一種提高發酵法生產pva降解酶產量的方法

2023-11-06 22:00:22

專利名稱：：一種提高發酵法生產pva降解酶產量的方法
技術領域：
：本發明涉及一種提高發酵法生產PVA降解酶產量的方法，屬於發酵工程領域，具體來說是一種通過添加1，4_丁二醇提高發酵法生產PVA降解酶產量的方法。
背景技術：
：PVA降解酶是一個酶系，它們作用的共同效果是能降解PVA。目前已正式報導的PVA降解酶主要包含三個種類PVA氧化酶(仲醇氧化酶)(EC1.1.3.30)、PVA脫氫酶(EC1.1.99.23)和氧化型PVA水解酶(P-雙酮水解酶)(EC3.7.1.7)。近年還發現了專一性比較高的降解低醇解度PVA長鏈上殘存乙酸酯鍵的PVA酯酶。目前對於PVA降解的研究主要集中在三個方面1.篩選能夠降解PVA的微生物；2.純化PVA降解酶；3.克隆與PVA降解相關的基因。目前研究中的一個難點是PVA降解酶的酶活較低。現在主要有兩種提高PVA降解酶產量的方法l.篩選高產PVA降解酶的微生物；2.優化發酵條件。在PVA降解酶高產微生物的基礎上，本技術通過一種特殊碳源(1，4-丁二醇)顯著提高了PVA降解酶的產量，使其酶活水平達到了國內先進。
發明內容本發明所解決的技術問題是提供一種提高發酵法生產PVA降解酶產量的方法。為解決上述技術問題，本發明的技術方案如下在微生物發酵生產PVA降解酶過程中，添加1，4-丁二醇。所述1，4-丁二醇的添加方式為以5.0g/LPVA和5.lg/L1，4-丁二醇作為初始複合碳源。所述1，4-丁二醇的添加方式為以5.Og/LPVA作為唯一初始碳源，在發酵36h添加5.lg/Ll，4-丁二醇；所述1，4-丁二醇的添加方式為以5.Og/LPVA作為唯一初始碳源，在發酵36h添加5.lg/Ll，4-丁二醇，在發酵48h，添加5.Og/LPVA。所述微生物為從無錫太平洋紡織廠PVA退漿車間下水道口篩選出一個可以徹底降解培養基中lg/LPVA的混合微生物體系(ChenJ，ZhangY，DuG_C，HuaZ_Z，ZhuY，Biodegradationofpolyvinylalcoholbyamixedmicrobialculture,EnzymeMicrob.Technol.，2007，40(7)，1686-1691)。微生物發酵產PVA降解酶的培養基組成為基礎培養基(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0%)5.O，酵母粉2.0，K2HP041.0，KH2P040.125，MgS047H200.1，FeS047H200.05，CaCl20.025，NaCl0.01，pH7.5，121。C滅菌15min;微生物發酵產酶的過程為液體種子培養方法500mL三角瓶裝50mL基礎培養基，接種後在旋轉式搖床上200r/min，30。C振蕩培養36h;3兩步發酵法第一步，500mL三角瓶裝50mL基礎培養基，接種後在旋轉式搖床上200r/min，30。C振蕩培養;第二步，發酵36h添加5.lg/L1，4_丁二醇;三步發酵法第一步，500mL三角瓶裝50mL基礎培養基，接種後在旋轉式搖床上200r/min，3(TC振蕩培養；第二步，發酵36h添加5.lg/L1，4_丁二醇；第三步，發酵48h添加5.Og/LPVA。PVA含量測定採用Finley法，其具體方法為將發酵液離心(10000r/min，10min)，棄去沉澱，收集上清液。將上清液經微孔濾膜(孔徑0.45iim，直徑50mm)過濾，然後用0.lmol/L磷酸鉀緩衝液(pH8.0)透析24h，即為粗酶液。在5X15試管中加入0.5mL粗酶液和0.5mL底物(lg/LPVA1799溶於pH8.0的磷酸鉀緩衝液中)，將此混合體系於35°C反應6h，分別測定反應前後反應混合液所對應PVA含量的吸光度。每分鐘吸光度下降0.001定義為一個酶活單位。細胞乾重測定方法為將每個三角瓶中的發酵液過濾，收集菌體於濾紙上，去離子水洗兩次，在105t:烘箱中烘至恆重，稱量所得數值減去預先稱量好的濾紙的重量即為細胞乾重。發明的技術原理本發明採用的原料1，4-丁二醇是PVA的結構類似物，它在細胞內的代謝途徑和PVA類似，因此它不會抑制PVA降解酶的產生；同時它作為一種小分子碳源容易被微生物吸收利用，能提高微生物的生物量。所以1，4-丁二醇通過提高微生物的生物量，從而顯著提高PVA降解酶的產量。本發明的有益效果本發明提高發酵法生產PVA降解酶的產量，PVA降解酶產量從1.11U/mL高到3.43U/mL，為PVA降解酶的工業化生產提供了一種方法。本發明還具有操作簡單、原料價格便宜、效果明顯等優點。具體實施方式對比例1培養基組成基礎培養基(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0%)5.O，酵母粉2.0，K2HP041.0，KH2P040.125，MgS047H200.1，FeS047H200.05，CaCl20.025，NaCl0.01，pH7.5，121。C滅菌15min。微生物培養方法500mL三角瓶裝50mL基礎培養基，接種後在旋轉式搖床上200r/min，3(TC振蕩培養36h。結果見表l，在不添加1，4-丁二醇的情況下，混合體系發酵結束後，菌體乾重達到1.17g/L，PVA降解酶活力為1.11U/mL。表1混合碳源對混合微生物產PVA降解酶的影響tableseeoriginaldocumentpage5DCW:細胞乾重，PVADE:PVA降解酶。對比例2:培養基組成PVA和葡萄糖培養基(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0%)5.0，葡萄糖6.8，酵母粉2.0，K2HP041.0，KH2P040.125，MgS047H200.1，FeS047H200.05，CaCl20.025，NaCl0.01，pH7.5，121。C滅菌15min。微生物培養方法500mL三角瓶裝50mLPVA和葡萄糖培養基，接種後在旋轉式搖床上200r/min，30。C振蕩培養36h。結果見表l，在以PVA和葡萄糖作為複合碳源的情況下，混合體系發酵結束後，菌體乾重達到0.98g/L，PVA降解酶活力為1.16U/mL。對比例3:培養基組成PVA和澱粉(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0%)5.0，可溶性澱粉6.2，酵母粉2.0，K2HP041.0，KH2P040.125，MgS047H200.1，FeS047H200.05，CaCl20.025，NaCl0.01，pH7.5，121。C滅菌15min。微生物培養方法500mL三角瓶裝50mLPVA和澱粉培養基，接種後在旋轉式搖床上200r/min，30°C振蕩培養36h。結果見表l，在以PVA和可溶性澱粉作為複合碳源的情況下，混合體系發酵結束後，菌體乾重達到0.99g/L，PVA降解酶活力為1.33U/mL。實施例1:含有1，4_丁二醇的複合碳源培養基培養基組成PVA和1，4-丁二醇培養基(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0%)5.0，1，4-丁二醇5.1，酵母粉2.0，K2HP041.0，KH2P040.125，MgS047H200.1，FeS047H200.05，CaCl20.025，NaCl0.01，pH7.5，121。C滅菌15min。微生物培養方法培養方法500mL三角瓶裝50mLPVA和1，4_丁二醇培養基，接種後在旋轉式搖床上200r/min，30。C振蕩培養36h。結果見表l，在以PVA和葡萄糖作為複合碳源的情況下，混合體系發酵結束後，菌體乾重達到1.40g/L，PVA降解酶活力為2.12U/mL，相對於對比例，菌體乾重與PVA降解酶活力均有較大幅度提高。實施例2:培養基組成基礎培養基(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0%)5.O，酵母粉2.0，K2HP041.0，KH2P040.125，MgS047H200.1，FeS047H200.05，CaCl20.025，NaCl0.01，pH7.5，121。C滅菌15min。微生物培養方法兩步發酵法第一步，500mL三角瓶裝50mL基礎培養基，接種後在旋轉式搖床上200r/min，3(TC振蕩培養；第二步，發酵36h添加5.lg/Ll，4-丁二醇。結果見表l，發酵結束後，細胞乾重和PVA降解酶的產量都得到了提高，菌體乾重達到1.66g/L，PVA降解酶的活力達到2.92U/mL。實施例3:培養基組成基礎培養基(g/L):PVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0%)5.O，酵母粉2.0，K2HP041.0，KH2P040.125，MgS047H200.1，FeS047H200.05，CaCl20.025，NaCl0.01，pH7.5，12rC滅菌15min。微生物培養方法三步發酵法第一步，500mL三角瓶裝50mL基礎培養基，接種後在旋轉式搖床上200r/min，3(TC振蕩培養；第二步，發酵36h添加5.lg/L1，4_丁二醇；第三步，發酵48h添加5.Og/LPVA。結果見表l，發酵結束後，菌體乾重達到1.88g/L，PVA降解酶酶活達到了3.43U/mL，與起始的1.11U/mL相比提高了3倍。權利要求一種提高發酵法生產PVA降解酶產量的方法，其特徵在於，在微生物發酵生產PVA降解酶過程中添加1，4-丁二醇。2.根據權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述添加l，4-丁二醇的方法為以5.0g/LPVA和5.lg/L1，4-丁二醇作為初始碳源。3.根據權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述添加l，4-丁二醇的方法為以5.0g/LPVA作為唯一初始碳源，在發酵36h向發酵液中添加5.lg/L1，4-丁二醇。4.根據權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述添加l，4-丁二醇的方法為以5.0g/LPVA作為唯一初始碳源，在發酵36h向發酵液中添加5.lg/L1，4-丁二醇，在發酵48h向發酵液中添加5.Og/LPVA。全文摘要本發明公開了一種提高發酵法生產PVA降解酶產量的方法。通過在發酵過程中添加1，4-丁二醇，提高了PVA降解酶的產量。通過兩步發酵法、三步發酵法，發酵結束後，PVA降解酶產量分別達到2.92U/mL和3.43U/mL，與不添加1，4-丁二醇相比，產量分別提高了2.6倍和3倍。本發明還具有操作簡單、原料價格便宜等優點。文檔編號C12N9/04GK101724609SQ20091026099公開日2010年6月9日申請日期2009年12月18日優先權日2009年12月18日發明者唐波,堵國成,張東旭,陳堅申請人:江南大學