一種腈水合酶調控蛋白的分離純化方法

2023-11-06 09:10:52 1

專利名稱：一種腈水合酶調控蛋白的分離純化方法
技術領域：
一種腈水合酶調控蛋白的分離純化方法，本發明涉及一種以親和層析為主要手段的腈水合酶調控蛋白的分離純化方法。
背景技術：
腈水合酶(Nitrilehydratase，簡稱 NHase，EC 4. 2. 1. 84)，是一種催化腈基化合物轉變為醯胺基化合物的金屬酶。用這種酶所生產的丙烯醯胺已近百萬噸，佔整個丙烯醯胺產量的三分之一。生物技術相對於傳統的化學法有著成本低、能耗少、少汙染的優勢。目前，在美國、日本、法國等發達國家，這項生物技術正在取代傳統的化學法。在我國，腈水合酶合成丙烯醯胺的生物技術雖然起步較晚，但發展很快，2008年數據統計，我國生物法生產的丙烯醯胺佔整個丙烯醯胺產量的41%。丙烯醯胺是一種應用廣泛的基礎化工原料，在石油開採、造紙、裝潢等方面發揮著重要的作用。隨著市場的不斷拓展，對丙烯醯胺的需求也在不斷增長。另外這種酶也被應用在尼克醯胺的生產上。尼克醯胺是一種B組維生素，以輔酶I及輔酶II的形式參與機體代謝，在人體和動物代謝方面起著十分重要的作用，廣泛應用在醫藥、食品添加劑及飼料生產上。
腈水合酶的廣泛應用促使科學工作者開始研究這種金屬酶的合成機制和催化機理。腈水合酶按所含金屬離子的不同分為含鐵和含鈷兩種，按基因結構的不同又可以分為四類。雖然它們催化的是同一類化學反應，這幾類酶的合成模式卻不同，這些不同突出表現在金屬離子攝取方式的不同。其中第一類和第二類腈水合酶中鈷離子的攝取機理已經判明，而第三類還沒有報導，第四類腈水合酶(含鐵型)的相關結論也不明確。阻礙探明第三類鈷離子攝取機理的關鍵原因就是該類腈水合酶(以惡臭假單胞菌腈水合酶為代表)調控蛋白目前尚無成功克隆表達的方法更無法純化精製。其原因在於目前惡臭假單胞菌中腈水合酶調控基因序列的ORF部分報導有誤，而且即使正確識別該調控蛋白的0RF，該調控蛋白在SDS-PAGE上也很難檢測到。

發明內容
本發明的目的是提供一種腈水合酶調控蛋白的分離純化方法，是在SEQ ID NO. 1 前端加SD序列和His-tag，與腈水合酶成熟酶基因串聯，在大腸桿菌BL21中表達腈水合酶調控蛋白，採用鎳柱分離純化腈水合酶調控蛋白。
本發明的具體步驟如下
1)將發酵液離心收集菌體用磷酸緩衝液(含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)重懸，超聲破碎G00W，工作5秒，間隔5秒)；
2)將破碎後的粗酶液經過硫酸銨分級沉澱，收集的蛋白沉澱溶解後進行透析；
3)將透析後的酶液加入到用磷酸緩衝液A (含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)平衡好的鎳柱Hitrap crude Iml中，用磷酸緩衝液B (含500mmol/L咪唑，pH 7. 5)流速lml/min，梯度洗脫收集咪唑濃度約為250 350mmol/L對應出峰的蛋白部分；
4) HPLC檢測腈水合酶酶活；
5)腈水合酶調控蛋白N端測序。
本發明所述發酵液是指出發菌株為基因工程菌大腸桿菌BL21(含pET_Ma(+)和來源於惡臭假單胞菌I3Seudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因全序列，其中調控蛋白N端加His-tag)。TB發酵培養基，發酵條件37°C培養2 4h使大腸桿菌BL210D值為 0. 6左右，再添加終濃度0. 4mmol/L IPTG 低溫誘導表達16h。
所述惡臭假單胞菌I^seudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因全序列中開放閱讀框序列如SEQ ID NO. 1所示。
本發明的詳細的步驟為
(1)將基因工程菌大腸桿菌BL21 (含pET_Ma(+)來源於惡臭假單胞菌 Pseudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因全序列，其中調控蛋白N端加His-tag) 發酵，誘導表達條件為37°C培養2 4h使大腸桿菌BL210D值為0. 6左右，再添加終濃度 0. 4mmol/L IPTG 24°C低溫誘導表達 16h ；
(2)將發酵液離心收集的菌體用磷酸緩衝液(含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)重懸，超聲破碎約30min (400W,工作5秒，間隔5秒)；
(3)硫酸銨沉澱
將破碎液加入硫酸銨粉末，至飽和度為35%，緩慢攪拌使其完全溶解。調節pH值， 使酶液的PH保持在7. 5，靜置半小時後IOOOOXg低溫離心lOmin，低溫離心收集蛋白沉澱。 將沉澱溶解在磷酸緩衝液(含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)中並且4°C透析數小時；
⑷鎳柱分離
將透析後的酶液加入到用磷酸緩衝液A (含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)平衡好的鎳柱Hitrap crude Iml中，用磷酸緩衝液B (含500mmol/L咪唑，pH 7. 5)流速lml/min，設五個梯度水平洗脫5ml, 8. 3% 5ml, 22% 5ml, 58. 3% 5ml, 100% 5ml)，收集咪唑濃度約為250 350mmol/L對應出峰的蛋白部分；
(5) HPLC檢測改造後腈水合酶酶活
腈水合酶HPLC檢測條件流動相磷酸乙腈緩衝液；檢測波長210nm ；色譜柱為C18 柱；
(6)腈水合酶調控蛋白N端測序
將表達出來的蛋白過鎳柱純化後N端測序，測序結果(見附件圖3)為His-tag對應序列，而這個His-tag是我們人為添加的，這就說明該蛋白就是腈水合酶調控蛋白，為進一步解析腈水合酶金屬離子攝取機理和改進腈水合酶的工業化生產工藝打下良好的基礎。
本發明的有益效果本發明提供了一種腈水合酶調控蛋白的分離純化方法，該方法工藝簡單，能得到純度較高的腈水合酶調控蛋白。


圖1.親和層析色譜圖
圖2.腈水合酶表達的SDS-PAGE電泳圖(1、蛋白分子量標準；2、分離純化的腈水合酶調控蛋白)。
圖3.腈水合酶調控蛋白純化後N端測序圖
具體實施例方式
材料和檢測方法
基因工程菌大腸桿菌BL21 (含pET_Ma(+)和來源於惡臭假單胞菌I^seudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因全序列)。
腈水合酶HPLC檢測條件流動相磷酸乙腈緩衝液；檢測波長210nm ；色譜柱為C18柱。
實施例1
基因工程菌大腸桿菌BL21 (含pET_Ma(+)和來源於惡臭假單胞菌I^seudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因全序列)，構建方法如下
1)從NCBI上下載GenBank號為U89363. 1的序列並且識別SEQ ID NO. 1 ；
2)在調控蛋白基因序列前加SD序列(AAGGAG)和His-tag序列；
3)將上一步驟中構建的序列串聯在腈水合酶成熟酶下遊克隆到pET_Ma(+)，導入大腸桿菌BL21誘導表達；
4) HPLC檢測改造後腈水合酶酶活。
實施例2
將大腸桿菌BL21(含pET-Ma(+)和來源於惡臭假單胞菌I^seudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因全序列)按接種量接種到TB培養基中，37°C培養2 4h使大腸桿菌BL210D值為0. 6左右，再添加終濃度0. 4mmol/L IPTG 低溫誘導表達16h。
實施例3
(1)將發酵液離心收集菌體用磷酸緩衝液(含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)重懸，超聲破碎約30min (400W,工作5秒，間隔5秒)；
(2)硫酸銨沉澱
將破碎液加入硫酸銨粉末，至飽和度為35%，緩慢攪拌使其完全溶解。調節pH值， 使酶液的PH保持在7. 5，靜置半小時後IOOOOXg低溫離心lOmin，低溫離心收集蛋白沉澱。 將沉澱溶解在磷酸緩衝液(含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)中並且4°C透析數小時；
(3)鎳柱分離
將透析後的酶液加入到用磷酸緩衝液A (含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)平衡好的鎳柱Hitrap crude Iml中，用磷酸緩衝液B (含500mmol/L咪唑，pH 7. 5)流速lml/min，設五個梯度水平洗脫5ml,8. 3% 5ml, 22% 5ml, 58. 3% 5ml, 100% 5ml)，收集咪唑濃度約為250 350mmol/L對應出峰的蛋白部分；
(4) HPLC檢測改造後腈水合酶酶活
腈水合酶HPLC檢測條件流動相磷酸乙腈緩衝液；檢測波長210nm ；色譜柱為C18 柱；
(5)腈水合酶調控蛋白N端測序
將表達出來的蛋白過鎳柱純化後N端測序，測序結果(見附件圖3)為His-tag對應序列，而這個His-tag是我們人為添加的，這就說明該蛋白就是腈水合酶調控蛋白，為進一步解析腈水合酶金屬離子攝取機理和改進腈水合酶的工業化生產工藝打下良好的基礎。
權利要求
1.一種腈水合酶調控蛋白的分離純化方法，是在SEQ ID NO. 1所示序列前端加SD序列和His-tag，與腈水合酶成熟酶基因串聯，在大腸桿菌BL21中表達腈水合酶調控蛋白，採用鎳柱分離純化腈水合酶調控蛋白。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述大腸桿菌BL21構建方法如下1)從NCBI上下載GenBank號為U89363.1的序列並且識別SEQ ID NO. 1 ；2)在調控蛋白基因序列前加SD序列和His-tag序列；3)將上一步驟中構建的序列串聯在腈水合酶成熟酶下遊克隆到pET-Ma(+)，導入大腸桿菌BL21誘導表達。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述大腸桿菌BL21的發酵培養基為 1.2%胰蛋白腖，2. 4%酵母提取物，0.4%甘油，17mM KH2P04,72mM K2HP04。
4.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述大腸桿菌BL21誘導表達條件為 37°C培養2 4h，再添加終濃度0. 4mmol/L IPTG，低溫誘導表達16h。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述鎳柱為Hitrapcrude lmL。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟如下1)將發酵液離心收集菌體用磷酸緩衝液重懸，超聲破碎；2)將破碎後的粗酶液經過硫酸銨分級沉澱，收集的蛋白沉澱溶解後進行透析；3)將透析後的酶液加入到用含咪唑的磷酸緩衝液平衡好的鎳柱Hitrapcrude Iml 中，用含咪唑的磷酸緩衝液梯度洗脫收集咪唑濃度約為250 350mmol/L對應出峰的蛋白部分。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述用於洗脫的含咪唑的磷酸緩衝液，流速 lml/min，設五個梯度水平洗脫 4. 2% 5ml, 8. 3% 5ml, 22% 5ml, 58. 3% 5ml, 100% 5ml。
全文摘要
本發明公開了一種腈水合酶調控蛋白的分離純化方法，是採用鎳柱分離純化腈水合酶調控蛋白，屬於生物製品分離純化技術領域。本發明方法工藝簡單，能得到純度較高的腈水合酶調控蛋白。
文檔編號C07K1/30GK102492016SQ201110382079
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者劉義, 周哲敏, 崔文璟 申請人:江南大學