一種基於圖像分析的腫瘤細胞DNA含量檢測方法與流程

2023-11-06 19:58:32 1

本發明涉及生物醫學領域與計算機圖像分析應用領域，具體是一種基於圖像分析的腫瘤細胞DNA含量檢測方法。

背景技術：

近年來，隨著環境汙染，食品安全等問題日趨嚴重，我國癌症發病率呈上升趨勢，據報導，2015年我國約有430萬人被確診癌症，另外280萬人因癌症去世。癌症因其極高的死亡率也成為我國公共健康的主要問題。如何能更早、更準確地發現癌症病情，對降低癌症病人的死亡率有重要意義。

對癌症腫瘤的診斷有很多方法，其中DNA的定量分析在幫助發現癌前病變、協助腫瘤早期診斷中有著重要的意義。

人體正常細胞均具有比較穩定的DNA二倍體含量。當人體發生癌變或具有惡性潛能的癌前病變時,在其發生、發展過程中可伴隨細胞DNA含量的異常改變,因此DNA的精確測量,可作為診斷癌前病變發展至癌變中的一個有價值的標誌,能對癌前病變的性質及發展趨勢作出科學估價,有助於癌變的早期診斷。

DNA的定量分析還有助於腫瘤的診斷及預後判斷。DNA非整倍體細胞峰的存在可為腫瘤診斷提供有力的依據。腫瘤細胞DNA倍體分析對病人預後的判斷有重要作用,異倍體腫瘤惡性病變的復發率高、轉移率高、死亡率也高,而二倍體及近二倍體腫瘤的預後則較好。

同時,DNA的定量分析在腫瘤療效評估及細胞凋亡和多藥耐藥基因研究中的作用也不可忽略。如流式細胞術可根據化療過程中腫瘤細胞DNA分布直方圖的變化,了解細胞動力學的變化,可根據細胞周期各時相的分布情況,及時選用有效的藥物,設計最佳的治療方案,對腫瘤細胞達到最大的殺傷效果。通過DNA含量分析,結合對細胞體積、光散射及特異性抗原基因測定,還可分析細胞凋亡的情況。檢測DNA含量,有助於對多藥耐藥基因和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達的測定,可為臨床治療效果分析提供依據。

DNA含量測定對分析腫瘤的早期診斷、組織學的分級和預後的判斷及治療方案選擇有較大的參考價值。

傳統腫瘤細胞DNA含量檢測的方法有定糖法、分光光度法等，由於傳統方法檢測繁瑣，檢測時間較長，不能完成對病人腫瘤細胞的及時診斷。

本發明根據腫瘤細胞與正常二倍體細胞DNA含量的不同，採用顯微拍照技術，獲取正常二倍體細胞與腫瘤細胞病理切片照片，利用計算機圖像分析技術，測量並比較腫瘤細胞DNA含量與正常二倍體細胞DNA含量的差異，判斷病變細胞是否為腫瘤細胞，該方法不僅方便快捷，而且準確性更高。

技術實現要素：

本發明的目的是採用先進的圖像分析技術，對細胞的DNA含量進行測定，並根據腫瘤細胞與正常二倍體細胞的差異，判斷所檢測的細胞是否為腫瘤細胞，對腫瘤病變的篩查與早期診斷有重要的作用。

本發明的基本思路是：由於腫瘤細胞在發生、發展過程中，常常因為DNA含量大量增加而細胞不分裂，形成了DNA非整倍體細胞。DNA的非整倍體性已經是腫瘤的公認特異性標誌之一。本發明的工作原理是根據腫瘤細胞在顯微鏡下觀察可見癌細胞具有一定的形態異常，如細胞核形態異常、核漿比失調、染色質增多等。基於此，本發明通過採集正常二倍體細胞和腫瘤細胞的圖像，通過圖像分析方法，根據腫瘤細胞與正常二倍體細胞細胞核圖像顏色的差異性，通過圖像分析，計算出細胞的DNA指數(DI)，然後根據細胞DI值異常情況，判斷病人細胞的變異情況。

本發明目的是這樣達到的：本發明進行檢測所需的硬體設備包括顯微鏡、攝像頭、計算機和印表機。攝像頭安裝在顯微鏡上部，通過顯微鏡攝像接口與顯微鏡相連，對顯微鏡下觀察到的視野進行圖像採集；攝像頭通過數據連接線連接到計算機的USB埠，將攝像頭觀察到的病理切片圖像傳輸到計算機；印表機通過USB埠和計算機相連。

在進行腫瘤細胞DNA含量檢測時，包括長度標定、背景校準、正常二倍體細胞測量、腫瘤細胞測量、DNA報告生成五個步驟：首先將一個核准的透光載玻片刻度尺放到顯微鏡載物臺上，通過攝像頭，將透光載玻片刻度尺圖像拍攝到計算機，按住滑鼠左鍵在刻度尺圖像上拖動，分析軟體根據拖動刻度的實際值與拖動的像素點數，計算出當前顯微鏡倍數下所採集圖像每一個像素點的實際值，完成長度標定；然後將病人標本切片放在顯微鏡載物臺上，通過調整顯微鏡視野，使當前視野調整到切片中無細胞的空白位置處，通過調整顯微鏡光亮，使顯微鏡視野的圖像灰度直方圖的峰值位於220～230之間，採集當前視野圖像並保存，完成背景校準操作；隨後，在顯微鏡下選擇具有典型正常二倍體細胞的視野，將病人正常二倍體細胞的圖像採集進計算機，通過圖像分割，將細胞核從背景中分割出來，計算出正常二倍體細胞細胞核的平均光密度值；緊接著移動顯微鏡的X軸與Y軸，選擇多個具有病變細胞的視野，分別採集每個視野的圖像並保存，對每個視野的細胞核進行圖像分割，根據細胞核與背景顏色灰度值差異，將細胞核從背景中分割出來，計算分割出細胞核中每個細胞核的平均光密度值和DNA指數DI，生成DNA直方圖和散點圖；最後，根據檢測的結果，生成DNA檢測報告，形成診斷建議。

具體流程是：長度標定、背景校準、正常二倍體細胞測量、腫瘤細胞測量、DNA報告生成五個步驟：首先採集刻度尺圖像、進行長度標定；採集背景圖像、測量背景圖像像素點灰度值；採集正常二倍體細胞圖像，對二倍體細胞圖像進行圖像分割，測量二倍體細胞核的灰度值，計算二倍體細胞核的平均光密度值；採集腫瘤細胞圖像，對腫瘤細胞進行圖像分割，測量每個腫瘤細胞核像素點的光密度值，計算每個腫瘤細胞核的DI值和面積；生成DNA直方圖和散點圖，按DI分類統計各類細胞的數量，生成DNA檢測報告。

長度標定的具體步驟是：首先將一個核准的透光載玻片刻度尺放到顯微鏡載物臺上，通過攝像頭，將刻度尺圖像拍攝到計算機，按住滑鼠左鍵在刻度尺圖像上拖動，分析軟體根據拖動刻度的實際長度值與拖動的像素點數，計算出當前顯微鏡倍數下所採集圖像每一個像素點的實際長度值，完成長度標定。

採集背景圖像、測量背景圖像像素點灰度值的具體步驟為：將病人標本切片放在顯微鏡載物臺上，首先選擇能觀察到細胞的視野，調整顯微鏡焦距，使細胞處於最清晰的位置，然後移動顯微鏡載物臺X軸與Y軸，將顯微鏡視野調整到切片中沒有細胞的空白位置處，通過調整顯微鏡光亮，分析軟體可以獲取當前視野圖像的像素點灰度值，並將圖像灰度值生成灰度直方圖，灰度直方圖的峰值位於220～230之間，然後採集當前視野圖像並保存為背景圖像。

採集正常二倍體細胞圖像，對二倍體細胞圖像進行圖像分割，測量二倍體細胞核的灰度值，計算二倍體細胞核的平均光密度值的具體步驟是：在顯微鏡下選擇具有正常二倍體細胞的視野，然後通過攝像頭將病人正常二倍體細胞的圖像採集進計算機，選擇圖像分割，將細胞核從背景中分割出來，然後用滑鼠在分割出的圖像中，選擇出正常二倍體細胞，並計算出所有正常二倍體細胞圖像每個像素點的光密度值od_2c(i,j)，計算公式為：

其中，grey_2c(i,j)為像素點的灰度值，grey_back(i,j)為背景圖像同一位置的灰度值。

計算出每個正常二倍體細胞核像素點的光密度值後，計算其平均光密度值mean_od_2c,計算公式如下：

其中N為分割出正常二倍體細胞核所有像素點總數，R為分割出的細胞核區域。

所述腫瘤細胞測量中，具體步驟是：採集腫瘤細胞圖像，對腫瘤細胞進行圖像分割，測量每個腫瘤細胞核像素點的光密度值，計算每個腫瘤細胞核的DI值和面積的具體步驟是：移動顯微鏡的X軸與Y軸，選擇至少5個具有病變細胞的視野，分別採集每個視野的圖像並保存，然後對每個視野的細胞進行分析測量：首先採用圖像分割技術，根據細胞核與背景顏色灰度值差異，將細胞核從背景中分割出來，然後採用與正常二倍體細胞同樣的計算像素點光密度值方式，計算分割出細胞核每個像素點的光密度值od_cell，然後計算出每個細胞核的平均光密度值mean_od_cell，最後計算每個細胞的DNA指數DI，採用DI值的計算公式計算出所有採集圖像每個細胞的DI值。DI值的計算公式如下：

生成直方圖的方法是：設定橫坐標為DI值，縱坐標為細胞的數目，其中橫軸的取值範圍為0～5，每個區間為0.1，統計每個DI值區間的細胞數，將其作為縱軸值，生成一個DNA直方圖。

生成DNA散點圖的具體方法是：設定橫坐標為DI值，縱坐標為細胞核面積值(單位為平方微米)；當在計算每個細胞的DI值時，同時根據長度標定情況，測出每個細胞核的具體面積，散點圖橫軸的取值範圍為0～5，每個區間為0.1，對於每個細胞，都根據其DI值和面積，在散點圖中標定一個圓點，當所有細胞標定完後，可以清晰看到細胞DI值與其面積的分布情況。

生成DNA檢測報告的具體方法是：完成上述檢測後，分析系統將檢測結果自動導入檢測報告中，包含DNA直方圖、散點圖、檢測結果(含：細胞總數、正常二倍體細胞、正常增生或疑似病變細胞、病變細胞、細胞總數等)，同時導入病人基本信息，並根據測量結果和DNA直方圖峰值分布，生成診斷建議。

本發明的積極效果是：

1、採用圖像分析方法對腫瘤細胞進行判斷，相比電化學等其他方法，具有成本低、測量快等優點。

2、採用定量測量方式對腫瘤細胞進行判斷，可以減少人為判斷出現的誤差。

3、可以保存病人的病變細胞圖片，使後續診斷具有更好的參考依據。

4、可以直接將檢測結果生成檢測報告，提出診斷建議，使醫生診斷更方便快捷。

附圖說明

圖1是本發明硬體使用連接示意圖。

圖2是本發明的方法流程圖。

圖3是實施例中生成的DNA直方圖。

圖4是實施例中生成的DNA散點圖。

具體實施方式

參見圖1。

本發明硬體設備主要由顯微鏡、攝像頭、臺式計算機和印表機構成。顯微鏡採用透射式生物顯微鏡，攝像頭採用高清數字攝像頭、計算機採用臺式計算機、印表機採用彩色雷射印表機。攝像頭安裝在顯微鏡上部，通過顯微鏡攝像接口與顯微鏡相連，可以對顯微鏡下觀察到的視野進行圖像採集；攝像頭通過數據連接線連接到計算機的USB埠，將攝像頭觀察到的病理切片圖像傳輸到計算機；印表機通過USB埠和計算機相連，將分析軟體生成的DNA檢測報告在印表機上列印出來。

參見附圖2-4。

腫瘤細胞DNA含量檢測方法包括長度標定、背景校準、正常二倍體細胞測量、腫瘤細胞測量、DNA報告生成五個步驟：首先將一個核准的透光載玻片刻度尺放到顯微鏡載物臺上，通過攝像頭，將透光載玻片刻度尺圖像拍攝到計算機，按住滑鼠左鍵在刻度尺圖像上拖動，分析軟體根據拖動刻度的實際值與拖動的像素點數，計算出當前顯微鏡倍數下所採集圖像每一個像素點的實際值，完成長度標定；然後將病人標本切片放在顯微鏡載物臺上，通過調整顯微鏡視野，使當前視野調整到切片中無細胞的空白位置處，通過調整顯微鏡光亮，使顯微鏡視野的圖像灰度直方圖的峰值位於220～230之間，採集當前視野圖像並保存，完成背景校準操作；隨後，在顯微鏡下選擇具有典型正常二倍體細胞的視野，將病人正常二倍體細胞的圖像採集進計算機，通過圖像分割，將細胞核從背景中分割出來，計算出正常二倍體細胞細胞核的平均光密度值；緊接著移動顯微鏡的X軸與Y軸，選擇多個具有病變細胞的視野，分別採集每個視野的圖像並保存，對每個視野的細胞核進行圖像分割，根據細胞核與背景顏色灰度值差異，將細胞核從背景中分割出來，計算分割出細胞核中每個細胞核的平均光密度值和DNA指數DI，生成DNA直方圖和散點圖；最後，根據檢測的結果，生成DNA檢測報告，形成診斷建議。

具體流程是：長度標定、背景校準、正常二倍體細胞測量、腫瘤細胞測量、DNA報告生成五個步驟：首先採集刻度尺圖像、進行長度標定；採集背景圖像、測量背景圖像像素點灰度值；採集正常二倍體細胞圖像，對二倍體細胞圖像進行圖像分割，測量二倍體細胞核的灰度值，計算二倍體細胞核的平均光密度值；採集腫瘤細胞圖像，對腫瘤細胞進行圖像分割，測量每個腫瘤細胞核像素點的光密度值，計算每個腫瘤細胞核的DI值和面積；生成DNA直方圖並生成散點圖，按DI分類統計各類細胞的數量，生成DNA檢測報告。

採用本方法的實施例：

1、長度標定

一般刻度尺通常有100個刻度，每個刻度的長度是10微米，總刻度長度為1000微米。在用圖像分析方法對待測目標進行長度、面積等測量時，需要提前進行長度標定，長度標定是將一個核准的透光載玻片刻度尺放到顯微鏡載物臺上，調整顯微鏡X軸與Y軸，使刻度尺刻度位於視野中心，同時旋轉攝像頭，保證拍攝下來的刻度尺圖像中刻度尺與圖像上沿平行，通過攝像頭將刻度尺圖像拍攝到計算機，按住滑鼠左鍵在刻度尺圖像上拖動，輸入拖動的刻度長度，分析軟體就自動記錄當前顯微鏡倍數下所採集圖像每一個像素點的實際值，輸入刻度尺名並保存。在進行長度標定時，需要對顯微鏡的每种放大倍數都需要採集圖像，分別進行標定，在進行長度測量前，也需要提前選定所需刻度尺名。

2、背景校準

背景圖像校準是為了矯正由於非均勻照明，(通常的顯微鏡視野中心最亮)、攝像頭反應固定模式的變化及攝像頭或光路中灰塵而引起的偏差等。

對每個病人標本切片進行分析檢測前，都需要進行背景校準。具體步驟為：將病人標本切片放在顯微鏡載物臺上，首先選擇能觀察到細胞的視野，調整顯微鏡焦距，使細胞處於最清晰的位置，然後移動顯微鏡載物臺X軸與Y軸，將顯微鏡視野調整到切片中沒有細胞的空白位置處，通過調整顯微鏡光亮，分析軟體可以獲取當前視野圖像的像素點灰度值，並將圖像灰度值生成灰度直方圖，灰度直方圖的峰值位於220～230之間，然後採集當前視野圖像並保存為背景圖像。當灰度值直方圖峰值大於230時，降低顯微鏡亮度，當灰度值直方圖峰值小於220時，增加顯微鏡亮度。

3、正常二倍體細胞測量

在顯微鏡下選擇具有正常二倍體細胞的視野，然後通過攝像頭將病人正常二倍體細胞的圖像採集進計算機，選擇圖像分割，將細胞核從背景中分割出來，然後用滑鼠在分割出的圖像中，選擇出正常二倍體細胞，並計算出所有正常二倍體細胞核每個像素點的光密度值od_2c(i,j)，計算公式為：

其中，grey_2c(i,j)為像素點的灰度值，grey_back(i,j)為背景圖像同一位置的灰度值。

計算出每個正常二倍體細胞核像素點的光密度值後，計算其平均光密度值mean_od_2c,計算公式如下：

其中N為分割出正常二倍體細胞核所有像素點總數，R為分割出的細胞核區域。

4、腫瘤細胞測量

移動顯微鏡的X軸與Y軸，選擇至少五個多個具有病變細胞的視野，分別採集每個視野的圖像並保存，然後對每個視野的細胞進行分析測量。具體步驟為：首先採用圖像分割技術，根據細胞核與背景顏色灰度值差異，將細胞核從背景中分割出來，然後採用與正常二倍體細胞同樣的計算像素點光密度方式，計算分割出細胞核每個像素點的光密度值od_cell，然後計算出每個細胞核的平均光密度值mean_od_cell，最後計算每個細胞的DNA指數(DI)，DI值的計算公式為：

計算出所有採集圖像每個細胞的DI值後，生成DNA直方圖，DNA直方圖其橫坐標為DI值，縱坐標為細胞的數目。其中橫軸的取值範圍為0～5，每個區間為0.1，統計每個DI值區間的細胞數，將其作為縱軸值，生成一個DNA直方圖。本實施例的DNA直方圖見附圖3所示。

散點圖，主要用來顯示DI值差異的細胞分布情況，其橫坐標為DI值，縱坐標為細胞核面積值，其單位為平方微米。當在計算每個細胞的DI值時，同時根據長度標定情況，測出每個細胞核的具體面積，散點圖橫軸的取值範圍為0～5，每個區間為0.1，對於每個細胞，都根據其DI值和面積，在散點圖中標定一個圓點，當所有細胞標定完後，可以清晰看到細胞DI值與其面積的分布情況。本實施例的DNA散點圖見附圖4所示。

5、DNA報告生成

DNA檢測報告是醫生對病人進行病理診斷的有效參考依據，完成上述檢測後，分析系統將檢測結果自動導入檢測報告中，包含DNA直方圖、散點圖、檢測結果(含：細胞總數、正常二倍體細胞、正常增生或疑似病變細胞、病變細胞、細胞總數等)，同時導入病人基本信息，並根據測量結果和DNA直方圖峰值分布，生成診斷建議，診斷建議的判定標準如下：

1)正常：正常二倍體細胞為主(DI值為1)，未見異倍體細胞及異倍體細胞峰。

2)DI處於1～2之間時，多為HPV感染細胞或炎性細胞。

3)異常，建議活檢：DI值＞2.5時，或二倍體與四倍體之間的細胞數超過被測細胞總數的10％時。

4)腫瘤細胞：DI值≥4.5。