一種菌根化石斛苗茶樹仿野生栽培方法

2023-11-06 06:11:12 2

一種菌根化石斛苗茶樹仿野生栽培方法
【專利摘要】本發明屬於種植【技術領域】，具體涉及一種菌根化石斛苗茶樹仿野生栽培方法，所述的栽培方法包括：菌根真菌的發酵培養、石斛組培苗的培養、石斛苗與菌根真菌的共生栽培、菌根化的石斛苗煉苗方法、石斛組培苗與茶樹附生栽培方法五個步驟，採用本發明方法石斛的藥用價值及經濟效益均得到提高。
【專利說明】一種菌根化石斛苗茶樹仿野生栽培方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於種植【技術領域】，具體涉及一種菌根化石斛苗茶樹仿野生栽培方法。
【背景技術】
[0002]石斛為我國傳統名貴中藥材，我國曆版藥典均有記載。中藥石斛的原植物為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium Sw.)多年生草本植物。多年以來，商品石斛主要依靠野生藥用石斛資源，隨著藥用石斛開發利用的不斷深入和國內外需求量的逐年增加，我國野生藥用石斛資源遭到了嚴重破壞，有些地區甚至面臨枯竭。近年來，人們逐漸開始對石斛的野生植物進行家種栽培、高產栽培技術等加以實踐。
[0003]當前的人工栽培中，繁殖主要依靠分株繁殖和扦插繁殖，但該方法繁殖係數低，既不經濟，又限制了石斛的產量潛力，不便栽植管理推廣，因而擴大種植面積受到抑制。許多地方採用了組培繁殖方法以快速獲得大量幼苗；由於石斛在組培繁殖時是在人工環境中進行的，其藥用價值遠不及野生的鐵皮石斛，因此很有必要採用野生的方法種植鐵皮石斛。
【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題是:針對純人工種植石斛所具有的藥用價值的不足，提供一種仿野生種植方法，以提高石斛的藥用價值，提高經濟效益。
[0005]本發明通過下述技術方案實現的。
[0006]一種菌根化石斛苗茶樹仿野生栽培方法，其特徵包括以下步驟:
[0007]步驟1:菌根真菌的發酵培養
[0008]A.選取野生石斛的新鮮營養根，將根段浸入I %次氯酸鈣溶液中1-1Omin進行表面滅菌，然後用無菌水衝洗3-5次；將根段切成0.5-3mm長的小段，放置在分離培養基上，20-30°C下暗培養，待菌絲自根段中長成菌落後，挑取菌絲在分離培養基上進行培養純化後轉接於固體發酵培養基中，於2-30°C恆溫培養5-50天後在菌落邊緣打孔成菌片，直接使用或作為菌根真菌種子菌種進一步接入液體或固體發酵培養基進行放大培養；
[0009]所述的分離培養基為:葡萄糖l_30g / L、蛋白腖1-1Og / L、鏈黴素0.001-lg /L、研磨過的缺齒蓑蘚l_30g/L、乾酪素水解物0.01-1Og / L、瓊脂l_30gg/L，pH值4_9 ；
[0010]所述的發酵培養基為:馬鈴薯20-300g / L、葡萄糖2_300g / L、缺齒蓑蘚研磨物20-300g / L、蛋白腖l-30g / L、硫酸銨0.l_20g / L、磷酸二氫鉀0.l_20g/L、硫酸鎂0.l_20g/L、氯化錳 0.l-20g/L,瓊脂 l_30g / L，pH 值 4-9 ；
[0011]B.液體發酵培養
[0012]將菌根真菌種子菌種接入發酵培養基用三角瓶或其他容器振蕩或發酵罐通氣暗培養，培養結束後直接使用或用勻漿機打碎培養產物備用；發酵條件為:接種量6% -18%,溫度20-30°C，培養時間5-90h ；
[0013]C.固體發酵培養
[0014]將菌根真菌種子菌種接種至固體發酵培養基中，接種量6% -18%，溫度20_30°C下發酵培養2-50天，待菌絲50%~100%長滿培養基時獲得菌根真菌固體菌塊；
[0015]步驟2:石斛組培苗的培養
[0016]A.原球莖誘導及繼代增殖培養:採集野生石斛屬帶腋芽的幼莖，用75%的酒精浸泡50±10秒後，再用濃度為Ig / L的氯化汞溶液浸泡1-10分鐘，無菌水衝洗3-5遍，切取0.l-3cm 莖段接種到 I / 2MS+6-BA0.01-1Omg / L+NAA0.01-1Omg / L+研磨過的缺齒蓑蘚l-200g / L+馬鈴薯汁l-200g / L+蔗糖2-20g/L的瓊脂培養基上;pH為4-9，在20_30°C，光照強度為1500-2500LX，光照12h / d，培養10-90天，腋芽處可抽生新枝呈叢芽狀，新枝可切割重複培養，直至長成完整試管苗供移栽；或將誘導出的原球莖接種到繼代增殖液體培養基和繼代增殖固體培養基上交替培養，增殖培養10-60天為一個繼代周期，培養溫度20-30°C，光強度 1500-4000LX，光照 10-14 小時 / 天；
[0017]所述繼代增殖液體培養基為:1/ 2MS+6-BA0.1-1Omg / L+NAA0.1-1Omg / L+馬鈴薯煮汁2-200g / L+缺齒蓑蘚研磨物l_200g/L+活性炭0.1-1Og / L+蔗糖2_50g / L，pH4-9 ；
[0018]所述繼代增殖固體培養基為:1/ 2MS+6-BA0.1-1Omg / L+NAA0.1-1Omg / L+馬鈴薯汁2-200g / L+缺齒蓑蘚研磨物l_200g / L+活性炭0.l-10g/L+蔗糖2_50g/L+瓊脂l-30g / L, pH4-9 ；
[0019]B.生根壯苗培養:當無根苗高2-3釐米時轉接到壯苗生根培養基上培養；壯苗生根培養基為:1 / 2MS+NAA0.1-1Omg / L+研磨過的缺齒蓑蘚l_200g / L+香蕉勻漿20-200g / L+蔗糖 5-50g / L+活性炭 0.Ι-lOg/L+瓊脂 3_30g / L ;培養溫度 20_30°C，PH4-9，培養3-90天，此時光照加強至2500-4000LX，光照10-14小時/天；
[0020]步驟3:石斛苗與菌根真菌的共生栽培:在無菌條件下將根系正常的3-4葉組培苗接入菌根真菌固體菌塊中共生培養1-90天，在自然條件下培養；
[0021]步驟4:菌根化的石斛苗煉苗方法
[0022]A.恆溫下將試管苗在玻璃瓶中煉1-15天；
[0023]B.將石斛小苗從玻璃瓶中取出，洗淨根部的培養基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡3-10分鐘後涼幹，以浸泡殺菌處理過的泥炭蘚和/或缺齒蓑蘚為栽培基質，以(I /3-1 / 10)knop5-30g / L+蔗糖l_30g / L+酒石酸銨0.01_30g / L+菌根真菌發酵液
5-100mL / L為共生栽培營養液，以小塑料盆為栽培容器分級煉苗，取3_5株為一叢，將根部栽入栽培基質中，煉苗採用溫棚，溫度控制在10-38°C，空氣溼度為40% -85%，遮陰度50-70%，光照度1000-5000LX，澆水採取噴淋法，煉苗時間1_12個月；
[0024]步驟5:石斛組培苗與茶樹附生栽培方法
[0025]A.茶樹的選擇:選擇位於自然遮光度在60% -80%，光照為散射光，光照強度在1000-5000Lx環境下的茶樹樹幹；
[0026]B.石斛伴苔蘚貼樹種植:在茶樹近根部樹幹和茶樹根周圍直徑l_20cm處塗一層苔蘚混合物，厚度為0.1-lOcm，培養5-20天後將小塑料盆中的石斛苗和苔蘚基質一起移出綁牢在向陽麵茶樹枝幹苔蘚部位，使種苗根系貼緊樹幹苔蘚，基質下部緊貼樹幹周圍苔蘚混合物塗層；一叢3至5株，每叢相距10釐米以上；石斛捆綁在茶樹上後，連續7天用共生營養液對植株噴灑一次，潤溼植株根系及附近苔蘚；
[0027]所述的苔蘚混合物(w / w)由(I / 3-1 / 10)knop5_30、糯米5-20、發酵動物糞便10-70、苔蘚1-30、蔗糖1-10、酒石酸銨0.01-10、菌根真菌粉1_30 ；
[0028] C.石斛的採收:栽種後1-2年即可採收，採收時根部留2-3cm長根頭，剪老留嫩。
[0029]所述步驟I中的A為:
[0030]A.選取野生石斛的新鮮營養根，用流水衝洗掉根表面腐殖質和雜物；在超淨工作檯上將根段浸入I %次氯酸鈣溶液中1-1Omin進行表面滅菌，然後用無菌水衝洗3-5次；將根段切成0.5-3mm長的小段，放置在分離培養基上，20-30°C下暗培養，待菌絲自根段中長成菌落後，挑取菌絲在分離培養基上進行培養純化後轉接於固體發酵培養基中，於2-30°C恆溫培養5-50天後在菌落邊緣打孔成菌片，直接使用或作為菌根真菌種子菌種進一步接入液體或固體發酵培養基進行放大培養；
[0031]所述的分離培養基為:葡萄糖l_30g / L、蛋白腖1-1Og / L、鏈黴素0.001-lg /L、研磨過的缺齒蓑蘚l_30g/L、乾酪素水解物0.01-1Og / L、瓊脂l_30gg / L，pH值4-9 ；
[0032]所述的發酵培養基為:馬鈴薯20_300g / L、葡萄糖2_300g / L、缺齒蓑蘚研磨物20-300g/L、蛋白腖l-30g / L、硫酸銨0.l_20g / L、磷酸二氫鉀0.l_20g / L、硫酸鎂
0.l-20g / L、氯化錳 0.l-20g/L，瓊脂 l_30g / L，pH 值 4-9 ；
[0033]所述步驟2中的A為:
[0034]A.原球莖誘導及繼代增殖培養:在3-4月上旬，採集野生的石斛屬帶腋芽的幼莖，用流水衝洗5-15分鐘後在超淨工作檯上用75%的酒精浸泡50±10秒後，再用濃度為Ig / L的氯化汞溶液浸泡1-10分鐘，無菌水衝洗3-5遍，切取0.l_3cm莖段接種到I / 2MS+6-BA0.01-1Omg / L+NAA0.01-1Omg / L+研磨過的缺齒蓑蘚 l_200g/L+馬鈴薯汁l-200g / L+蔗糖2-20g / L的瓊脂培養基上；pH為4-9，在20-30°C，光照強度為1500-2500LX，光照12h / d，培養10-90天，腋芽處可抽生新枝呈叢芽狀，新枝可切割重複培養，直至長成完整試管苗供移栽；或將誘導出的原球莖接種到液體和固體增殖培養基上交替培養，增殖培養10-60天為一個繼代周期，培養溫度20-30°C，光強度1500-4000LX，光照10-14小時/天；
[0035]所述繼代增殖液體培養基為:1/ 2MS+6-BA0.1-1Omg / L+NAA0.1-1Omg / L+馬鈴薯煮汁2-200g / L+缺齒蓑蘚研磨物l_200g/L+活性炭0.1-1Og / L+蔗糖2_50g / L，pH4-9 ；
[0036]所述繼代增殖固體培養基為:1/ 2MS+6-BA0.1-1Omg / L+NAA0.1-1Omg / L+馬鈴薯汁2-200g / L+缺齒蓑蘚研磨物l_200g/L+活性炭0.1-1Og / L+蔗糖2_50g / L+瓊脂 l-30g / L，pH4-9 ；
[0037]所述步驟5為:
[0038]A.茶樹的選擇:茶地附近需有符合國家二級標準的水源，常年平均氣溫在10°C至20°C，空氣相對溫度在45%至85%之間，年均降雨量為800毫米至1800毫米；茶園向陽坡面的坡度大於5-20度，生長10年以上的茶園；定植前先要進行適當修枝打葉，使栽培石斛的樹幹處自然遮光度在60% -80%，光照為散射光，光照強度在1000-5000LX ；
[0039]B.石斛伴苔蘚貼樹種植:栽種時間為每年3月10日-4月10日，或9月份次之；在茶樹近根部樹幹和茶樹根周圍直徑l-20cm處塗一層苔蘚混合物，厚度為0.1-lOcm，培養
5-20d後將小塑料盆中的石斛苗和苔蘚基質一起移出綁牢在向陽麵茶樹枝幹苔蘚較多的部位，使種苗根系貼緊樹幹苔蘚，基質下部緊貼樹幹周圍苔蘚混合物塗層；一叢3至5株，每叢相距10釐米以上；石斛捆綁在茶樹上後，連續7天在早上8點前用共生營養液對植株噴灑一次，潤溼植株根系及附近苔蘚，確保苔蘚不能積水；
[0040]所述的苔蘚混合物(w / w)由(I / 3-1 / 10)knop5_30、糯米5-20、發酵動物糞便10-70、苔蘚1-30、蔗糖1-10、酒石酸銨0.01-10、菌根真菌粉1_30 ；
[0041]C.仿生石斛茶地種植管理:每年應除草2-3次，除去雜草和枯枝落葉；每年噴共生營養液1-12次；每天噴霧1-2次水，溼度控制在60-80%，冬春季適時剪去附主植株過密的枝條，以保證遮光度在70-80%，病蟲害高發時每旬可噴施一次植物源生物殺蟲劑；
[0042]D.石斛的採收:栽種後1-2年即可採收，收穫適宜期為立冬後至清明之前，採收時根部留2-3cm長根頭，剪老留嫩，可以繼續收穫8年以上。
[0043]所述的苔蘚包括泥炭蘚、缺齒蓑蘚、長葉紐蘚、擬闊葉小石蘚的一種或幾種。
[0044]所述的捆綁材料為無紡布、遮陰網、魚線、草繩、藤條的一種或幾種。
實施例
[0045]實施例1
[0046]步驟1:菌根真菌的發酵培養
[0047]A.選取野生石斛的新鮮營養根，用流水衝洗掉根表面腐殖質和雜物；在超淨工作檯上將根段浸入1%次氯酸鈣溶液中3min進行表面滅菌，然後用無菌水衝洗3-5次；將根段切成0.5-3mm長的小段， 放置在分離培養基上，27°C下暗培養，待菌絲自根段中長成菌落後，挑取菌絲在分離培養基上進行培養純化後轉接於固體發酵培養基中，於5°C恆溫培養40天後在菌落邊緣打孔成菌片，直接使用；
[0048]所述的分離培養基為:葡萄糖20g / L、蛋白腖Sg / L、鏈黴素0.5g / L、研磨過的缺齒蓑蘚25g / L、乾酪素水解物3g / L、瓊脂19g / L，pH值4;
[0049]所述的發酵培養基為:馬鈴薯120g / L、葡萄糖180g / L、缺齒蓑蘚研磨物100g /L、蛋白腖8g / L、硫酸銨5g / L、磷酸二氫鉀8g / L、硫酸鎂12g / L、氯化錳02g / L，瓊脂 IOg / 1^!1值9;
[0050]B.液體發酵培養
[0051]將菌根真菌種子菌種接入發酵培養基用三角瓶培養，用勻漿機打碎培養產物備用；發酵條件為:接種量12%，溫度25°C，培養時間30h ；
[0052]C.固體發酵培養
[0053]將菌根真菌種子菌種接種至固體發酵培養基中，接種量15%，溫度25°C下發酵培養40天，待菌絲90%長滿培養基時獲得菌根真菌固體菌塊；
[0054]步驟2:石斛組培苗的培養
[0055]A.原球莖誘導及繼代增殖培養:在3-4月上旬，採集野生的石斛屬帶腋芽的幼莖，用流水衝洗5-15分鐘後在超淨工作檯上用75%的酒精浸泡50±10秒後，再用濃度為Ig / L的氯化汞溶液浸泡7分鐘，無菌水衝洗3-5遍，切取0.l-3cm莖段接種到I /2MS+6-BA4mg / L+NAA0.5mg / L+研磨過的缺齒蓑蘚50g / L+馬鈴薯汁105g / L+鹿糖9g / L的瓊脂培養基上；pH為6，在22°C，光照強度為1500_2500Lx，光照12h / d，培養70天，腋芽處可抽生新枝呈叢芽狀，新枝可切割重複培養，直至長成完整試管苗供移栽；
[0056]所述繼代增殖液體培養基為:I / 2MS+6-BA3mg / L+NAA5mg / L+馬鈴薯煮汁80g / L+缺齒蓑蘚研磨物IlOg / L+活性炭6g / L+鹿糖37g / L, pH6 ；
[0057]所述繼代增殖固體培養基為:I / 2MS+6-BA3mg / L+NAA7mg / L+馬鈴薯汁IlOg / L+缺齒蓑蘚研磨物90g / L+活性炭3g / L+鹿糖29g / L+瓊脂20g / L, pH7 ；
[0058]B.生根壯苗培養:當無根苗高2-3釐米時轉接到壯苗生根培養基上培養；壯苗生根培養基為:1 / 2MS+NAA3mg / L+研磨過的缺齒蓑蘚150g / L+香蕉勻漿120g / L+蔗糖30g / L+活性炭5g / L+瓊脂20g / 1^;培養溫度251:，？冊，培養10天，此時光照加強至 2500-4000Lx，光照 10-14 小時 / 天；
[0059]步驟3:石斛苗與菌根真菌的共生栽培:在無菌條件下將根系正常的3-4葉組培苗接入菌根真菌固體菌塊中共生培養30天，在自然條件下培養；
[0060]步驟4:菌根化的石斛苗煉苗方法
[0061]A.恆溫下將試管苗在玻璃瓶中煉1-15天；[0062]B.將石斛小苗從玻璃瓶中取出，洗淨根部的培養基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡8分鐘後涼幹，以浸泡殺菌處理過的缺齒蓑蘚為栽培基質，以I / 7knop20g / L+蔗糖28g / L+酒石酸銨22g / L+菌根真菌發酵液27mL / L為共生栽培營養液，以小塑料盆為栽培容器分級煉苗，取3-5株為一叢，將根部栽入栽培基質中，煉苗採用溫棚，溫度控制在10-38°C，空氣溼度為40% -85%，遮陰度50_70%，光照度1000_5000Lx，澆水採取噴淋法，煉苗時間1-12個月；
[0063]步驟5:石斛組培苗與茶樹附生栽培方法
[0064]A.茶樹的選擇:茶地附近需有符合國家二級標準的水源，常年平均氣溫在10°C至20°C，空氣相對溫度在45%至85%之間，年均降雨量為800毫米至1800毫米；茶園向陽坡面的坡度大於5-20度，生長10年以上的茶園；定植前先要進行適當修枝打葉，使栽培石斛的樹幹處自然遮光度在60% -80%，光照為散射光，光照強度在1000-5000LX ；
[0065]B.石斛伴苔蘚貼樹種植:栽種時間為每年3月10日-4月10日，在茶樹近根部樹幹和茶樹根周圍直徑IOcm處塗一層苔蘚混合物，厚度為3cm，培養10天後將小塑料盆中的石斛苗和苔蘚基質一起移出綁牢在向陽麵茶樹枝幹苔蘚較多的部位，使種苗根系貼緊樹幹苔蘚，基質下部緊貼樹幹周圍苔蘚混合物塗層；一叢3至5株，每叢相距10釐米以上；用無紡布將石斛捆綁在茶樹上後，連續7天在早上8點前用共生營養液對植株噴灑一次，潤溼植株根系及附近苔蘚，確保苔蘚不能積水；
[0066]所述的苔蘚混合物由I / 9knopl0g、糯米Hg、發酵動物糞便40g、泥炭蘚25g、蔗糖3g、酒石酸銨2g、菌根真菌粉25g ；
[0067]C.仿生石斛茶地種植管理:每年應除草2-3次，除去雜草和枯枝落葉；每年噴共生營養液5次；每天噴霧1-2次水，溼度控制在60-80%，冬春季適時剪去附主植株過密的枝條，以保證遮光度在70-80%，病蟲害高發時每旬可噴施一次植物源生物殺蟲劑；
[0068]D.石斛的採收:栽種後1-2年即可採收，收穫適宜期為立冬後至清明之前，採收時根部留2-3cm長根頭，剪老留嫩，可以繼續收穫8年以上。
[0069]實施例2
[0070]步驟1:菌根真菌的發酵培養
[0071]A.選取野生石斛的新鮮營養根，用流水衝洗掉根表面腐殖質和雜物；在超淨工作檯上將根段浸入1%次氯酸鈣溶液中7min進行表面滅菌，然後用無菌水衝洗3-5次；將根段切成0.5-3mm長的小段，放置在分離培養基上，26°C下暗培養，待菌絲自根段中長成菌落後，挑取菌絲在分離培養基上進行培養純化後轉接於固體發酵培養基中，於8°C恆溫培養40天後在菌落邊緣打孔成菌片，作為菌根真菌種子菌種進一步接入液體發酵培養基進行放大培養；
[0072]所述的分離培養基為:葡萄糖15g / L、蛋白腖13g / L、鏈黴素0.3g / L、研磨過的缺齒蓑蘚IOg / L、乾酪素水解物3g / L、瓊脂23g / L，pH值4.5;
[0073]所述的發酵培養基為:馬鈴薯250g / L、葡萄糖100g / L、缺齒蓑蘚研磨物220g /L、蛋白腖21g / L、硫酸銨Ilg / L、磷酸二氫鉀14g / L、硫酸鎂IOg / L、氯化錳IOg / L，瓊脂 18g / L，pH 值 7 ;
[0074]B.液體發酵培養
[0075]將菌根真菌種子菌種接入發酵培養基用發酵罐通氣暗培養，培養結束後直接使用；發酵條件為:接種量10%，溫度25°C，培養時間70h ；
[0076]C.固體發酵培養
[0077]將菌根真菌種子菌種接種至固體發酵培養基中，接種量10%，溫度28°C下發酵培養30天，待菌絲80%長滿培養基時獲得菌根真菌固體菌塊；
[0078]步驟2:石斛組培苗的培養
[0079]A.原球莖誘導及繼代增殖培養:在3-4月上旬，採集野生的石斛屬帶腋芽的幼莖，用流水衝洗5-15分鐘後在超淨工作檯上用75%的酒精浸泡50±10秒後，再用濃度為Ig / L的氯化汞溶液浸泡3分鐘，無菌水衝洗3-5遍，切取0.l-3cm莖段接種到I /2MS+6-BA2mg / L+NAA5mg / L+研磨過的缺齒蓑蘚IlOg / L+馬鈴薯汁160g / L+鹿糖14g / L的瓊脂培養基上；pH為6，在27°C，光照強度為1500_2500Lx，光照12h / d，培養50天，腋芽處可抽生新枝呈叢芽狀，新枝可切割重複培養，直至長成完整試管苗供移栽；增殖培養20天為一個繼代周期，培養溫度23°C，光強度1500-4000LX，光照10-14小時/天；
[0080]所述繼代增殖液體培養基為:I / 2MS+6-BA3mg / L+NAA7mg / L+馬鈴薯煮汁160g / L+缺齒蓑蘚研磨物180g / L+活性炭5g / L+鹿糖32g / L, pH5 ；
[0081]所述繼代增殖固體培養基為:1/ 2MS+6-BA0.1-1Omg / L+NAA0.1-1Omg / L+馬鈴薯汁2-200g / L+缺齒蓑蘚研磨物l_200g / L+活性炭0.1-1Og / L+蔗糖2_50g / L+瓊脂 l-30g / L，pH4-9
[0082]B.生根壯苗培養:當無根苗高2-3釐米時轉接到壯苗生根培養基上培養；壯苗生根培養基為:1 / 2MS+NAA7mg / L+研磨過的缺齒蓑蘚130g / L+香蕉勻漿170g / L+蔗糖19g / L+活性炭3g / L+瓊脂17g / L ;培養溫度25°C，pH8，培養40天，此時光照加強至 2500-4000Lx，光照 10-14 小時 / 天；
[0083]步驟3:石斛苗與菌根真菌的共生栽培:在無菌條件下將根系正常的3-4葉組培苗接入菌根真菌固體菌塊中共生培養50天，在自然條件下培養；
[0084]步驟4:菌根化的石斛苗煉苗方法
[0085]A.恆溫下將試管苗在玻璃瓶中煉8天；
[0086]B.將石斛小苗從玻璃瓶中取出，洗淨根部的培養基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡3-10分鐘後涼幹，以浸泡殺菌處理過的泥炭蘚和缺齒蓑蘚為栽培基質，以I /8knop20g / L+蔗糖21g / L+酒石酸銨3g / L+菌根真菌發酵液70mL / L為共生栽培營養液，以小塑料盆為栽培容器分級煉苗，取3-5株為一叢，將根部栽入栽培基質中，煉苗採用溫棚，溫度控制在10-38°C，空氣溼度為40% -85%，遮陰度50-70%，光照度1000-5000Lx，澆水採取噴淋法，煉苗時間1-12個月；
[0087]步驟5:石斛組培苗與茶樹附生栽培方法
[0088]A.茶樹的選擇:茶地附近需有符合國家二級標準的水源，常年平均氣溫在10°C至20°C，空氣相對溫度在45%至85%之間，年均降雨量為800毫米至1800毫米；茶園向陽坡面的坡度大於5-20度，生長10年以上的茶園；定植前先要進行適當修枝打葉，使栽培石斛的樹幹處自然遮光度在60% -80%，光照為散射光，光照強度在1000-5000LX ；
[0089]B.石斛伴苔蘚貼樹種植:栽種時間為9月份；在茶樹近根部樹幹和茶樹根周圍直徑18cm處塗一層苔蘚混合物，厚度為6cm，培養16天後將小塑料盆中的石斛苗和苔蘚基質一起移出綁牢在向陽麵茶樹枝幹苔蘚較多的部位，使種苗根系貼緊樹幹苔蘚，基質下部緊貼樹幹周圍苔蘚混合物塗層；一叢3至5株，每叢相距10釐米以上；用遮陰網將石斛捆綁在茶樹上後，連續7天在早上8點前用共生營養液對植株噴灑一次，潤溼植株根系及附近苔蘚，確保苔蘚不能積水；
[0090]所述的苔蘚混合物由I / 4knopl8g、糯米13g、發酵動物糞便50g、缺齒蓑蘚Sg、蔗糖5g、酒石酸銨3g、菌根真菌粉7g ；
[0091]C.仿生石斛茶地種植管理:每年應除草2-3次，除去雜草和枯枝落葉；每年噴共生營養液7次；每天噴霧1-2次水，溼度控制在60-80%，冬春季適時剪去附主植株過密的枝條，以保證遮光度在70-80%，病蟲害高發時每旬可噴施一次植物源生物殺蟲劑； [0092]D.石斛的採收:栽種後1-2年即可採收，收穫適宜期為立冬後至清明之前，採收時根部留2-3cm長根頭，剪老留嫩，可以繼續收穫8年以上。
[0093]實施例3
[0094]步驟1:菌根真菌的發酵培養
[0095]A.選取野生石斛的新鮮營養根，用流水衝洗掉根表面腐殖質和雜物；在超淨工作檯上將根段浸入I %次氯酸鈣溶液中1-1Omin進行表面滅菌，然後用無菌水衝洗3-5次；將根段切成0.5-3mm長的小段，放置在分離培養基上，20-30°C下暗培養，待菌絲自根段中長成菌落後，挑取菌絲在分離培養基上進行培養純化後轉接於固體發酵培養基中，於23°C恆溫培養30天後在菌落邊緣打孔成菌片，作為菌根真菌種子菌種進一步接入液體；
[0096]所述的分離培養基為:葡萄糖Sg / L、蛋白腖4g / L、鏈黴素0.02g / L、研磨過的缺齒蓑蘚18g / L、乾酪素水解物3g / L、瓊脂7g / L，pH值4;
[0097]所述的發酵培養基為:馬鈴薯100g / L、葡萄糖120g / L、缺齒蓑蘚研磨物100g /L、蛋白腖l_30g / L、硫酸銨5g / L、磷酸二氫鉀2g / L、硫酸鎂7g / L、氯化錳5g / L，瓊脂 IOg / L，pH 值 4;
[0098]B.液體發酵培養
[0099]將菌根真菌種子菌種接入發酵培養基用三角瓶，用勻漿機打碎培養產物備用；發酵條件為:接種量8%，溫度28°C，培養時間59h ；
[0100]C.固體發酵培養
[0101]將菌根真菌種子菌種接種至固體發酵培養基中，接種量8%，溫度23°C下發酵培養20天，待菌絲60%長滿培養基時獲得菌根真菌固體菌塊；[0102]步驟2:石斛組培苗的培養
[0103]A.原球莖誘導及繼代增殖培養:在3-4月上旬，採集野生的石斛屬帶腋芽的幼莖，用流水衝洗12分鐘後在超淨工作檯上用75%的酒精浸泡50±10秒後，再用濃度為Ig / L的氯化汞溶液浸泡8分鐘，無菌水衝洗3-5遍，切取0.l-3cm莖段接種到I /2MS+6-BA8mg / L+NAA4mg / L+研磨過的缺齒蓑蘚50g / L+馬鈴薯汁100g / L+鹿糖8g /L的瓊脂培養基上；pH為8，在20-30°C，光照強度為1500_2500Lx，光照12h / d，培養20天，腋芽處可抽生新枝呈叢芽狀，新枝可切割重複培養，直至長成完整試管苗供移栽；
[0104]所述繼代增殖液體培養基為:I / 2MS+6-BA3mg / L+NAA4mg / L+馬鈴薯煮汁80g / L+缺齒蓑蘚研磨物60g / L+活性炭9g / L+鹿糖30g / L, pH7 ；
[0105]所述繼代增殖固體培養基為:1 / 2MS+6-BA3mg / L+NAA2mg / L+馬鈴薯汁IOg /L+缺齒蓑蘚研磨物50g / L+活性炭3g / L+蔗糖20g / L+瓊脂15g / L，pH6 ；
[0106]B.生根壯苗培養:當無根苗高2-3釐米時轉接到壯苗生根培養基上培養；壯苗生根培養基為:1 / 2MS+NAAlmg / L+研磨過的缺齒蓑蘚IOg / L+香蕉勻眾120g / L+鹿糖IOg / L+活性炭2g / L+瓊脂5g / L;培養溫度25°C，pH5，培養30天，此時光照加強至2500-4000Lx，光照 10-14 小時 / 天；
[0107]步驟3:石斛苗與菌根真菌的共生栽培:在無菌條件下將根系正常的3-4葉組培苗接入菌根真菌固體菌塊中共生培養10天，在自然條件下培養；
[0108]步驟4:菌根化的石斛苗煉苗方法
[0109]A.恆溫下將試管苗在玻璃瓶中煉10天；
[0110]B.將石斛小苗從玻璃瓶中取出，洗淨根部的培養基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡5分鐘後涼幹，以浸泡殺菌處理過的缺齒蓑蘚為栽培基質，以I / SknoplOg / L+蔗糖5g / L+酒石酸銨Ig / L+菌根真菌發酵液50mL / L為共生栽培營養液，以小塑料盆為栽培容器分級煉苗，取3-5株為一叢，將根部栽入栽培基質中，煉苗採用溫棚，溫度控制在10-38°C，空氣溼度為40% -85%，遮陰度50-70%，光照度1000_5000Lx，澆水採取噴淋法，煉苗時間8個月；
[0111]步驟5:石斛組培苗與茶樹附生栽培方法
[0112]A.茶樹的選擇:茶地附近需有符合國家二級標準的水源，常年平均氣溫在10°C至20°C，空氣相對溫度在45%至85%之間，年均降雨量為800毫米至1800毫米；茶園向陽坡面的坡度大於5-20度，生長10年以上的茶園；定植前先要進行適當修枝打葉，使栽培石斛的樹幹處自然遮光度在60% -80%，光照為散射光，光照強度在1000-5000LX:
[0113]B.石斛伴苔蘚貼樹種植:栽種時間為9月份；在茶樹根周圍直徑IOcm處塗一層苔蘚混合物，厚度為1cm，培養10天後將小塑料盆中的石斛苗和苔蘚基質一起移出綁牢在向陽麵茶樹枝幹苔蘚較多的部位，使種苗根系貼緊樹幹苔蘚，基質下部緊貼樹幹周圍苔蘚混合物塗層；一叢3至5株，每叢相距10釐米以上；用魚線將石斛捆綁在茶樹上後，連續7天在早上8點前用共生營養液對植株噴灑一次，潤溼植株根系及附近苔蘚，確保苔蘚不能積水；
[0114]所述的苔蘚混合物由I / 5knopl5g、糯米8g、發酵動物糞便60g、長葉紐蘚13g、鹿糖3g、酒石酸銨Id、菌根真菌粉13g ；
[0115]C.仿生石斛茶地種植管理:每年應除草2-3次，除去雜草和枯枝落葉；每年噴共生營養液10次；每天噴霧1-2次水，溼度控制在60-80%，冬春季適時剪去附主植株過密的枝條，以保證遮光度在70-80%，病蟲害高發時每旬可噴施一次植物源生物殺蟲劑；
[0116]D.石斛的採收:栽種後1-2年即可採收，收穫適宜期為立冬後至清明之前，採收時根部留2-3cm長根頭，剪老留嫩。
[0117]實施例4
[0118]步驟1:菌根真菌的發酵培養 [0119]A.選取野生石斛的新鮮營養根，用流水衝洗掉根表面腐殖質和雜物；在超淨工作檯上將根段浸入I %次氯酸鈣溶液中IOmin進行表面滅菌，然後用無菌水衝洗3-5次；將根段切成0.5-3mm長的小段，放置在分離培養基上，20°C下暗培養，待菌絲自根段中長成菌落後，挑取菌絲在分離培養基上進行培養純化後轉接於固體發酵培養基中，於2°C恆溫培養50天後在菌落邊緣打孔成菌片，作為菌根真菌種子菌種進一步接入固體發酵培養基進行放大培養；
[0120]所述的分離培養基為:葡萄糖30g / L、蛋白腖Ig / L、鏈黴素Ig / L、研磨過的缺齒蓑蘚IOg / L、乾酪素水解物0.01g / L、瓊脂Ig / L，pH值4 ;
[0121]所述的發酵培養基為:馬鈴薯20g / L、葡萄糖20g / L、缺齒蓑蘚研磨物20g / L、蛋白腖IOg / L、硫酸銨0.2g / L、磷酸二氫鉀0.2g / L、硫酸鎂0.1g / L、氯化錳20g /L,瓊脂 30g / L，pH 值 4 ;
[0122]B.液體發酵培養
[0123]將菌根真菌種子菌種接入發酵培養基用發酵罐通氣暗培養，培養結束後直接使用；發酵條件為:接種量6%%，溫度20°C，培養時間90h ;
[0124]C.固體發酵培養
[0125]將菌根真菌種子菌種接種至固體發酵培養基中，接種量18%，溫度20-30°C下發酵培養50天，待菌絲50% %長滿培養基時獲得菌根真菌固體菌塊；
[0126]步驟2:石斛組培苗的培養
[0127]A.原球莖誘導及繼代增殖培養:在3-4月上旬，採集野生的石斛屬帶腋芽的幼莖，用流水衝洗5-15分鐘後在超淨工作檯上用75%的酒精浸泡50±10秒後，再用濃度為Ig / L的氯化汞溶液浸泡I分鐘，無菌水衝洗3-5遍，切取0.l-3cm莖段接種到I /2MS+6-BA10mg / L+NAA0.01mg / L+研磨過的缺齒蓑蘚IOg / L+馬鈴薯汁IOg / L+鹿糖2g / L的瓊脂培養基上；pH為4，在20-30°C，光照強度為1500_2500Lx，光照12h / d，培養10天，腋芽處可抽生新枝呈叢芽狀，將誘導出的原球莖接種到液體和固體增殖培養基上交替培養，增殖培養10天為一個繼代周期，培養溫度20-30°C，光強度1500-4000LX，光照10-14小時/天；
[0128]所述繼代增殖液體培養基為:1 / 2MS+6-BA10mg / L+NAA0.1mg / L+馬鈴薯煮汁20g / L+缺齒蓑蘚研磨物IOg / L+活性炭Ig / L+鹿糖25g / L, pH4.9 ；
[0129]所述繼代增殖固體培養基為:1 / 2MS+6-BA0.1mg / L+NAA0.1mg / L+馬鈴薯汁200g / L+缺齒蓑蘚研磨物Ig / L+活性炭IOg / L+鹿糖2g / L+瓊脂Ig / L, pH4 ；
[0130]B.生根壯苗培養:當無根苗高2-3釐米時轉接到壯苗生根培養基上培養；壯苗生根培養基為:1 / 2MS+NAA0.1mg / L+研磨過的缺齒蓑蘚200g / L+香蕉勻漿20g / L+蔗糖50g / L+活性炭0.1g / L+瓊脂30g / L ;培養溫度20-30°C，pH4，培養3天，此時光照加強至2500-4000Lx，光照10-14小時/天；
[0131]步驟3:石斛苗與菌根真菌的共生栽培:在無菌條件下將根系正常的3-4葉組培苗接入菌根真菌固體菌塊中共生培養I天，在自然條件下培養；
[0132]步驟4:菌根化的石斛苗煉苗方法
[0133]A.恆溫下將試管苗在玻璃瓶中煉1-15天；
[0134]B.將石斛小苗從玻璃瓶中取出，洗淨根部的培養基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡3分鐘後涼幹，以浸泡殺菌處理過的泥炭蘚為栽培基質，以I / 10knop30g / L+蔗糖30g / L+酒石酸銨0.01g / L+菌根真菌發酵液5mL / L為共生栽培營養液，以小塑料盆為栽培容器分級煉苗，取3-5株為一叢，將根部栽入栽培基質中，煉苗採用溫棚，溫度控制在10-38°C，空氣溼度為40% -85%，遮陰度50-70%，光照度1000_5000Lx，澆水採取噴淋法，煉苗時間I個月；
[0135]步驟5:石斛組培苗與茶樹附生栽培方法
[0136]A.茶樹的選擇:茶地附近需有符合國家二級標準的水源，常年平均氣溫在10°C至20°C，空氣相對溫度在45%至85%之間，年均降雨量為800毫米至1800毫米；茶園向陽坡面的坡度大於5-20度，生長10年以上的茶園；定植前先要進行適當修枝打葉，使栽培石斛的樹幹處自然遮光度在60% -80%，光照為散射光，光照強度在1000-5000LX ；
[0137]B.石斛伴苔蘚貼樹種植:栽種時間為每年3月10日-4月10日；在茶樹近根部樹幹和茶樹根周圍直徑Icm處塗一層苔蘚混合物，厚度為10cm，培養5天後將小塑料盆中的石斛苗和苔蘚基質一起移出綁 牢在向陽麵茶樹枝幹苔蘚較多的部位，使種苗根系貼緊樹幹苔蘚，基質下部緊貼樹幹周圍苔蘚混合物塗層；一叢3至5株，每叢相距10釐米以上；用草繩將石斛捆綁在茶樹上後，連續7天在早上8點前用共生營養液對植株噴灑一次，潤溼植株根系及附近苔蘚，確保苔蘚不能積水；
[0138]所述的苔蘚混合物由I / 10knop30g、糯米5g、發酵動物糞便70g、擬闊葉小石蘚30g、鹿糖10g、酒石酸銨10g、菌根真菌粉Ig ；
[0139]C.仿生石斛茶地種植管理:每年應除草2-3次，除去雜草和枯枝落葉；每年噴共生營養液I次；每天噴霧I次水，溼度控制在60-80%，冬春季適時剪去附主植株過密的枝條，以保證遮光度在70-80%，病蟲害高發時每旬可噴施一次植物源生物殺蟲劑；
[0140]D.石斛的採收:栽種後2年清明之前採收，採收時根部留2-3cm長根頭，剪老留嫩。
[0141]實施例5
[0142]步驟1:菌根真菌的發酵培養
[0143]A.選取野生石斛的新鮮營養根，用流水衝洗掉根表面腐殖質和雜物；在超淨工作檯上將根段浸入I %次氯酸鈣溶液中IOmin進行表面滅菌，然後用無菌水衝洗3-5次；將根段切成0.5-3mm長的小段，放置在分離培養基上，30°C下暗培養，待菌絲自根段中長成菌落後，挑取菌絲在分離培養基上進行培養純化後轉接於固體發酵培養基中，於30°C恆溫培養5天後在菌落邊緣打孔成菌片，直接使用；
[0144]所述的分離培養基為:葡萄糖30g / L、蛋白腖Ig / L、鏈黴素0.0Olg / L、研磨過的缺齒蓑蘚Ig / L、乾酪素水解物IOg / L、瓊脂30g / L，pH值9 ;
[0145]所述的發酵培養基為:馬鈴薯300g / L、葡萄糖2g / L、缺齒蓑蘚研磨物20g /L、蛋白腖Ig / L、硫酸銨0.1g / L、磷酸二氫鉀20g / L、硫酸鎂0.1g / L、氯化錳0.1g /L,瓊脂 30g / L，pH 值 4-9 ；
[0146] B.液體發酵培養
[0147]將菌根真菌種子菌種接入發酵培養基用三角瓶振蕩培養，培養結束後直接使用；發酵條件為:接種量6%，溫度20°C，培養時間90h ；
[0148]C.固體發酵培養
[0149]將菌根真菌種子菌種接種至固體發酵培養基中，接種量6%%，溫度20°C下發酵培養50天，待菌絲100%長滿培養基時獲得菌根真菌固體菌塊；
[0150]步驟2:石斛組培苗的培養
[0151]A.原球莖誘導及繼代增殖培養:在3-4月上旬，採集野生的石斛屬帶腋芽的幼莖，用流水衝洗5-15分鐘後在超淨工作檯上用75%的酒精浸泡50±10秒後，再用濃度為Ig / L的氯化汞溶液浸泡10分鐘，無菌水衝洗3-5遍，切取0.l-3cm莖段接種到I /2MS+6-BA10mg / L+NAA0.01mg / L+研磨過的缺齒蓑蘚200g / L+馬鈴薯汁Ig / L+蔗糖2g / L的瓊脂培養基上；pH為9，在30°C，光照強度為1500-2500LX，光照12h / d，培養90天，腋芽處可抽生新枝呈叢芽狀，新枝可切割重複培養，將誘導出的原球莖接種到液體和固體增殖培養基上交替培養，增殖培養60天為一個繼代周期，培養溫度20-30°C，光強度1500-4000Lx，光照 10-14 小時 / 天；
[0152]所述繼代增殖液體培養基為:1 / 2MS+6-BA10mg / L+NAA0.1mg / L+馬鈴薯煮汁200g / L+缺齒蓑蘚研磨物I / L+活性炭0.1g / L+蔗糖2g / L，pH4 ；
[0153]所述繼代增殖固體培養基為:1 / 2MS+6-BA0.1mg / L+NAA10mg / L+馬鈴薯汁200g / L+缺齒蓑蘚研磨物200g / L+活性炭IOg / L+鹿糖2g / L+瓊脂30g / L, pH9 ；
[0154]B.生根壯苗培養:當無根苗高2-3釐米時轉接到壯苗生根培養基上培養；壯苗生根培養基為:1 / 2MS+NAA10mg / L+研磨過的缺齒蓑蘚200g / L+香蕉勻漿20g / L+蔗糖5g / L+活性炭0.1g / L+瓊脂30g / L;培養溫度30°C，pH4，培養90天，此時光照加強至 2500-4000Lx，光照 10-14 小時 / 天；
[0155]步驟3:石斛苗與菌根真菌的共生栽培:在無菌條件下將根系正常的3-4葉組培苗接入菌根真菌固體菌塊中共生培養90天，在自然條件下培養；
[0156]步驟4:菌根化的石斛苗煉苗方法
[0157]A.恆溫下將試管苗在玻璃瓶中煉15天；
[0158]B.將石斛小苗從玻璃瓶中取出，洗淨根部的培養基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡3-10分鐘後涼幹，以浸泡殺菌處理過的泥炭蘚為栽培基質，以I / 3knop5g / L+蔗糖Ig / L+酒石酸銨0.01g / L+菌根真菌發酵液5mL / L為共生栽培營養液，以小塑料盆為栽培容器分級煉苗，取3-5株為一叢，將根部栽入栽培基質中，煉苗採用溫棚，溫度控制在380C，空氣溼度為85%，遮陰度70%，光照度1000-5000LX，澆水採取噴淋法，煉苗時間12個月；
[0159]步驟5:石斛組培苗與茶樹附生栽培方法
[0160]A.茶樹的選擇:茶地附近需有符合國家二級標準的水源，常年平均氣溫在10°C至20°C，空氣相對溫度在45%至85%之間，年均降雨量為800毫米至1800毫米；茶園向陽坡面的坡度大於5-20度，生長10年以上的茶園；定植前先要進行適當修枝打葉，使栽培石斛的樹幹處自然遮光度在60% -80%，光照為散射光，光照強度在1000-5000LX ；
[0161]B.石斛伴苔蘚貼樹種植:栽種時間為每年3月10日-4月10日；在茶樹近根部樹幹和茶樹根周圍直徑20cm處塗一層苔蘚混合物，厚度為0.1cm,培養20天後將小塑料盆中的石斛苗和苔蘚基質一起移出綁牢在向陽麵茶樹枝幹苔蘚較多的部位，使種苗根系貼緊樹幹苔蘚，基質下部緊貼樹幹周圍苔蘚混合物塗層；一叢3至5株，每叢相距10釐米以上；用藤條將石斛捆綁在茶樹上後，連續7天在早上8點前用共生營養液對植株噴灑一次，潤溼植株根系及附近苔蘚，確保苔蘚不能積水；
[0162]所述的苔蘚混合物由I / 3knop5g、糯米20g、發酵動物糞便10g、擬闊葉小石蘚lg、缺齒蓑蘚4g、蔗糖lg、酒石酸銨0.01g、菌根真菌粉30g ；
[0163]C.仿生石斛茶地種植管理:每年應除草2-3次，除去雜草和枯枝落葉；每年噴共生營養液12次；每天噴霧I次水，溼度控制在60-80%，冬春季適時剪去附主植株過密的枝條，以保證遮光度在70-80%，病蟲害高發時每旬可噴施一次植物源生物殺蟲劑；
[0164]D.石斛的採收:栽種後I年立冬時採收,採收時根部留2_3cm長根頭，剪老留嫩。[0165]試驗例:對足趾角叉菜膠所致急性炎症的抑制作用
[0166]水溶性提取物的製備方法:採用實施例1~5所得的石斛及市售人工培養石斛進行榨汁。
[0167]實驗方法:大鼠隨機分組，每組10隻，於致炎前I小時灌胃給藥(2g生藥/ kg),無菌操作，給大鼠右後足趾腱膜下注射10%角叉菜膠0.1ml致炎，用排水法測定致炎前及致炎後不同時間的右後足趾容積，以致炎前後的足容積差值為腫脹值，根據腫脹值計算腫脹率及抑制率。實驗結果見下表1:
[0168]腫脹率％=En-Ea / EnXlOO
[0169]En=致炎後不同時間的腫脹值
[0170]Etl=致炎前的腫脹值
[0171]抑制率％=C-T / CX100
[0172]C=對照組的腫脹率
[0173]T=治療組的腫脹率
[0174]表1不同石斛水溶性提取物對大鼠足趾角叉菜膠所致急性炎症的抑制作用
[0175]
【權利要求】
1.一種菌根化石斛苗茶樹仿野生栽培方法，其特徵包括以下步驟: 步驟1:菌根真菌的發酵培養 A.選取野生石斛的新鮮營養根，將根段浸入1%次氯酸鈣溶液中1-1Omin進行表面滅菌，然後用無菌水衝洗3-5次；將根段切成0.5-3mm長的小段，放置在分離培養基上，.20-30°C下暗培養，待菌絲自根段中長成菌落後，挑取菌絲在分離培養基上進行培養純化後轉接於固體發酵培養基中，於2-30°C恆溫培養5-50天後在菌落邊緣打孔成菌片，直接使用或作為菌根真菌種子菌種進一步接入液體或固體發酵培養基進行放大培養； 所述的分離培養基為:葡萄糖l_30g / L、蛋白腖1-1Og / L、鏈黴素0.001-lg / L、研磨過的缺齒蓑蘚l-30g / L、乾酪素水解物0.01-10g/L、瓊脂l-30gg / L，pH值4_9 ; 所述的發酵培養基為:馬鈴薯20-300g / L、葡萄糖2-300g / L、缺齒蓑蘚研磨物20-300g / L、蛋白腖l-30g/L、硫酸銨0.l_20g/L、磷酸二氫鉀0.l_20g / L、硫酸鎂.0.l-20g / L、氯化 錳 0.l-20g / L，瓊脂 l_30g / L，pH 值 4-9 ； B.液體發酵培養 將菌根真菌種子菌種接入發酵培養基用三角瓶或其他容器振蕩或發酵罐通氣暗培養，培養結束後直接使用或用勻漿機打碎培養產物備用；發酵條件為:接種量6% -18%，溫度.20-30°C，培養時間 5-90h ； C.固體發酵培養 將菌根真菌種子菌種接種至固體發酵培養基中，接種量6 % -18 %，溫度20-30 V下發酵培養2-50天，待菌絲50%~100%長滿培養基時獲得菌根真菌固體菌塊； 步驟2:石斛組培苗的培養 A.原球莖誘導及繼代增殖培養:採集野生石斛屬帶腋芽的幼莖，用75%的酒精浸泡.50±10秒後，再用濃度為Ig / L的氯化汞溶液浸泡1-10分鐘，無菌水衝洗3-5遍，切取.0.l-3cm 莖段接種到 I / 2MS+6-BA0.01-1Omg / L+NAA0.01-10mg/L+研磨過的缺齒蓑蘚.1-200g / L+馬鈴薯汁l-200g / L+蔗糖2-20g / L的瓊脂培養基上;pH為4-9，在20_30°C，光照強度為1500-2500LX，光照12h / d，培養10-90天，腋芽處可抽生新枝呈叢芽狀，新枝可切割重複培養，直至長成完整試管苗供移栽；或將誘導出的原球莖接種到繼代增殖液體培養基和繼代增殖固體培養基上交替培養，增殖培養10-60天為一個繼代周期，培養溫度.20-30°C，光強度 1500-4000LX，光照 10-14 小時 / 天； 所述繼代增殖液體培養基為:1 / 2MS+6-BA0.1-1Omg / L+NAA0.l-10mg/L+馬鈴薯煮汁 2-200g / L+缺齒蓑蘚研磨物 l-200g / L+活性炭 0.1-1Og / L+蔗糖 2_50g / L，pH4_9 ； 所述繼代增殖固體培養基為:1 / 2MS+6-BA0.1-1Omg / L+NAA0.1-1Omg / L+馬鈴薯汁2-200g / L+缺齒蓑蘚研磨物l-200g / L+活性炭0.Ι-lOg/L+蔗糖2_50g / L+瓊脂.l-30g / L, pH4-9 ； B.生根壯苗培養:當無根苗高2-3釐米時轉接到壯苗生根培養基上培養；壯苗生根培養基為:1 / 2MS+NAA0.1-1Omg / L+研磨過的缺齒蓑蘚l_200g / L+香蕉勻漿20_200g /L+ 蔗糖 5-50g / L+ 活性炭 0.l-10g/L+ 瓊脂 3_30g / L ;培養溫度 20-30。。，pH4_9，培養.3-90天，此時光照加強至2500-4000LX，光照10-14小時/天； 步驟3:石斛苗與菌根真菌的共生栽培:在無菌條件下將根系正常的3-4葉組培苗接入菌根真菌固體菌塊中共生培養1-90天，在自然條件下培養；步驟4:菌根化的石斛苗煉苗方法 A.恆溫下將試管苗在玻璃瓶中煉1-15天； B.將石斛小苗從玻璃瓶中取出，洗淨根部的培養基，在0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡3-10分鐘後涼幹，以浸泡殺菌處理過的泥炭蘚和/或缺齒蓑蘚為栽培基質，以(I / 3-1 /10)knop5-30g / L+鹿糖 l_30g / L+酒石酸銨 0.01_30g / L+菌根真菌發酵液 5-100mL /L為共生栽培營養液，以小塑料盆為栽培容器分級煉苗，取3-5株為一叢，將根部栽入栽培基質中，煉苗採用溫棚，溫度控制在10-38°C，空氣溼度為40 % -85 %，遮陰度50-70 %，光照度1000-5000LX，澆水採取噴淋法，煉苗時間1-12個月； 步驟5:石斛組培苗與茶樹附生栽培方法 A.茶樹的選擇:選擇位於自然遮光度在60%-80%，光照為散射光，光照強度在1000-5000Lx環境下的茶樹樹幹； B.石斛伴苔蘚貼樹種植:在茶樹近根 部樹幹和茶樹根周圍直徑l-20cm處塗一層苔蘚混合物，厚度為0.1-lOcm，培養5-20天後將小塑料盆中的石斛苗和苔蘚基質一起移出綁牢在向陽麵茶樹枝幹苔蘚部位，使種苗根系貼緊樹幹苔蘚，基質下部緊貼樹幹周圍苔蘚混合物塗層；一叢3至5株，每叢相距10釐米以上；石斛捆綁在茶樹上後，連續7天用共生營養液對植株噴灑一次，潤溼植株根系及附近苔蘚； 所述的苔蘚混合物(w / w)由(I / 3-1 / 10) knop5-30、糯米5-20、發酵動物糞便10-70、苔蘚1-30、蔗糖1-10、酒石酸銨0.01-10、菌根真菌粉1_30 ； C.石斛的米收:栽種後1-2年即可米收,米收時根部留2_3cm長根頭,到老留嫩。
2.根據權利要求1所述的栽培方法，其特徵所述步驟I中的A為: A.選取野生石斛的新鮮營養根，用流水衝洗掉根表面腐殖質和雜物；在超淨工作檯上將根段浸入I %次氯酸鈣溶液中1-1Omin進行表面滅菌，然後用無菌水衝洗3-5次；將根段切成0.5-3mm長的小段，放置在分離培養基上，20_30°C下暗培養，待菌絲自根段中長成菌落後，挑取菌絲在分離培養基上進行培養純化後轉接於固體發酵培養基中，於2-30°C恆溫培養5-50天後在菌落邊緣打孔成菌片，直接使用或作為菌根真菌種子菌種進一步接入液體或固體發酵培養基進行放大培養； 所述的分離培養基為:葡萄糖l_30g / L、蛋白腖1-1Og / L、鏈黴素0.001-lg / L、研磨過的缺齒蓑蘚l_30g/L、乾酪素水解物0.01-1Og / L、瓊脂l-30gg / L，pH值4_9 ; 所述的發酵培養基為:馬鈴薯20-300g/L、葡萄糖2-300g / L、缺齒蓑蘚研磨物20-300g / L、蛋白腖l-30g/L、硫酸銨0.l_20g / L、磷酸二氫鉀0.l_20g / L、硫酸鎂0.l-20g / L、氯化錳 0.l-20g / L，瓊脂 l_30g / L，pH 值 4-9。
3.根據權利要求1所述的栽培方法，其特徵所述步驟2中的A為: A.原球莖誘導及繼代增殖培養:在3-4月上旬，採集野生的石斛屬帶腋芽的幼莖，用流水衝洗5-15分鐘後在超淨工作檯上用75%的酒精浸泡50± 10秒後，再用濃度為I克/升的氯化汞溶液浸泡1-10分鐘，無菌水衝洗3-5遍，切取0.l-3cm莖段接種到I /2MS+6-BA0.01-1Omg / L+NAA0.01-1Omg / L+研磨過的缺齒蓑蘚 l_200g / L+馬鈴薯汁l-200g / L+蔗糖2-20g / L的瓊脂培養基上；pH為4_9，在20-30 V，光照強度為1500-2500LX，光照12h / d，培養10-90天，腋芽處可抽生新枝呈叢芽狀，新枝可切割重複培養，直至長成完整試管苗供移栽；或將誘導出的原球莖接種到液體和固體增殖培養基上交替培養，增殖培養10-60天為一個繼代周期，培養溫度20-30°C，光強度1500-4000LX，光照10-14小時/天； 所述繼代增殖液體培養基為:1 / 2MS+6-BA0.1-1Omg / L+NAA0.1-1Omg / L+馬鈴薯煮汁2-200g / L+缺齒蓑蘚研磨物l-200g / L+活性炭0.1-1Og / L+蔗糖2_50g / L，pH4-9 ； 所述繼代增殖固體培養基為:1 / 2MS+6-BA0.1-1Omg / L+NAA0.1-1Omg / L+馬鈴薯汁2-200g / L+缺齒蓑蘚研磨物l-200g / L+活性炭0.1-1Og / L+蔗糖2_50g / L+瓊脂l-30g / L，pH4-9。
4.根據權利要求1所述的栽培方法，其特徵所述步驟5為: A.茶樹的選擇:茶地附近需有 符合國家二級標準的水源，常年平均氣溫在10°C至20°C，空氣相對溫度在45%至85%之間，年均降雨量為800毫米至1800毫米；茶園向陽坡面的坡度大於5-20度，生長10年以上的茶園；定植前先要進行適當修枝打葉，使栽培石斛的樹幹處自然遮光度在60% -80%，光照為散射光，光照強度在1000-5000LX ； B.石斛伴苔蘚貼樹種植:栽種時間為每年3月10日-4月10日，或9月份次之；在茶樹近根部樹幹和茶樹根周圍直徑l_20cm處塗一層苔蘚混合物，厚度為0.1-lOcm，培養5_20d後將小塑料盆中的石斛苗和苔蘚基質一起移出綁牢在向陽麵茶樹枝幹苔蘚較多的部位，使種苗根系貼緊樹幹苔蘚，基質下部緊貼樹幹周圍苔蘚混合物塗層；一叢3至5株，每叢相距10釐米以上；石斛捆綁在茶樹上後，連續7天在早上8點前用共生營養液對植株噴灑一次，潤溼植株根系及附近苔蘚，確保苔蘚不能積水； 所述的苔蘚混合物(w / w)由(I / 3-1 / 10)knop5-30、糯米5-20、發酵動物糞便10-70、苔蘚1-30、蔗糖1-10、酒石酸銨0.01-10、菌根真菌粉1_30 ； C.仿生石斛茶地種植管理:每年應除草2-3次，除去雜草和枯枝落葉；每年噴共生營養液1-12次；每天噴霧1-2次水，溼度控制在60-80%，冬春季適時剪去附主植株過密的枝條，以保證遮光度在70-80%，病蟲害高發時每旬可噴施一次植物源生物殺蟲劑； D.石斛的採收:栽種後1-2年即可採收，收穫適宜期為立冬後至清明之前，採收時根部留2-3cm長根頭，剪老留嫩，可以繼續收穫8年以上。
5.根據權利要求1、4所述的栽培方法，其特徵在於:所述的苔蘚包括泥炭蘚、缺齒蓑蘚、長葉紐蘚、擬闊葉小石蘚的一種或幾種。
6.根據權利要求1、4所述的栽培方法，其特徵在於:所述的捆綁材料為無紡布、遮陰網、魚線、草繩、藤條的一種或幾種。
【文檔編號】A01G31/00GK103918551SQ201410024655
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年1月16日 優先權日:2014年1月16日
【發明者】郭景龍, 潘啟仁, 吳小生, 劉焱晶, 陳春, 彭中勝, 王澤雨 申請人:貴州清控置業有限公司