基於單分子力譜的抗癌藥物鑑定方法
2023-12-01 06:35:31 5
專利名稱：基於單分子力譜的抗癌藥物鑑定方法
技術領域：
本發明涉及基於單分子力譜的抗癌藥物鑑定方法。
背景技術：
癌症一直是人類健康的最大殺手。細胞的過度增殖是癌症發生和發展的原因，而 且細胞的過度增殖一般都與配體誘導細胞信號通路尤其是生長因子信號通路的過度激活 有關。因此抑制這種細胞信號通路的過度激活，成為治療癌症的重要途徑。生長因子細胞 信號通路的激活首先是通過配體與其膜蛋白受體在細胞膜上結合，使受體產生自聚或異聚 而被激活。然後通過激活的受體再磷酸化下遊通路的蛋白，使其下遊蛋白被激活，從而激活 整個信號通路。因此，鑑定出能截斷激活信號通路的任一環節的化合物就能發展治療癌症 的藥物。目前抗癌藥物分子的主要鑑定方法之一是首先通過計算機模擬從化合物庫中找 出一些能與信號通路相關蛋白結合的候選物，然後對這些候選物分子進行細胞水平的實 驗，檢測其是否能夠抑制其配體誘導的下遊蛋白的磷酸化水平，通過重複這些生化實驗來 達到抗癌藥物鑑定的目的，再進一步進行動物實驗。但是在鑑定過程中普遍存在周期長，操 作複雜，花費高的問題，難以實現簡便快捷的藥物鑑定。因此，有必要發展一種簡單快捷的 藥物鑑定方法。單分子力譜方法是近年來迅速發展起來的一種檢測技術。該方法不僅有極高的靈 敏度，而且還能展現出大量分子檢測時所掩蓋下單個分子力的變化，已日益廣泛地應用於 細胞水平對生物分子結構和功能的動態變化、分子間相互作用和生化反應的動力學過程的 研究。但目前還未見有利用該方法鑑定抗癌藥物的相關報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種基於單分子力譜檢測膜蛋白受體-配體相互作用的抗 癌藥物鑑定方法。本發明提供的抗癌藥物的鑑定方法，包括如下步驟1)將靶標膜蛋白受體的配體修飾在原子力顯微鏡的針尖上，得到修飾後的針尖；2)將離體的癌症細胞進行孵育，孵育完畢後將步驟1)所得修飾後的針尖和孵育 後的所述離體的癌症細胞均置於原子力顯微鏡的樣品池中，測定所述離體的癌症細胞中所 述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合力，得到所述離體的癌症細胞 中所述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合機率A ；所述離體的癌症 細胞為含有所述靶標膜蛋白受體的癌症細胞；3)將所述離體的癌症細胞和待鑑定物質進行孵育，孵育完畢後將其與所述步驟 1)所得修飾後的針尖均置於原子力顯微鏡的樣品池中，測定孵育後的所述離體的癌症細胞 中所述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合力，得到所述孵育後的所 述離體的癌症細胞中所述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合機率B ；所述離體的癌症細胞為含有所述靶標膜蛋白受體的癌症細胞；4)如果所述結合機率B小於所述結合機率A，則所述待鑑定物質為候選的抗癌藥 物。上述方法的步驟1)中，常用的各種氮化矽原子力顯微鏡針尖均適用於該方法。所 述靶標膜蛋白受體的配體優選為TGFii 1，所述離體的癌症細胞優選為Hela細胞。所述修 飾步驟是將原子力顯微鏡針尖與配體通過化學交聯的方式進行修飾，具體包括如下步驟 a)將所述原子力顯微鏡的針尖置於MPTMS的甲苯溶液中反應，反應完畢後得到矽烷化的針 尖；b)將所述步驟a)所得矽烷化的針尖置於ω-氮羥基琥珀醯亞胺酯多聚乙二醇α-馬 來酉先亞胺((ω -N-hydroxy-succinimide-ester-poly (ethylene glycol) - α -maleimide， 簡稱NHS-PEG-MAL)的二甲基亞碸溶液中進行反應，反應完畢得到活化後的針尖；c)將所述 步驟b)得到的活化後的針尖與所述細胞配體於溶劑中進行反應，得到修飾後的針尖。上述修飾步驟的步驟a)反應步驟中，溫度為18_25°C，優選20°C，時間為1. 5-2小 時，優選2小時；所述MPTMS的甲苯溶液的體積百分濃度為；在所述步驟a)之後，所述 步驟b)之前，還對所述矽烷化的針尖進行如下處理將所述矽烷化的針尖依次用甲苯、丙 酮和乙醇洗滌，氮氣吹乾；所述步驟b)反應步驟中，溫度為18_25°C，優選20°C，時間為2. 5-3小時，優選3 小時；所述NHS-PEG-MAL的二甲基亞碸溶液的濃度為lmg/ml ；在所述步驟b)之後，所述步 驟c)之前，還對所述活化後的針尖進行如下處理將所述活化後的針尖用二甲基亞碸進行 洗滌，再氮氣吹乾；所述步驟c)中，溫度為18-25°C，優選20°C，時間為0.5-1小時，優選0.5小時； 所述溶劑選自PBS緩衝液和Tris-HCl緩衝液中的至少一種，其中，PBS緩衝液的pH值為 7. 2-7. 6，優選7. 4，摩爾濃度為0. 01M, Tris-HCl緩衝液的pH值為7. 2-7. 6，優選7. 4，濃度 為0. 05M。在所述步驟c)之後所述步驟2)之前，還對所述修飾後的針尖進行如下處理用 緩衝液洗滌所述修飾後的針尖；所述緩衝液選自PBS緩衝液和Tris-HCl緩衝液中的至少 一種，優選PBS緩衝液；其中，PBS緩衝液的pH值為7. 2-7. 6，優選7. 4，摩爾濃度為0. 01M, Tris-HCl緩衝液的pH值為7. 2-7. 6，優選7. 4，濃度為0. 05M。所述步驟2)和步驟3)孵育所述離體的癌症細胞步驟中，溫度均為37°C，時間均 為18-30小時，優選均為24小時；所述孵育步驟是在培養基中進行的。各種能夠孵育該癌 症細胞的培養基均適用，如可為胎牛血清體積百分比為10%的DMEM培養基。所述步驟3)孵育待鑑定物質步驟中，溫度為37°C，時間為0.5-2小時，優選為1小 時。上述步驟2)和3)中，結合力是按照如下方法得到使原子力顯微鏡的針尖壓到細 胞表面，然後再提拉使針尖離開細胞。由結合力得到結合機率的具體方法為計算有結合力 的力曲線的個數佔所有力曲線個數的比例，得到結合機率。所述步驟2)和3)測定步驟中，加載速率為1. 0X105pN/s，針尖與基底接觸的時間 為500ms。在測定步驟中，所用原子力顯微鏡的針尖，在使用之前，可清洗乾淨並用氮氣吹乾。所述步驟4)中，所述候選的抗癌藥物為能夠抑制所述離體的癌症細胞與所述配 體結合的抗癌藥物；所述結合機率A與所述結合機率B之差不小於5 %，如可為8. 6 %。
為了獲得更準確的試驗結果，上述方法步驟2)和步驟3)可重複若干次，如可重複 3-5 次。所述待鑑定物質為式I所示柚皮素或式II所示白藜蘆醇。
(式 II)本發明利用單分子力譜的方法提供了一種基於膜蛋白受體-配體相互作用力的 細胞水平鑑定抗癌藥物的方法。該方法通過檢測藥物分子是否可以抑制膜蛋白受體與配體 的結合，從而得到有望抑制腫瘤細胞生長的藥物候選物。其基本原理(如圖1所示)是首 先是將配體通過化學交聯的方法修飾到AFM針尖上，然後在待測化合物存在下，通過單分 子力譜觀察細胞膜上受體與配體結合機率的變化。例如如果是在加入待測化合物後受體與 配體的結合機率變小，說明該藥物具有抑制配受體結合的作用。因此在待測化合物存在下， 通過檢測膜蛋白受體與配體的結合機率是否減小，從而實現抑制膜蛋白受體與配體的結合 的抗癌藥物的鑑定。該方法屬於藥物鑑定新方法，與其它藥物鑑定方法相比，具有操作簡 便，周期短，節省開支等優勢，可以快速鑑定得到抑制配受體結合的抗癌藥物。
圖1為用原子力顯微鏡檢測配受體結合示意圖。圖2為對照和柚皮素與白藜蘆醇濃度都為50 μ M時，配受體結合機率的變化。圖3為分別在陽性對照，柚皮素和白藜蘆醇，觀察小鼠肺臟上的腫瘤結節數。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，所述方法均為常規方法。下述實施例中所用3-巰 丙基三乙氧基矽烷(MPTMS)和所用NHS-PEG-MAL均購自sigma公司；所用柚皮素購自陝西 惠科植物開發有限公司；孵育步驟所用培養皿均為購自北京科友佳生物技術有限公司的 35mm的玻璃底培養皿。本發明中所述結合機率、加載速率均定義如下結合機率是有結合力的力曲線佔 所有測得的力曲線的個數的百分比；加載速率是指單分子力譜測定中針尖在退針時的提升 速率，其大小為AFM針尖微懸臂的力彈性常數與斷鍵過程中針尖回退的速率的乘積，單位 為 pN/s。
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下述實施例中所用原子力顯微鏡均購自安捷倫公司，所用針尖均為氮化矽 針尖。該原子力顯微鏡均包括如下的配件雷射器(Laser)、AFM針尖(Tip)、微懸 臂(Cantilever)、樣品池(Sample Substrate)、光柵掃描和Z軸定位的壓電掃描器 (Piezo-scanner)、壓電掃描控制器(XYZ Scanner Controller)、顯示器(Displayer)、接受 光反饋信號的控制器(Feedback Controller)和檢測器(Detector)。利用原子力顯微鏡測定結合力的原理如下當針尖與被檢測樣品之間有微弱的相 互作用力時，引起微懸臂彎曲，使從微懸臂反射到檢測器上的雷射發生偏移，由於光槓桿作 用原理，即使小於0. Olnm的微懸臂形變也可在光電檢測器上產生IOnm左右的雷射點偏移， 由此產生的電壓變化對應著微懸臂的形變量，通過一定的函數變化便可得到微懸臂形變量 的測量值。反饋系統根據產生的電壓信號變化來調整針尖或者樣品的Z向位置，控制針尖 與樣品位置的相對移動，即可進行形貌和力的測量。實施例1、1)取清洗乾淨的AFM針尖轉移到含有體積百分濃度為1. 0%的MPTMS的甲苯溶液 中，於20°C反應2小時後，用甲苯反覆清洗除去未反應的矽烷化試劑，再依次用丙酮和乙醇 清洗3次，氮氣吹乾，得到矽烷化後的針尖。將矽烷化後的針尖浸入lmg/mlNHS-PEG-MAL的 DMSO溶液中，於20 V反應3小時後，用DMSO清洗3次以除去未反應的NHS-PEG-MAL，氮氣 吹乾後得到活化後的針尖。將活化的針尖於PH值為7. 4、濃度為0. OlM的PBS緩衝液中與 TGF β 1配體(該配體在PBS緩衝液中的濃度為5 μ Μ)室溫反應0. 5h後，用ρΗ值為7. 4、濃 度為0. OlM的PBS緩衝液清洗3次後，得到修飾後的AFM針尖備用。2)將HeLa細胞傳到35mm培養皿37°C中孵育24小時(細胞覆蓋度為80% )後， 將步驟1)所得修飾後的AFM針尖和孵育後的HeLa細胞均置於原子力顯微鏡的樣品池中， 測定HeLa細胞中T β RII受體與TGF β 1配體之間的結合力，同一針尖和癌症細胞重複平行 實驗3次，得到HeLa細胞中T β RII受體與TGF β 1配體之間的結合機率A1 ；該測定步驟中， 加載速率為1. 0X105pN/s，針尖與基底接觸的時間為500ms ；3)將步驟2)所用HeLa細胞傳到35mm培養皿37°C中孵育24小時(細胞覆蓋度 為80%)後，再加入柚皮素37°C孵育lh(細胞覆蓋度為80%)；孵育完畢後將步驟1)所 得修飾後的AFM針尖和孵育後的HeLa細胞均置於原子力顯微鏡的樣品池中，測定HeLa細 胞中T β RII受體與TGFi3 1配體之間的結合力，同一針尖和癌症細胞重複平行實驗3次，得 到HeLa細胞中T β RII受體與TGF β 1配體之間的結合機率B1 ；該測定步驟中，加載速率為 1. 0X105pN/s，針尖與基底接觸的時間為500ms ；同時設置以下阻斷對照將hela細胞傳到35mm培養皿37°C中孵育24小時使其細 胞覆蓋度為80%後，將阻斷劑T β RII胞外段濃度為5ug/ml的PBS緩衝液(ρΗ值為7. 4、濃 度為0. 01M)加入該hela細胞中，使該阻斷劑T β RII胞外段的終濃度為5ug/ml，再將修飾 後的針尖浸入液面以下30min後，開始測定結合力，該測定步驟的測定條件與前述步驟2) 和3)完全相同，得到該結合機率為3. 5士0.8%。其中，所用阻斷劑T β RII胞外段的製備方法如下將pET-2Ib-T β RII胞外段 (ECD)(Crescenzo G. D. ,Pham P. L. ；Durocher Y. ,0' Connor-McCourt M. D.Transforming growthfactor-beta(TGF-beta)binding to the extracellular domain of the type TGF II-betareceptor :receptor capture on a biosensor surface using a new coiled—coilcapture systemdemonstrates that avidity contributes significantly to high affinity binding. J. Mol. Biol.，2003，328，1173-1183)的轉化至菌株 E. coli DH-5 α。N 末端組氨酸標記的T β RII E⑶蛋白用ImM IPTG的誘導，用Ni-NTA瓊脂膠在蛋白變性條 件下純化(agarose, Qiagen, USA)。再用參考文獻 Wang Q.，Bai Ζ. , Li Χ.，Hou L.，Zhang B. The evidences of human orphan receptor COUP-TF inhibiting telomerase activity throughdecreasing hTERT II transcription. Cancer Lett.，2004，214，81—90 中提供的方 法使蛋白重新摺疊。樣品首先用含IOOmM NaCl和0. 5-2. OM尿素的Tris-HCl (20mM，pH8. 0) 溶液稀釋，然後依次在緩衝溶液 1(0. 5M urea, 20mM Tris-HCl, ImM EDTA，IOOmM NaCl,25% NP-40,0. 2mM PMSF)和緩衝溶液 II (20mM Tris-HCl, ImM EDTA, 50mM NaCl,0. 25% NP-40, 0. 2mM PMSF)中透析 24h。該pET-21b_Ti3RII胞外段可從中國科學院化學研究所獲得。上述檢測結果均列於圖2中。由圖可知，TGFi3 1配體與T β RII受體的結合機率A1 為25. 1 士2.8%。在加入50 μ M柚皮素孵育Ih後，TGF β 1配體與T β RII受體的結合機率 明顯減小，結合機率B1降低到16. 5 士 1. 6 %，該結合機率A1與結合機率B1的差值為8.6%， 大於5%，說明柚皮素可以抑制TGFi3 1配體與T β RII受體的結合。按照與上完全相同的步驟，僅將步驟3)中待鑑定藥物替換為白藜蘆醇，所得結合 機率A2與B2沒有顯著變化，結合機率A2為25. 1 士 2. 8 %，結合機率B2為24. 6 % 士 2. 7 %， 該差值為0. 5%，小於5%，說明白藜蘆醇不能抑制TGFi3 1配體與T β RII受體的結合。生化實驗驗證為了驗證單分子力譜鑑定方法的有效性，按照如下步驟進行動物實驗如圖3所示，將4Τ1細胞接種於Balb/c小鼠第四脂肪墊下，15萬/只。接種3天 分組，每組十隻，陽性對照組灌胃溶液(0. 2% CMC-Na水溶液)，給藥組分別灌胃給藥柚皮 素、白藜蘆醇各100mg/kg，共給藥21天，處死動物，觀察肺臟上轉移的腫瘤結節數。將陽性對照組溶液直接讓小鼠喝下去。所得結果如圖3所示。由圖可知，經過柚皮素處理後肺臟上腫瘤的結節數明顯地 減少而白藜蘆醇卻不能。這與本發明提供的鑑定方法所得實驗結果幾乎相同。因此本發明 提供的利用單分子力譜檢測膜蛋白受體_配體相互作用的方法可用來鑑定抗癌藥物。
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權利要求
一種抗癌藥物的鑑定方法，包括如下步驟1)將靶標膜蛋白受體的配體修飾在原子力顯微鏡的針尖上，得到修飾後的針尖；2)將離體的癌症細胞進行孵育，孵育完畢後將步驟1)所得修飾後的針尖和孵育後的所述離體的癌症細胞均置於原子力顯微鏡的樣品池中，測定所述離體的癌症細胞中所述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合力，得到所述離體的癌症細胞中所述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合機率A；所述離體的癌症細胞為含有所述靶標膜蛋白受體的癌症細胞；3)將所述離體的癌症細胞和待鑑定物質進行孵育，孵育完畢後將其與所述步驟1)所得修飾後的針尖均置於原子力顯微鏡的樣品池中，測定孵育後的所述離體的癌症細胞中所述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合力，得到所述孵育後的所述離體的癌症細胞中所述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合機率B；所述離體的癌症細胞為含有所述靶標膜蛋白受體的癌症細胞；4)如果所述結合機率B小於所述結合機率A，則所述待鑑定物質為候選的抗癌藥物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟1)修飾步驟包括如下步驟a)將所述原子力顯微鏡的針尖置於3-巰丙基三乙氧基矽烷的甲苯溶液中反應，反應 完畢後得到矽烷化的針尖；b)將所述步驟a)所得矽烷化的針尖置於氮羥基琥珀醯亞胺酯多聚乙二醇a-馬 來醯亞胺的二甲基亞碸溶液中進行反應，反應完畢得到活化後的針尖；c)將所述步驟b)得到的活化後的針尖與所述靶標膜蛋白受體的配體於溶劑中進行反 應，得到所述修飾後的針尖。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述步驟a)反應步驟中，溫度為 18-25°C，優選20°C，時間為1. 5-2小時，優選2小時；所述3-巰丙基三乙氧基矽烷的甲苯 溶液的體積百分濃度為；所述步驟b)反應步驟中，溫度為18-25°C，優選20°C，時間為2. 5_3小時，優選3小時； 所述氮羥基琥珀醯亞胺酯多聚乙二醇a _馬來醯亞胺的二甲基亞碸溶液的濃度為lmg/ ml ；所述步驟c)反應步驟中，溫度為18-25°C，優選20°C，時間為0. 5-1小時，優選0.5小 時；所述溶劑選自PBS緩衝液和Tris-HCl緩衝液中的至少一種；其中，所述PBS緩衝液的 pH值為7. 2-7. 6，優選7. 4，摩爾濃度為0. 01M，所述Tris-HCl緩衝液的pH值為7. 2-7. 6，優 選7. 4，濃度為0. 05M。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於在所述步驟a)之後，所述步驟b)之 前，所述抗癌藥物的鑑定方法還包括如下步驟將所述矽烷化的針尖依次用甲苯、丙酮和乙 醇洗滌，氮氣吹乾；在所述步驟b)之後，所述步驟c)之前，所述抗癌藥物的鑑定方法還包括如下步驟將 所述活化後的針尖用二甲基亞碸進行洗滌，再氮氣吹乾；在所述步驟c)之後，所述步驟2)之前，所述抗癌藥物的鑑定方法還包括如下步驟用 緩衝溶液洗滌所述修飾後的針尖；所述緩衝溶液選自PBS緩衝液和Tris-HCl緩衝液中的至 少一種，優選PBS緩衝液；所述緩衝溶液的pH值為7. 2-7. 4，優選7. 2。
5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特徵在於所述步驟2)和步驟3)孵育所述離體的癌症細胞步驟中，溫度均為37°C，時間均為18-30小時，優選均為24小時。
6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特徵在於所述步驟3)孵育待鑑定物質步驟 中，溫度為37°C，時間為0. 5-2小時，優選為1小時。
7.根據權利要求1-6任一所述的方法，其特徵在於所述靶標膜蛋白受體的配體為 TGF3 1，所述離體的癌症細胞為Hela細胞。
8.根據權利要求1-7任一所述的方法，其特徵在於所述步驟4)中，所述候選的抗癌 藥物為能夠抑制所述癌症細胞中所述靶標膜蛋白受體與所述配體結合的抗癌藥物；所述結 合機率A與所述結合機率B之差不小於5 %。
9.根據權利要求1-8任一所述的方法，其特徵在於所述步驟1)中，構成所述原子力 顯微鏡的針尖的材料為氮化矽。
全文摘要
本發明公開了一種提供一種基於單分子力譜檢測膜蛋白受體-配體相互作用的抗癌藥物鑑定方法。該方法包括如下步驟將靶標膜蛋白受體的配體修飾在原子力顯微鏡的針尖上，得到修飾後的針尖；將離體的癌症細胞進行孵育或再加入待鑑定物質進行孵育，孵育完畢後將步驟1)所得修飾後的針尖和孵育後的所述離體的癌症細胞均置於原子力顯微鏡的樣品池中，測定所述離體的癌症細胞中所述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合力，得到結合機率A或B，如果所述結合機率B小於所述結合機率A，則所述待鑑定物質為候選的抗癌藥物。該方法具有操作簡便，周期性短，花費低等優勢，可以鑑定各種抑制配受體相互作用的藥物。
文檔編號G01L5/00GK101975854SQ201010521638
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月21日 優先權日2010年10月21日
發明者師曉麗, 徐永春, 方曉紅, 楊勇, 梁偉 申請人:中國科學院化學研究所