烯醯胺凝膠分別配製完成後，按照體積比聚丙烯醯胺凝膠I聚丙烯醯胺凝膠11=2 5，用於製備電泳用聚丙烯醯胺凝膠。
2.根據權利要求1所述的測定SDS敏感蛋白酶活力的酶譜方法，其特徵在於電泳緩衝液中含有0. 5%o SDS0
全文摘要
一種測定SDS敏感蛋白酶活力的酶譜方法，包括凝膠配製步驟和電泳步驟，電泳用聚丙烯醯胺凝膠由兩種不同組分配比的聚丙烯醯胺凝膠組成。與Neutral-PAGE酶譜法相比，本方法不但能夠很好的檢測SDS敏感蛋白酶的活性，且能確定蛋白酶的分子量大小，並克服普通酶譜方法酶活條帶易呈點狀擴散，形成重疊的缺陷，提高酶譜的解析度。
文檔編號C12Q1/37GK102181515SQ20111005262
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月7日 優先權日2010年12月30日
發明者朱泓, 林先貴, 王一明 申請人:中國科學院南京土壤研究所