aPL免疫反應性肽、其綴合物以及aPL抗體介導的疾病的治療方法

2023-11-30 22:32:51

專利名稱：aPL免疫反應性肽、其綴合物以及aPL抗體介導的疾病的治療方法
技術領域：
本發明屬於免疫學領域，同時涉及用於治療和診斷抗磷脂(aPL)抗體介導的疾病的組合物與方法。更具體地說，本發明涉及化學限定的非免疫原性效價平臺分子和aPL結合表位的免疫專一的類似物的綴合物以及用於產生這些綴合物的方法和組合物。優化的類似物缺乏T細胞表位。此外，本發明涉及用於檢測生物樣品中抗磷脂抗體的存在和測定其總量的診斷測定方法。本發明也涉及用隨機肽文庫鑑別aPL結合表位的免疫專一的類似物的方法。
背景技術：
抗磷脂抗體發生在自身免疫疾病(如全身紅斑狼瘡症(SLE)和抗磷脂抗體綜合症(APS))中並與感染和藥物療法有關。APS的特性為具有如動脈或靜脈血栓、血小板減少和流產之類的一種或多種臨床特徵。APS可能是原發的，或者它可能與其它病症相聯繫(主要是SLE)。(《磷脂結合抗體》(Harris等編輯，CRC出版社，Boca Raton,FL,1991)；McNeil等，免疫學進展，49卷，193-281頁(Austen等編輯，學院出版社，聖地牙哥，CA,1991))。大約30-40％的SLE患者有aPL，而50％的帶aPL抗體的病人卻缺乏SLE。這50％的病人可能患有其它的自身免疫風溼疾病或各種各樣的病症，或者它們可能已經接受了藥物(特別是氯丙嗪)治療。在對70位(26位男性和44位女性)原發性APS(PAPS)(但無證據表明有SLE)的患者進行的一項研究中，觀察到下列特徵患深靜脈血栓症(DVT)的有31位；得動脈閉塞(特別是中風或者瞬時局部缺血)的有31位；患心肌梗塞的有15位；患習慣性流產(fetal loss)的有24位；患血小板減少症(TCP)的有32位；Coomb氏測驗呈陽性的有10位；患Evans氏綜合症的有7位；32位有抗核抗體(ANA)，但其中29位不到1∶160；大約24位有抗線粒體抗體(AMA)(McNeil等，同上)。在所有中風患者中估測只有大約5％的變化，aPL抗體被認為是一個重要的作用因子。
如那些在VDRL試驗中檢測到的瞬時aPL抗體，發生在許多感染期間。大約30％的有永久aPL抗體的病人得過血栓病。aPL抗體的存在可在SLE患者群(他們表現出包括血栓症、TCP和流產等的一種或多種臨床特徵的綜合症)內定義一組病人。在SLE中得這種綜合症的危險總體來說大約是25％；當aPL抗體存在時危險性增加到40％，而當它們不存在時危險性減少至15％。因為aPL抗體被認為是針對原生質膜中的磷脂的，所以人們假設它們可能通過幹擾在細胞(如血小板或內皮細胞)的磷脂膜上發生的止血過程而在體內產生直接致病作用。在PAPS患者中，aPL抗體看來是存在的唯一危險因子這一事實進一步證明了這些抗體有直接致病作用通過用人抗心磷脂抗體免疫小鼠誘導PAPS是迄今證明aPL抗體是直接病原性的最好證據(Bakimer等，1992,J.Clin.Invest.89:1558-1563；Blank等，1991，美國國家科學院院報，88:3069-3073)。
在臨床環境中的aPL抗體測量仍然不完善。一套市售的標準抗血清(APL診斷公司，Louisville,KY)可產生標準曲線以用於比較在各種實驗室中進行的測定。然而，關於確切的GPL和MPL,IgG和IgM抗磷脂抗體的各自測量單位，對所給血清的等級分類和分為高、中、低滴定率的GPL和MPL的級別，在這些實驗室獲得的結果間有很多的不一致性。市售的試劑盒在分配給市售標準的值上變化很大(Reber等(1995)，血栓形成和止血劑，73:444-452)。儘管有這些局限性，但一般都認為為在APS、PAPS和其它aPL抗體介導的疾病(包括周期性中風和習慣性流產)中的抗體所識別的表位位於β2-GPI的第5區中，並且在β2-GPI與心磷脂結合後暴露給抗體。
現在人們一般接受aPL抗體識別由β2-糖蛋白Ⅰ(β2-GPI)和帶負電磷脂(例如心磷脂)構成的抗原複合體(McNeil等(1990)，美國國家科學院院報，87:4120-4124；Galli等(1990),Lancet I；1544-1547)(下文稱為「aPL免疫原」)。β2-GPI是所發現的游離的較小血漿糖蛋白並與脂蛋白脂類(其中它也叫作載脂蛋白H(apo H))相聯繫。它由被稱作Sushi的5個獨立摺疊域或者與其它蛋白質中的類似域相似的短的共有重複域構成。已報導β2-GPI在結合磷脂上經歷了抗原的和構象的變化(Wagenkneckt等(1993)，血栓形成和止血劑，69:361-365；Jones等(1992)，第5屆抗磷脂抗體國際學術討論會論文集(摘要S5))。第5域包含脂類結合和aPL抗體結合的假定位點(Hunt J.和S.Krilis(1994)，免疫學雜誌，152:653-659Lauer等(1993)，免疫學，80:22-28)。aPL的病理機制是未知的(McNeil等，同上)。大多數解釋援引內皮細胞功能或者血小板介入作用(Haselaar等(1990)，血栓形成和止血劑，63:169-173)。這些解釋提出在血管內皮細胞傷害或者血小板激活後，陰離子磷脂向原生質暴露表面的暴露或跨雙層遷移可能會導致β2-GPI結合和引發aPL抗體形成。
aPL抗體可能通過減少前列環素形成(Vermylen,J.和J.Arnout(1992)，臨床實驗室醫學雜誌，120:10-12)，通過直接幹擾凝結蛋白質的作用，或者通過封阻抑制內在血液凝固途徑、血小板凝血原酶活性、和腺苷二磷酸(ADP)介導的血小板聚集的β2-GPI的能力(Arvieux等(1993)，血栓形成和止血劑，60:336-341)而直接起原血栓形成作用在搜索鉛化合物的藥物化學中的一種主要的新工具已引起提供巨大的分子多樣性的組合文庫的出現。分子多樣性可以從化學合成或生物系統中產生(Scott.,J.K.[合理的藥物設計](CRC出版社，Weiner,D.B.和W.V.Williams編輯，Boca,Raton,FL.,1994)；Moos等(1993)，藥物化學年報，28:315-324)。通過在絲狀噬菌體的表面顯示隨機肽，人們已經創造了包含用臨床顯著的抗體來進行檢測的數以億計的克隆的表位文庫(Scott,J.K.和G.P.Smith(1990)，科學，249:286-390；Cesareni,G.(1992)FEBS Lett.307:66-70)。通過把隨機化的寡核苷酸序列(通常是pⅢ基因，該基因編碼每個噬菌體表面上的單一肽序列)結合到噬菌體基因組中來製備這樣的噬菌體文庫。在親和純化和擴增的順序循環之後，使結合抗體的那些噬菌體在大腸桿菌中增殖並通過測序病毒脫氧核糖核酸(DNA)的相應編碼區鑑別結合肽。在大多數情況下，隨後的研究將涉及相應的合成肽(在建立它們結合抗體的能力之後)。基於噬菌體的文庫已用來模仿不連續的表位(Luzzago等(1993)，基因，128:51-57；BaLass等(1993)，美國國家科學院院報，90:10638-10642)。基於肽的藥物的潛在的血漿不穩定性已經成功地通過N-末端封阻或者正確的使用胺基酸類似物得到克服(Powell,M.F.(1993)，藥物化學年報，28:285-293)。
對顯示高效價aPL抗體的患者，現在無可選擇的免疫專一的療法。在許多情況下，已經證明用藥(如阿斯匹林、甾類化合物和華法林)在很大程度上不充分([磷脂-結合抗體](Harris等編輯，CRC出版社，Boca Raton,FL,1991)；McNeil等，同上)。合成的模擬肽(其特徵是(ⅰ)不能激活T細胞但(ⅱ)保持結合免疫B細胞的能力)用於以抗原特異性方式耐受B細胞。這項技術公開在共有的、共同未決的美國專利申請系列號08/118,055(於1993年9月8日申請)和美國專利號5,268,454中，這些申請和專利以其整體與本文一併參考。如以上引用的申請和專利所公開的，B細胞耐受力限制了綴合到多價的、穩定的、非免疫原性效價平臺上的肽的施用，從而通過B細胞無變應性或在交聯表面免疫球蛋白後的克隆缺失來消除抗體的產生。
雖然aPL抗體識別的靶表位的確切分子性質是未知的，然而利用得自表位文庫的肽將使成功的耐受原得以構建。用於與人類全身紅斑狼瘡有關的腎炎的治療的B細胞耐受原也已經在共有的美國專利5,276,013和5,162,515中公開，它們以其整體與本文一併參考。
發明描述本發明在於發現了一種利用隨機肽噬菌體文庫的、用於鑑別在患有PAPS、APS和其它aPL抗體介導的疾病(如周期性中風和習慣性流產)的患者中為aPL抗體所識別的關鍵表位的類似物的方法。
因此，本發明的一個方面是用於篩選隨機肽噬菌體文庫以便鑑別充分模擬由aPL抗體識別的表位的肽序列的一種改進方法。該方法包括以下步驟(a)利用從本領域已知的那些方法修改的方法來生物淘選(biopanning)所說的文庫；(b)通過(ⅰ)在塗布有結合到蛋白質G的aPL抗體的微量板孔中培養噬菌體，(ⅱ)洗滌微量板孔以移去未結合的噬菌體，(ⅲ)洗脫結合的噬菌體，以及(ⅳ)用洗脫的噬菌體感染微生物(如大腸桿菌)，並通過在瓊脂上進行平板接種來計算被感染過的微生物的數量，通過微量淘選(micropanning)由步驟(a)篩選得到的噬菌體來除去結合很弱的噬菌體；(c)通過(ⅰ)用aPL抗體塗布微量板孔，(ⅱ)在所塗布的孔中培養為(b)中微量淘選所鑑別的最強結合的克隆，並洗掉未結合的噬菌體，(ⅲ)在比色ELISA測定中利用酶綴合的山羊抗噬菌體抗體計算結合至抗體上的噬菌體的數量，通過噬菌體俘獲ELISA的評價確定在(b)中回收的最強結合克隆；如果鑑別到若干相同強結合的克隆，則附加一步(d)在最強結合噬菌體俘獲ELISA克隆上進行噬菌體ELISA。
在這一點上，本發明包括用於鑑別特異性結合aPL抗體(分離自患有aPL抗體介導的疾病的患者)之表位的類似物的方法，該方法包括(a)製備噬菌體隨機肽文庫；(b)篩選所說的具有aPL抗體的文庫，以鑑別aPL模擬表位，其中所說的篩選包括(ⅰ)通過生物淘選篩選所說的文庫；(ⅱ)通過微量淘選篩選經(ⅰ)中的生物淘選分離的噬菌體；以及(ⅲ)通過免疫測定鑑別在(ⅱ)中回收的包含aPL抗體高親和性結合肽的噬菌體。
本發明也包括一種生物淘選噬菌體隨機肽文庫以鑑別和分離結合到aPL抗體上的肽的方法，該方法包括(a)使親和純化的aPL抗體與攜帶隨機肽插入片段的噬菌體反應；(b)回收攜帶有結合到aPL抗體上的隨機肽插入片段的噬菌體；(c)用在(b)中回收的噬菌體感染微生物；和(d)在包含抗生素的培養基中培養感染過的微生物以分離噬菌體。
本發明還包括一種微量淘選噬菌體隨機肽文庫以鑑別和分離具有與aPL抗體的高結合親和性的肽的方法，該方法包括(a)通過生物淘選分離攜帶隨機肽插入片段的噬菌體；(b)在塗布有結合到蛋白質G上的aPL抗體的微量板孔中培養步驟(a)中回收的噬菌體；(c)洗滌微量板孔，除去未結合的噬菌體；(d)洗脫結合的噬菌體；(e)用在(d)中回收的噬菌體感染微生物；和(f)在包含抗生素的培養基中培養感染過的微生物以分離噬菌體。
本發明也包括上述的方法，其中免疫測定是噬菌體俘獲ELISA，該方法包括(a)在塗布有aPL抗體的微量板孔中，培養通過微量淘選分離的攜帶隨機肽插入片段的噬菌體；(b)洗掉未結合的噬菌體；(c)在孔中溫育酶標記的抗噬菌體抗體；(d)洗掉未結合的酶標記的抗噬菌體抗體；(e)添加比色底物；和(f)測量底物的吸收率，以鑑別高溫(high-t)親和性結合噬菌體。
本發明也包括上述的方法，並且還包括進行附加的高親和性結合噬菌體的噬菌體俘獲ELISA測定，該方法包括(a)在微量板孔上塗布上相同數量的噬菌體；(b)在孔中培養aPL抗體；(c)洗掉未結合抗體；(e)用結合的aPL抗體與酶標記的抗aPL抗體一起培養；(f)洗掉未結合的酶標記的抗aPL抗體；(g)將比色底物添加至孔中；(h)測量底物的吸收率，以測量噬菌體的相對結合親和性。
本發明也包括以上所述的方法，其中所說的免疫測定是一種菌落印跡免疫測定，該方法包括(a)在包含瓊脂的培養基頂上的硝酸纖維素膜上培養受到攜帶隨機肽插入片段的噬菌體感染的微生物；(b)通過在包含瓊脂的培養基頂上的第二個硝酸纖維素膜上印跡微生物來複製轉移(a)中培養的微生物；(c)培養轉移的微生物；(d)裂解所說的微生物；(e)用溶菌酶消化微生物；(f)用明膠溶液封阻膜；(g)將aPL抗體與膜一起培養；(h)洗掉未結合的aPL抗體；(i)將硝酸纖維素膜與酶標記的抗aPL抗體一起培養；(j)洗掉未結合的酶標記的抗aPL抗體；(k)添加比色底物；和(l)測量底物的吸收率以鑑別高親和性結合的噬菌體。
本發明也包括一種用於測定和分級親和結合特徵表位的方法，所說的表位特異性結合分離自患有aPL抗體介導的疾病的患者的aPL抗體，該方法包括(a)用心磷脂塗布微量滴定板的孔；(b)添加成年牛或人血清作為β2-GPI源以結合心磷脂並阻止與平板的孔的非特異性結合；(c)溫育單體類似物溶液和高效價的aPL抗體一段預定的時間；(d)向微量滴定板孔中添加aPL抗體/類似物混合物並溫育一段預定的時間；(e)洗滌孔以洗掉未結合的aPL抗體；(f)將與標記(例如，酶)綴合的抗人類IgG添加到平板孔中，培養一段預定的時間；(g)洗滌孔以洗掉未結合的抗人類IgG綴合物；(h)添加標記的綴合物的底物，進行底物/標記反應一段預定的時間；(i)測量底物/標記反應的最終-產物以定量結合至孔上的aPL抗體的量；(j)計算aPL抗體結合的抑制作用(如果有的話)百分比，以確定類似物對aPL抗體的親和性。
本發明的另一方面包括測定結合到aPL抗體上的肽的解離常數的螢光極化肽結合測定。這一測定檢測肽與aPL抗體的直接結合。
本發明也包括一種用於確定aPL抗體在得自懷疑患有aPL抗體介導的疾病的患者的體液中的存在的診斷免疫測定法，該測定法包括使特異性結合aPL抗體的表位的類似物與體液樣品接觸，以及利用本領域所熟知的方法來確定aPL抗體是否在體液中存在，如果存在，則定量在液體中存在的aPL抗體的量。一個這樣的免疫測定法包括(a)用特異性結合aPL抗體的表位的類似物塗布在微量滴定板的孔上；(b)洗滌孔以洗掉未結合的類似物；(c)將體液試驗樣品添加至孔中，並溫育一段預定的時間；(d)洗滌孔以除去未結合的試驗樣品；(e)將與標記綴合的抗人IgG添加到平板孔中，溫育一段預定的時間；(f)洗滌孔以洗掉未結合的抗人IgG綴合物；(g)添加標記的綴合物的底物，並進行底物/標記反應一段預定的時間；(h)測量底物/標記反應的最終產物，以確定抗aPL抗體在試驗樣品中的存在。本發明也包括一種如上所述的診斷免疫測定法(其中的免疫測定是定量的)。
噬菌體ELISA測定包括(ⅰ)在微量滴定板的孔上塗布上相同量的不同克隆，隨後(ⅱ)通過在孔中添加抗體並用酶標記抗人IgG綴合物發展該反應來鑑別最強地結合aPL抗體的肽插入片段。具有與aPL抗體的高結合親和性(正如由噬菌體ELISA、菌落印跡或噬菌體俘獲ELISA所測量的)的噬菌體所顯示的隨機肽表示aPL特定的表位的類似物。然後合成這些肽並用競爭測定法按結合強度分級。
本發明的另一個方面是特異性結合到B細胞(aPL表位結合到其上)上的aPL抗體結合類似物。優化的類似物缺乏T細胞表位。
此外，本發明的另一個方面是引發耐受aPL免疫原的特定B細胞的組合物，該組合物包含非免疫原性效價平臺分子和aPL抗體結合類似物的綴合物，所說的抗體結合類似物(a)特異性結合B細胞(aPL免疫原結合於其上)和(b)缺乏T細胞表位。
附圖簡要說明

圖1顯示在市售的aPL抗體標準的ELISA測定中魚明膠取代成年牛血清廢除了所有抗心磷脂(ACA)活性。這一結果支持了McNeil等(同上)和Galli等(同上)的研究結果(涉及β2-糖蛋白Ⅰ(β2-GPI)在定義ACA的靶表位中的重要性)。
圖2顯示樹脂結合類似物5AI2免疫專一地結合到親和純化的IgG(命名為ACA-6501)上。
圖3說明通過利用ACA-6626篩選得到的aPL抗體結合類似物結合aPL抗血清但不結合正常的血清。
圖4也說明ACA 6501/5AI2類似物免疫專一地結合ACA-6501抗血清，並與ACA-6626進行交叉反應。
圖4和5說明，當通過利用本發明範圍之內的方法篩選得到的ACA6501/5AI2和ACA 6626/4D3 aPL抗體結合類似物優選地與篩選抗體結合時，檢測到明顯程度的交叉反應。
圖6說明用於計算ACA-6501aPL抗體的GPL值的方法。
圖7顯示與GPL標準血清相比的親和性分離的ACA-6501活性。
圖8說明在通過第四次生物淘選分離得到的克隆的序列多樣性方面的明顯下降。
圖9說明在用ACA-6635的噬菌體俘獲ELISA中三個克隆(3AI2、3B3和3A5)顯示出很強的免疫專一的信號，而所試驗的所有克隆與正常的IgG都無反應。
圖10顯示在用ACA-6501的噬菌體ELISA中七個克隆顯示出強的信號。
圖11顯示利用ACA-6501用肽5AI2、CB2和3B10得到的競爭結合ELISA的結果。0.16μg的肽5AI2對ACA-6501aPL抗體與四價肽ACA6501/3B10(結合至聚苯乙烯微量板孔上)的結合產生50％的抑制作用，而需要0.08μg CB2和0.54μg 3B10來產生50％的抑制作用。
圖12說明修飾的ACA-6641/3G3類似物的競爭活性。
圖13說明在用ACA-6501 aPL抗體的競爭性結合ELISA中肽139、142和143的50％抑制值分別是6.9、0.7和0.9μg。
圖14說明在肽3B10中的3、9位和3與9兩個位上取代α-Me-Pro的效應。與「天然」肽相比，在9位的α-Me-Pro的取代使肽的活性增加了四倍。
圖15顯示肽6641/3G3(LJP 688)與九種親和純化的ACA抗體高度進行交叉反應。
圖16和17顯示在脾細胞(得自用LJP 685-KLH免疫處理過的小鼠)分別用100、20和4μM的LJP 685-MTU-DABA-PEG綴合物(化合物36)和LJP 685-ATU-MTU-AHAB-TEG綴合物(化合物35)培養2小時後，利用該脾細胞在108M下在抗685抗體ABC方面的劑量依賴性的減弱。
圖18顯示最靠近上述肽925的九種結構的質心的核磁共振結構，並且是肽925分子形狀的合理的表示。
圖19把肽925(在如3G3的圖的底部標記)的結構與肽5A12的結構相比較。兩種肽在肽序列中大約相同的位置都有轉角。
圖20A和20B說明aPL類似物的藥效基團已初步鑑定為小疏水基團和帶正電的基團。如圖20A所示的肽925的偕二甲基和氨基基團初步鑑定為這個肽的藥效基團。在圖20A中說明了限制藥效基團到一些支架上的碳氫化合物接頭的長度以及分開這些接頭連到支架上的位點的距離。
圖21說明通過稀釋6501血清由6501衍生的肽對β2-GPI的抑制作用。
圖22顯示CB2*-F的ACA-6701滴定FITCGPCILLARDRCG。
圖23顯示CB2*-F的ACA-6501滴定FITCGPCILLARDRCG。
圖24顯示CB2*-F的完全的ACA-6501滴定FITCGPCILLARDRCG。
圖25顯示利用1.04當量的CB2*對來源於ACA-6701的CB2*-F的置換。
圖26顯示利用CB2*以置換來源於ACA6701的CB2*-F的cFP滴定。
圖27顯示利用3B10以置換來源於ACA6701的CB2*-F的cFP滴定。
圖28顯示(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物的耐受活性的劑量效應。
圖29顯示(LJP685)4/MTU-DABA-TEG綴合物的耐受活性的劑量效應。
圖30顯示在體外模型中檢驗的(LJP685)4/MTU-DABA-TEG綴合物的耐受活性的劑量效應。
圖31顯示在體外模型中檢驗的(LJP685)4/MTU-DABA-TEG綴合物的耐受活性的劑量效應。
圖32顯示比較各種施用途徑和劑量範圍的(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物的耐受效應。
實施發明的方法A．定義本文中所用的術語「aPL抗體」指特異性地結合介導疾病的β2-GPI的任何抗體。
如本文中所用的，術語「B細胞無反應性」指需要T細胞輔助來產生和分泌抗體的那些B細胞的不反應性，包括(但不限制於)未成熟和/或成熟B細胞的無性系缺失和/或B細胞無能力產生抗體。
「不反應性」指在對免疫原的體液反應方面的治療上有效性的降低。數量上的減弱(如通過抗體產率減少而測得的)至少是50％，優選地至少是75％，最優選為100％。
「抗體」指具有T細胞依賴性的那些抗體。
如本文中所用的，術語「免疫原」是指能引起體液免疫反應的實體(包含aPL抗體)。免疫原有B細胞表位和T細胞表位。在aPL抗體介導的病理學中涉及的aPL免疫原可能是外部的(對個體來說是外源的)免疫原(如藥物)，包括對個體來說是外源的天然生物物質(如治療蛋白質、肽和抗體以及類似物)或者自身免疫原(自免疫原)(如與抗體介導的超凝固性(中風)有關的那些自免疫原)。
免疫原的「類似物」術語指一種分子，該分子(a)特異性地結合到與免疫原特異性地結合的抗體，(b)缺乏T細胞表位。儘管類似物通常是免疫原的片段或者衍生物，並由此具有與免疫原相同的化學類別(例如，免疫原是多肽而類似物也是多肽)，但化學相似不是必要的。因此，只要類似物具有以上(a)和(b)的功能特徵，則它可以具有與免疫原不同的化學類別(如免疫原是碳水化合物而類似物是多肽)。類似物可能是肽、碳水化合物、脂類、脂多糖、核酸或其他生化體。另外，免疫原和類似物的化學結構都不需限定於本發明的目的。
免疫原的「類似物」術語也包括術語「模擬表位」。術語「模擬表位」指一種通過競爭阻止抗體結合免疫原的分子。因為它特異性結合上述抗體，所以人們認為模擬表位模仿了免疫原的抗原決定簇。
如本文所使用的，「效價平臺分子」指包含有利於一系列免疫原的類似物的連接的位點的非免疫原性分子。
「非免疫原性」用來描述效價平臺分子，同時指當對個體自身施用藥物時效價平臺分子本質上不引起免疫反應。
如本文所使用的，「個體」指哺乳動物物種中的一員，並且包括人類、靈長類、小鼠和家畜(如牛和羊)、運動動物(如馬)和寵物(如狗和貓)。
如本文所使用的，「藥效基團」指在aPL類似物與抗體靶的結合中涉及到的主要基團的三維取向和化學性質。B.aPL抗體結合類似物的鑑別aPL抗體結合類似物可以通過篩選侯選分子來確定它們是否(a)特異性結合到aPL抗體上，以及(b)缺乏T細胞表位。與aPL抗體的特異性結合可以用常規的免疫測定法(如下列實施例提到的ELISA法)來測定，同時T細胞表位的存在與否也可由該實施例中描述的常規T細胞活性測定法確定。在這一點上，「特異性地結合」到血清抗體(抗免疫原的)上的類似物顯示其合理的親和性，例如107M-1。T細胞表位的存在與否也可利用在08/118,055系列號中所公開的氚化胸苷摻入測定法來測定。T細胞表位的存在也能通過利用本領域已知的方法測量源於T細胞的淋巴激活素的分泌來測定。一般認為在以上背景下不能引起胸苷的統計學上明顯的摻入的類似物缺乏T細胞表位。應該認識到胸苷摻入的量可以隨著免疫原變化。典型的刺激指數大約低於2-3，更常見的是大約1-2(表明缺乏T細胞表位)。C．綴合物的製備將aPL抗體結合類似物偶聯到非免疫原性效價平臺分子上以製備本發明的綴合物。優選的效價平臺分子是生物上穩定的(即它們顯示出一種從幾小時到幾天到幾個月的活體內排洩半壽期以賦予治療功效)，並優選包含限定組合物的一條合成單鏈。它們通常具有在大約200至200,000的範圍內的分子量，通常為大約200至20,000。在本發明範圍內的效價平臺分子的例子是如聚乙二醇(PEG)、聚-D-賴氨酸、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮的聚合物。優選的聚合物基於具有大約200至大約8,000分子量的聚乙二醇(PEGs)。
其它適合用於本發明的效價平臺分子是化學限定的、非多聚的效價平臺分子，這些分子公開在共有的、共同未決的美國專利申請系列號08/152,506(申請於1993年11月15日)中，該申請以其整體與本文一併參考。特別優選的同類的化學限定的適合用於本發明的效價平臺分子是衍生的2,2』-亞乙基二氧基二乙胺(EDDA)和三甘醇(TEG)。
附加的適合的效價平臺分子包括四氨基苯、七氨基β環化糊精、四氨基季戊四醇、1,4,8,11-四氮雜環十四烷(Cyclam)和1,4,7,10-四氮雜環十二烷(Cyclen)。
aPL抗體結合類似物與效價平臺分子的綴合可以以許多方式實現，典型地包括一種或多種交聯劑以及在類似物和效價平臺分子上的官能團。
多肽類似物包含胺基酸的側鏈部分，這些側鏈部分含有如氨基、羧基或者巰基(作為偶聯類似物到載體上的位點)的官能團。如果類似物還沒有這些基團，那麼可以將有這樣的官能團的殘基添加到類似物上。這些殘基可以用固相合成技術或者重組技術摻入，這兩種技術在肽合成領域中都是已知的。在碳水化合物或者脂類類似物的情況下，功能性氨基和巰基可用常規化學方法摻入其中。例如，伯氨基可以通過在氰基硼氫化鈉存在下與1,2-亞乙基二胺反應來摻入，而巰基則可以通過半胱胺二鹽酸鹽的反應以及隨後的利用標準二硫化物還原劑的還原反應引入其中。如果不具有適合的官能團，那麼可以用一種類似的方式產生包含官能團的效價平臺分子。
可變長度的親水接頭對把肽或者其它生物活性分子與效價平臺分子相連接來說是有用的。適合的接頭包括乙二醇的線性低聚物或者聚合物。這樣的接頭包括具有R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2分子式的接頭，其中n=0-200,m=1或2,R1=H或如三苯甲基的保護基團，R2=H或烷基或芳基(例如4-硝基苯基酯)。這些接頭對於把包含硫醇反應基團(如滷乙醯、馬來醯亞胺等)的分子(通過硫醚)連接到含有的氨基的第二分子(通過醯胺鍵)上是有用的。這些接頭在連接順序上是靈活的，即硫醚可以首先或者最後形成。
通常配製綴合物供注射施用(例如腹膜內注射、靜脈注射、皮下注射、肌肉注射等)。因此，典型地是將它們與藥學上可接受的載體(如鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液等等)混合。綴合物通常佔製劑重量的大約0.01％至10％。以「治療有效的量」對個體施用的綴合物，「治療有效的量」即該施用量足以使B細胞對所涉及的免疫原無反應性並實現所說的抗體介導的病症的預防、改善或消除。特定的劑量方案(即劑量、用藥時間和重複)取決於具體的個體以及該個體的病史。通常，每周施用一次大約1μg至100mg綴合物/kg體重的劑量，優選為大約100μg至10mg/kg體重。其他合適的用藥方案的頻度為例如每日一次或者每周3劑，或者每周1劑，或者每2周至4周1劑，或者每月1劑，或者按照個體或者疾病狀態利用頻度較低的方案。可能需要重複施用(通常按照B細胞周轉率確定施用時間)以達到和/或者保持體液無反應性狀態。如果檢測到抗體效價上的增加，那麼這樣的重複施用將典型地包括每30至60天(或者更短時間)大約1μg到10mg/kg體重(或者更高劑量)。另外，綴合物的持續不斷的釋放配方可以指示一些病態。用於實現持續釋放的各種配方和儀器是本領域所已知的。
抗輔助T細胞的治療可與施用綴合物一道進行。這樣的治療通常使用抑制T細胞的藥劑(如甾類化合物或者環孢菌素)。D．aPL抗體的抗原的特性本發明者在aPL抗體上的初步研究與分析被這些抗體所識別的抗原位點的特性的出版物相吻合。最初人們認為這些抗體很象那些在VDRL試驗中檢測到的抗體一樣可識別心磷脂分子。如圖1所示，在抗心磷脂抗體(ACA)固相ELISA中，以魚明膠取代成年牛血清基本上廢除了按照ACA標準購得的抗體製劑的所有ACA活性。這一發現表明ACA抗體識別在血清蛋白質上的決定簇(如由McNeil等，同上和Galli等，同上所提出的)而非心磷脂本身。這些作者顯示這個蛋白質是β2-GPI，因此術語「ACA」或者「抗心磷脂抗體」實際是用詞不當，但是今天仍然用來指這些抗體。
大多數自身免疫的、IgG aPL抗體識別在β2-GPI分子上的決定簇。這些表位僅僅在它與心磷脂(新表位)結合時才形成或者暴露在β2-GPI上。另外，在β2-GPI上的表位可以存在於每個β2-GPI分子的單個拷貝之中，並且可以有較低的對aPL抗體的親和性。只有通過這些位點之兩個在鄰近β2-GPI分子上的排列(由它們與心磷脂的結合)，才能實現保持抗體-抗原相互作用的足夠親合力。
在本發明(模擬天然B2-GPI的表位)範圍之內通過aPL類似物的核磁共振(NMR)分析得到了對β2-GPI表位結構的更深入了解。例如，與aPL抗體進行高度交叉反應的兩種肽aPL類似物的核磁共振溶液結構的比較顯示在肽序列(參見圖18和19)中，兩種肽在大約相同的位置都有轉角。E．ACA ELISA與臨床樣品的GPL得分關連的大規模檢驗和研究抗體與β2-GPI的層析純化的必要性導致開發了一種性能上與市售的試劑盒近乎一致的並且與發現具有最佳可再現性(Reber等，同上)的設計相似的aPL抗體的ELISA測定法。一種改進的ACA ELISA也已經完成，其中在缺少心磷脂(首先加至微量板孔中)的情況下直接結合至特定的微量平板上的β2-GPI用來直接結合aPL IgG。(參見Roubey等(1996)，關節炎和風溼病39:1606-1607；R.A.S.Roubey(1996)，關節炎和風溼病，39:1444-1454)。F．aPL抗體的免疫親合純化為了分離aPL抗體，將多層狀、包含心磷脂的分散體(脂質體；也包含膽甾醇和三十二烷基磷酸酯)與aPL血漿(或者血清)一起溫育。這些脂質體是通過離心從血清中沉澱得到的。在洗滌後，由2％辛基葡糖苷去垢劑破壞上述脂質體混合物，並將其用於蛋白質A-瓊脂糖柱。接著充分洗滌以便首先除去脂類，然後除去非IgG組分，用弱酸把IgG aPL抗體從蛋白質A中洗脫下來，中和、緩衝交換並在ACA ELISA中測驗該抗體。這一方法產生富含高達10,000倍的aPL抗體，如利用兔IgG抗人β2-GPI抗血清的Western印跡法所示，其對β2-GPI沒有任何汙染。通過在固相β2-GPI上的親和純化的抗體的層析來完成一個附加的親和純化步驟。推薦上述第二個親和純化步驟作為新發現的結果，該新發現是關於直接結合到β2-GPI上的aPL抗體的更大臨床關聯的。它也用來進一步確保最終製備物無汙染，尤其是β2-GPI。G．絲狀噬菌體隨機肽文庫的構建在p-Ⅲ蛋白質上構建十一個不同的fUSE 5絲狀噬菌體隨機肽文庫(每個噬菌體含5個具有肽的p-Ⅲ拷貝)。這些文庫為模擬表位的發現提供了大量的形狀和結構。4個文庫(指定為「x」文庫)具有肽插入片段(長度分別為8、10、12和15個殘基)，並在氨基和羧基末端兩側連有脯氨酸殘基。這些脯氨酸殘基的作用在於破壞任何對二級結構的貢獻(可能從天然P-Ⅲ蛋白質產生)並使插入片段進入溶劑。「y』」文庫包含長度為6、7、8、9、11和13個胺基酸的半胱氨酸結合的插入片段。除了缺乏6和8個胺基酸的插入片段外，「y」文庫與「y』」文庫相同。「y」和「y」文庫的這些肽插入片段在氨基和羧基末端側連半胱氨酸殘基從而形成環狀的、更穩固的結構。由於類似於以上的「x」文庫的理由，在這些半胱氨酸殘基的外部摻入脯氨酸殘基。「x」、「y』」和「y」文庫定位在天然p-Ⅲ蛋白質的氨基末端的5個殘基上。「z」文庫包含定位於p-Ⅲ蛋白質的氨基末端上的隨機的8個胺基酸插入片段，並且不包含任何側翼脯氨酸或者半胱氨酸殘基。「x」、「y』」和「z」文庫的組合代表了十一個不同的文庫，其中每個有大約一億個不同的肽插入片段。
利用標準的分子生物學技術通過摻入合適長度(適合於產生所需長度的、插入fUSE的p-Ⅲ基因中的插入片段)的隨機寡核苷酸序列來構建這些文庫。在fUSE 5 DNA的限制性核酸內切酶消化之後，加入過量的激酶寡核苷酸(作為缺口雙鏈體提供)並連接。將DNA電穿孔進入大腸桿菌，並通過在包含四環素的培養基中培養來選擇插入片段。從上清液中分離這種培養物的噬菌體(包含肽插入片段)，並在緩衝液中洗滌和再懸浮。典型地，文庫在每mL8×1012轉導單位下顯示有7×108個獨立克隆。H．噬菌體篩選方法篩選噬菌體顯示肽文庫的本質在於將幾十億潛在的候選噬菌體減少到相對較少的具有顯著性質的噬菌體的能力。原來的篩選方案由Scott,J.K.和G.P.Smith(1990)(科學，249:315-324)推薦，該方案經過大的改動而修改為有利於選擇各種aPL抗體的最好表位。設計這些方法使選擇更加嚴格，當篩選進行直到達到某一點時，其中有用數量的代表最好序列的克隆可以得到全面的研究。對一些抗體，文庫看來似乎沒有可以結合很緊的序列，如果用高度嚴格的方法篩選，則不存在特異性的克隆。在另一方面，所說的文庫經常產生代表上述抗原的良好類似物的許多克隆，同時有必要使用高度嚴格的方法來鑑別最好的表位。由於這一原因，開發了不同嚴格程度的測定法，以便從表位文庫篩選中鑑別最好的表位。在這裡按逐漸增加的嚴格程度的順序列出測定法；生物淘選＜微量淘選＜噬菌體俘獲ELISA＜噬菌體ELISA=菌落印跡=肽ELISA。
(ⅰ)生物淘選「生物淘選」描述這樣的技術，其中使親和純化的aPL抗體和攜帶隨機肽插入片段的噬菌體混合，而後抗體-特異性回收俘獲結合的噬菌體。噬菌體賦予大腸桿菌(在包含四環素的培養基中培養然後分離的)以四環素抗性。多輪生物淘選增加了樣品中免疫專一的噬菌體的數量。噬菌體總是在3至5輪選擇後得到回收，但是可以僅代表對選擇的抗體以低親和性非特異性結合的序列。用於進一步評價這些噬菌體的方法(微量淘選)是需要的。
(ⅱ)微量淘選噬菌體與aPL抗體的結合的相對強度的估計可以通過「微量淘選」來進行。微量淘選是在3輪或更多輪生物淘選後進行的並使用與生物淘選方法相同的抗體。該方法包括稀釋來自生物淘選的最後一輪的噬菌體，通過微量淘選對50或更多個這樣的克隆進行分析。通過使每個克隆生長到相似的密度，並在預先塗布有常量抗體的微量滴定孔中在最適的單一濃度下培養稀釋的噬菌體來完成微量淘選。噬菌體的最適的單一濃度是最有可能揭示最寬範圍的微量淘選得分(從0到4+)並因此使得在測驗的克隆中間有最大差別的那一濃度。它是基於6個隨機選擇的克隆的微量淘選行為，其中的得分是在由系列稀釋獲得的幾個噬菌體濃度之每一個下確定的。在與抗體一起培養之後，洗掉未結合的噬菌體，並將結合噬菌體的量用作為噬菌體插入片段對抗體的親和性的指示。結合噬菌體的量是由弱酸洗脫隨後中和並以大腸桿菌感染來確定的。通過將該微生物平板接種在含四環素的瓊脂平板上，然後確定每個克隆所達到的菌落密度，來定量感染的大腸桿菌的數量。
(ⅲ)噬菌體俘獲ELISA開發噬菌體俘獲ELISA試驗以提供一種中等水平測定來在比較低的嚴格程度的微量淘選測定和高的嚴格程度的噬菌體或肽ELISA測定之間的間隙搭橋。初步的研究顯示通過微量淘選(但是沒有通過噬菌體ELISA或者肽ELISA)一些抗體製劑給出太多陽性克隆。以下所描述的噬菌體ELISA的限制是只有p-Ⅲ的五個拷貝位於每個噬菌體中，即使將大量噬菌體塗布在孔上，也只有插入片段的極少拷貝被體現，並且檢測需要抗體對插入片段有十分高的親和性。通過噬菌體俘獲ELISA，信號擴增許多倍從而有利於低親和性的檢測以及上述抗體與上述插入片段之間的穩定的相互作用。
噬菌體俘獲ELISA包括下列步驟。在微量滴定孔上塗布aPL抗體，並如在微量淘選測定中添加噬菌體克隆。洗掉未結合的噬菌體，利用酶綴合的山羊抗血清(結合噬菌體的大多數外殼蛋白)來定量結合噬菌體的量。使利用噬菌體俘獲ELISA篩選得到的噬菌體與許多aPL抗體反應，並在隨後進行的ELISA測定中提供強信號。這一中等水平的靈敏性使得肽合成更為有效率，因為極少微量淘選陽性的噬菌體是噬菌體俘獲ELISA陽性的。結果是，由陽性的噬菌體俘獲ELISA噬菌體合成的肽一般是免疫反應性的。
(ⅳ)噬菌體ELISA這種選擇噬菌體的方法要求插入片段十分緊地結合篩選的抗體。將噬菌體直接塗布在微量滴定板的孔上並與篩選的抗體一起培養。隨後洗掉未結合的抗體，添加抗人IgG鹼性磷酸酶綴合物以結合任何結合到噬菌體上的aPL抗體。然後按照本領域已知的方法通過在孔中加入比色底物(其將與鹼性磷酸酶反應)來檢測APL抗體。
(ⅴ)菌落印跡該測定方法使得可以大規模地菌落篩選由生物淘選噬菌體感染的大腸桿菌。這一方法可替代噬菌體ELISA來鑑別免疫反應的克隆，並且顯示出類似的靈敏性水平而不需要在試驗前培養單獨的噬菌體克隆。在這種測定中，將受到來源於一輪生物淘選的噬菌體感染的大腸桿菌塗布在一個大直徑的硝酸纖維素(NC)膜上並且在含四環素的瓊脂平板的表面上培養一夜(Barbas等(1991)，美國國家科學院院報，88:7978-7982)。每個菌落從含有相同序列的噬菌體的感染產生。利用這種NC「主培養基」在NC上製得若干複製轉移印跡，並且使這些印跡得以在瓊脂平板的表面上生長。在印跡上的噬菌體感染的菌落的化學和酶促破壞後，可以用一般用於Western印跡法的技術(即用染色或者免疫印跡)來探測噬菌體。被封阻的印跡可與篩選的aPL抗體一起培養。在洗掉未結合的抗體後，添加抗人IgG辣根過氧化物酶綴合物以結合任何結合到噬菌體上的aPL抗體。比色底物的添加使得人們可以定位在主平板中的離散菌落，該菌落代表可被克隆供進一步研究的免疫專一的噬菌體。
(ⅵ)肽ELISA
在用上述測定方法確定最佳反應的噬菌體的肽插入序列的DNA測序之後，利用本領域所熟知的標準Fmoc肽化學製備相應的肽。對於肽ELISA測定，可以製得上述肽，例如製成分支四價分子(即每個分子有插入片段的四個拷貝)。這樣的分子可以塗布在微量滴定板的孔上，並且仍然使表位向溶液暴露從而使之得以與抗體結合。以類似於用於多抗原肽類(MAPS)的方法(Posnett等(1988)，生物化學雜誌，263:1719-1725)，通過摻入賴氨酸作為頭兩個偶聯的分支點來合成四價肽。將由甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-絲氨酸組成的間隔添加在賴氨酸之後的每個臂上，然後添加插入片段(包括在噬菌體中所發現的構架胺基酸，在羧基末端的脯氨酸-甘氨酸，和在氨基末端的丙氨酸-甘氨酸脯氨酸)。利用標準Fmoc方法將所有利用這種合成的胺基酸一次加入一個。
這些肽由ELISA測定，即通過把這些肽塗布在微量滴定的孔上，然後以一種標準的ELISA格式測定它們與aPL抗體的反應性。實際上，肽通常很強地結合在原來的篩選抗體上，同時顯示與其它aPL抗體的一定的交叉反應性。包括非aPL抗體的對照以除去非特異性結合肽類。
(ⅶ)競爭性結合肽ELISA一旦ELISA陽性的肽類得到鑑別，就有必要定量它們相應的對aPL抗體的結合親和性，同時通過肽競爭ELISA測定來確定是否兩肽結合在給定的病人血清中的相同的抗體群。在這種測定中，各種單體肽與塗布在微量滴定板上的四價肽競爭。為完成測定，利用標準Fmoc化學將要評價的肽合成為單體(即沒有在四價肽的合成中所用的賴氨酸分支)。然後將單體肽純化，並且以已知濃度溶解。在微量滴定板的孔中塗布已知結合到aPL抗體上的四價肽。系列稀釋的單體肽與恆定量稀釋的aPL抗體一起溫育。通過滴定抗四價肽的抗體和在滴定率曲線的下斜部分上選擇稀釋度來預先確定aPL抗體的稀釋度。在溫育抗體和單體肽一小時後，將抗體/肽溶液添加到微量滴定孔中並進行標準的比色ELISA。通過繪製每個孔的比色讀數的散點圖來測定減弱aPL抗體與四價肽的結合的每個單體肽的濃度。50％的抑制點用來測量單體肽的結合的相對強度。
這一測定方法的一個變化是利用塗布有人類β2-糖蛋白Ⅰ/心磷脂(β2-GPI/CL)(而不是四價肽)的微量滴定板，並檢驗單體肽封阻aPL抗體與在β2-GPICL上的表位的結合的能力。在這種測定中，在最適濃度下的IgG耗盡的人類血清用作β2-GPI的來源。用類似於利用四價肽作為平板底物的測定法，將若干濃度的單體肽與最適濃度的aPL抗體一起溫育。在aPL/肽於(β2-GPI/CL)平板上溫育後，在四價測定的半最大吸收率處確定抗體結合和50％抑制所需的肽濃度。
這一測定的另一個變化檢驗單體肽封阻aPL抗體與β2-GPI(直接塗布在Nunc Maxisorp微量滴定平板的孔上的)的結合的能力。在這一變化中，省略心磷脂的利用而代之以魚明膠，所利用的稀釋劑和封阻劑是無脂牛奶/Tween。
(ⅷ)螢光極化肽結合測定這一測定檢測到肽與aPL抗體的直接結合。由於aPL抗體結合到β2-GPI(抗原)上，因此ELISA競爭性抑制測定能夠顯示由於結合到β2-GPI上而致的抑制作用以及由於肽結合到aPL抗體上而致的抑制作用。因為需要與抗體的結合以便起作為耐受原的作用，因此重要的是確立肽能夠直接結合到aPL抗體上。這一測定用來測量結合到兩種aPL抗體(ACA-6501和ACA-6701)上的肽的解離常數。而ELISA測定對於高流通量篩選來說是有用的，因為它需要比螢光極化測定少的抗體，然而，ELISA陽性的肽應該由螢光極化測定來進一步評價以確定它們是否能直接與aPL抗體結合。
(ⅸ)以取代和缺失合成來評價胺基酸對結合的貢獻耐受誘導所需表位應該儘可能與許多aPL抗體有強的相互作用並且不包含任何不必要的殘基。為了推導一個表位的最小構造，製造了每種肽的類似物；該類似物(ⅰ)缺乏所給定的殘基，例如缺失在羧基和/或氨基末端的構架殘基，或者(ⅱ)其中的胺基酸的取代已進行而又不同於在表位文庫篩選中發現的序列。這些胺基酸取代可以是天然的，例如異亮氨酸取代亮氨酸，或者非天然的，例如α-甲基脯氨酸取代脯氨酸。然後由肽競爭ELISA測定這些缺失和/或取代的效果。
(ⅹ)通過β2-GPI第5域的誘變來分組aPL血清特異性作為一般有效的耐受原，它必須結合在大多數患者中的aPL抗體的主要部分上。重要的是確定來自不同的患者的幾個抗體是否結合β2-GPI(其他人已提出其含有靶表位)的84個胺基酸第5域內的相同殘基。如果幾個抗體結合相同殘基，則可以構建來源於肽結構數據中的單個模擬表位，它將與所有抗體進行反應。在另一方面，如果抗體結合不同的殘基，則每個抗體需要單一耐受原。進行定點誘變來鑑別aPL抗體結合中所涉及的關鍵殘基是否存在於β2-GPI的第5域中。測定所產生的突變體β2-GPI與幾個aPL抗體的反應性。結果是不確定的。包含β2-GPI的第5域和穀胱甘肽S轉移酶(GST)的融合蛋白質得自A.Steinkasserer，並在大腸桿菌中表達(Steinkasserer等(1992),FEBS Lett.313:193-197)。這一融合蛋白成功地取代了在ACA ELISA中的天然β2-GPI。用標準的定點誘變來進行胺基酸的取代。I．合成的aPL表位的分離來自具有151 GPL得分(高滴度)並有周期性中風、流產、狼瘡、和三大血管瓣替代的歷史的患者的抗體ACA-6501在心磷脂脂質體上進行免疫親和純化。利用xy、xyz、xy』z和特殊的pro/cys結合的7-mer文庫(其中基於以前的篩選，將精氨酸固定在第七個位置)，該抗體用於四個分開的噬菌體文庫篩選。如表1所示，在(從140個試驗中)微量淘選的噬菌體中得到36種序列。這些序列顯得十分同源，並且在位置6和7的保守DR殘基是非常明顯的。共有的序列是CLLLAPDRC。儘管有這樣的同源性，但只有7個噬菌體(見表2)在噬菌體ELISA比色檢驗之後為陽性。用親和純化的ACA-6626(來自有高的但比ACA-6501的低的滴度的病人)篩選xy』z噬菌體產生五種為噬菌體ELISA所試驗的單一序列。沒有一種序列是顯色陽性的，但是當用化學發光底物進行ELISA免疫綴合時，兩種序列是陽性的。與ACA-6626聯繫的序列基序似乎是相互聯繫的但是不同於用ACA-6501所看到的序列基序(見表3)。兩個抗體優選在開放的前結合序列上的Cys結合的(可能是環化的和受約束的)表位。
表1ACA-6501噬菌體文庫序列克隆序列克隆序列xy文庫2101CNILVLDRCxyz文庫5AI2 CLILAPDRC3C10 CILLAKNRC2D7CLLLAPDRC3C5CIVLVPDRC3B6CLVLALDRC2F4CLVIALDRC3E4CLFVALDRC5B1CWFRSQSSC3E7CILLAHDRC3E1I CSPILRGNC2H1CIILAPGRC3E8CHKFFWLTCxy』z文庫2A10 CTILAPDRC2D12 CLVLAADRC2G12 CLLITPDRC3B10 CLLLAPDRC2G11 CLLITHDRC3F2CFFHFDHSC2F10 CNILVLDRC2D3CPLHTHHTC2E3CPLITHDRC常規(X)6R文庫G11CTILTPDRC1A4CNLLALDRC2H5CTILTPDRC2H6CNLLAIDRC2H2CTILTLDRC1C3CLLLAIDRC2H10CTLLTPDRC1D10 CTIITQDRC2E10CIQLTPDRC2H4CNIITRDRC1B7CHLLTPDRC2G12 CILHAAHRC2H1CLILTPDRC1A9CSSKSYWRC2H12CSILAPDRCxy』z文庫，菌落印跡篩選測定CB2CILLARDRC表2ACA-6501比色ELISA陽性的噬菌體克隆 序列克隆序列5A12CLILAPDRC 3B6CLVLALDRC2H1 CLILTPDRC 2G11CTILTPDRC3B10CLLLAPDRC*3E7CILLAHDRC2H2 CTILTLDRC*對應於共有或平均序列表3ACA-6626 xy』z噬菌體文庫序列克隆 序列 克隆序列4B11CGNAADARC4G7CTNLTDSRC4D3 CTNWADPRC4A2CGNPTDVRC4C7 CGNLADPRC按照本文描述的方法，ACA-6644是用來篩選混合的p-Ⅲ噬菌體文庫的另一個高滴定的aPL抗體。發現以下序列；ACA-6644/CBeGILLNEFAACA-6644/CBdGILTIDNLACA-6644/CBfGILALDYV這些序列都來自組分「z」表位文庫，其在N-末端缺乏噬菌體構架殘基。當合成為肽時，這些序列與幾種ACA血清(包括ACA-6644和ACA-6501)發生免疫反應。分析揭示這些序列與以前用ACA-6501獲得的序列有出乎意料的同源性，如表4所示。表4ACA-6644/CBd GILTIDNLACA-6501/2H2 CTILTLDRCACA-6644/CBf GILALDYVACA-6501/2F10CNILVLDRCACA-6644/CBcGILLNEFAACA-6501/1D10 CTILTODRC來源於由這兩種aPL抗體篩選的兩個十分不同的源文庫的趨同序列的同源性表明這些序列可以模仿天然靶抗原中的主要區域(可能是優勢免疫的)。
用ACA-6701對P-Ⅲ文庫的篩選產生出有高度的內部同源性的兩種單一序列，但是不同於以前以其它aPL抗體獲得的其它序列。序列如下所示ACA-6701/3B1LSDPGYVRNIFHACA-6701/3E1LTDPRYTRDISNFTD作為樹脂結合肽類，該序列與親本血清(ACA-6701)有強免疫反應性，但是與其它aPL抗體有最小的交叉反應性。
用親和純化的ACA抗體對隨機的pⅢ噬菌體文庫進行繼續篩選，結果發現一種肽，該肽顯示出與抗最初試驗的肽的所有九種親和純化的ACA抗體有明顯的交叉反應性。這種肽和其它四種肽的性能顯示在表5中。所有五種肽的肽序列緊接著列在該表之後。利用本文所述的CL/β2-GPI平板利用競爭結合肽ACA ELISA來檢驗所有肽。表5肽單體對AffACA的抑制百分率肽 6626 6638 6641 6644 6701 7004 7005 6903 6501Ave.6641/3G3 100 10093 100 100 100 9510086971mg/mL6501/3B10 768752555187476960651mg/mL6626/4C7889645456999547739681mg/mL6701/3B1436543379672235141521mg/mL6644/CBf37602818225457433739200μg/mL肽 序列ACA-6641/3G3AGPCLGVLGKLCPGACA-6501/3B10 AGPCLLLAPDRCPGACA-6626/4C7AGPDNIADPRCPGACA-6701/3B1AGPLSDPGYVRNIFHPGACA-6644/CBfGILALDYVGG爾後的檢驗測得這種肽(具有AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP 688)序列的ACA-6641/3G3)是與一些ACA抗血清交叉反應的。通過截短、系統性胺基酸取代以及非二硫化物環化研究進行這種肽的化學優化。
從隨機噬菌體文庫篩選中選擇的幾個肽的基序如下所列。表6ACA抗體 噬菌體插入序列6501CLLLAPDRC(3B10)6626CTNWADPRC6641CLGVLGKLC(3G3)6644GILALDYV6701LTDPRYTRDISNFTD6707CAHPDWDRCJ．aPL有關的肽與親和純化的IgG aPL抗體的免疫反應性在最近開發的用於組合合成肽文庫的固相支持體上合成噬菌體序列(用親和純化的ACA-6501獲得的並發現呈噬菌體ELISA陽性的)。這種支持體是一種Rapp樹脂，有高的肽密度並在第一個胺基酸偶聯前使用親水聚乙二醇間隔區。該合成產生樹脂結合的肽，該肽十分適合用於抗體結合研究。如圖2所示，肽5A12(序列CLILAPDRC)明顯地優於一種無關的對照肽，但不顯著地結合正常的IgG。測驗其它的噬菌體ELISA陽性肽類獲得了類似結果。在實驗中顯示，通過免疫結合顯色反應檢測到樹脂肽結合的親和純化的aPL抗體。K.aPL血清抗體與合成肽的反應性利用血清可使樹脂結合肽類免疫專一地結合aPL的發現顯著提高了測驗aPL抗體的能力。如圖3所示，來自用ACA-6626篩選的肽結合aPL抗血清但沒有顯示出與正常血清的顯著結合。圖3也說明了ACA-6501-5A12肽與aPL血清的免疫專一結合行為。在數據中是零的正常血清與肽5A12的結合沒有顯示。L．合成肽與不是文庫篩選抗體來源的aPL抗血清的交叉反應性選擇兩個肽用於aPL血清測定，一個(5A12)代表ACA-6501篩選而另一個(4D3)代表ACA-6626篩選。如圖4和5中所示，其中的每個肽都與篩選抗體的親本血清優先作出反應。然而，特別是在ACA-6501和ACA-6626之間可檢測到明顯程度的交叉反應性。用5A12樹脂結合肽對19個患者血清(低或沒有GPL得分)和13個病理血清(GPL得分從中到高)的研究表明13個病理樣品中的8個有可檢測到的肽結合而19個對照樣品中只有2個顯出低的肽結合。這些結果證明在中風病人護理方面合成肽對診斷或者預診的測定來說是有用的。
如在上述第一部分指明的，對一個合成肽(6641/3G3)進行抗幾種高滴度的ACA抗血清的試驗。發現這種肽似乎與所測驗的大多數ACA抗血清有交叉反應(如圖14中所說明的)。在1.8mg/mL完全抑制(＞80％)下6641/3G3顯示出與10種ACA抗體之10種的劑量依賴性交叉反應性，並且似乎對ACA抗體是專一的，如下表7所示。表7利用心磷脂/β2-GPI塗布的平板的AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP 688)ACA血清的交叉反應性數據ACA血清Nr IC50,mg/mL，對於肽LJP688[1]6501RS,RFL0.899 1.1[2]6626RS1.09[3]6635RS1[4]6638RS0.81[5]6641RS0.89,0.51[6]6644RS0.76[7]6701RS1.07[8]6903RS0.8[9]7004RFL 0.67[10]7005RFL 0.75平均數±標準差 0.86±0.16RS=周期性中風RFL=習慣性流產M．新的合成肽方法經aPL文庫篩選的新的侯選序列的鑑別需要試驗新的合成肽的抗體結合作用。對於已知肽取代的Rapp樹脂，利用放射性標記的aPL IgG可以實行定量的結合研究(如飽和結合分析和平衡測量)。
肽合成使得可以通過選擇性合成對模擬表位進行分子詳細分析。這包括以增強抗體結合為目標來修飾沿鏈的每個胺基酸。選擇性合成揭示每個胺基酸在序列中的相對重要性。如果必要，可以設計在特殊殘基位置的選擇性的取代以便保持B細胞反應性而廢除在T細胞測定中發現的任何T細胞增殖反應性。
對肽6641/3G3(LJP)進行一些分析。分析包括在N-末端和C-末端截短，二硫化物取代，丙氨酸和甘氨酸對位置2到8的胺基酸的取代，在2、4、5和8位置上的分支脂族胺基酸的取代，影響肽的構象的胺基酸的取代(包括α-甲基胺基酸的取代)，位置7中的鹼性胺基酸的取代，位置2至9中的D-胺基酸的取代，以及在1至9位置上的N-α-甲基胺基酸的取代。這些結果如表9所示。這些取代和平截的結構/活性關係如表8所示。
表8肽3G3的優化3/28/96總肽 144位置號截短分析 -2-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A B 用ACA 6501150μgmL sd1 A G P C L G V L G K L C P G 8502 G P C L G V L G K L C P G 1803 P C L G V L G K L C P G 4204 C L G V L G K L C P G 4605 A G P C L G V L G K L C G4506 C L G V L G K L C 10 #906(LJP 690)二硫化物替代1 C L G V L G K L C 110 #952=1002 H L G V L G K L C 463 C L G V L G K L H 924 H L G V L G K L H 80丙氨酸掃描1 C A G V L G K L C 200 #952=802 C L A V L G K L C 1703 C L G A L G K L C 2604 C L G V A G K L C inf5 C L G V L A K L C 406 C L G V L G A L C inf7 C L G V L G K A C 360甘氨酸掃描1 C G G V L G K L C 310 #952=1202 C L G G L G K L C inf3 C L G V G G K L C inf4 C L G V L G G L C inf5 C L G V L G K G C 500序列優化 支鏈脂族胺基酸1CI GVL GKLC60#910=402CV GVL GKLC1303CM GVL GKLC4CCyGVL GKLC5CFLGVL GKLC6CmLGVL GKLC7CIvGVL GKLC8CL GLL GKLC9CL GIL GKLC10 CLG ML GKLC11 CLG Cy L GKLC12 CLG tL L GKLC13 CLG mL L GKLC14 CLG lv L GKLC15 CLG VI GKLC16 CLG VV GKLC17 CLG VM GKL18 CLG VCyGKLC19 CLG VtLGKLC20 CLG VmLGKLC21 CLG VIvGKLC22 CLG VL GKIC23 CLG VL GKVC24 CLG VL GKMC25 CLG VL GKCC26 CLG VL GKtL C27 CLG VL GKmL C28 CLG VL GKlv C構象掃描胺基酸1CLPvLGKLC2CL mPVLGKLC3CL mAVLGKLC4CL cGVLGKLC5CLGVLPKLC6CLGVL mPKLC7CLGVL mAKLC8CLGVL cGKLC9CL dAVLGKLC10CLGVL dAKLC11CPGVLGKLC160#952=10012CLPVLGKLC340(掃描)13CLGPLGKLC18014CLGVPGKLCinf15CLGVLPKLC35016CLGVLGPLC16017CLGVLGKPC55018C pGGVLGKLC130#910=4019CL PGVLGkLC7020CLG pGLGKLC7021CLGV pGGKLC3522CLGVL pGKLC30 #910=523CLGVLG pGLC23024CLGVLGk pGC80αMe AA25C aiBGvLGKLC370#910=4026CL aiBVLGkLC8027CLG aiBLGKLC11028CLGV aiBGKLCinf29CLGVL aiB KLC11030CLGVLG aiBLC46031CLGVLGK aiBC＞470鹼性胺基酸1CLGVLGRLC160#952-1202CLGVLG OrLC40 910=603CLGVLG mKLC
D-胺基酸(小寫字母d)1 dP CLGVLGKLC120#952=1002C dLGVLGKLC180#952=303CLG dVLGKLC260#952=304CLGV dLGKLC230#952-305CLGVLG dKLC170#952=506CLGVLGK dLC140#952= 307C dLG dVLGKLC8C dVG dVLGkLC9C dLG dLLGKLC10CLG dV dLGKLC50#952=3011CLG dL dVGKLC12CLG dV dVGKLC13CLG dL dLGKLC14CLGV dLG dKLC15CLGV dKG dLLC16CLGV cLG dLLC17CLGV dKG dKLC18CLGVLG dK dLC150#952=5019CLGVLG dL dKC20CLGVLG dK dKC21CLGVLG dL dLC140#952=3022CLGVL dAKLC140#952=50CLGVLGKL dCN-Me胺基酸(nAA)1 nCLGVLGKLC2CLGVLGKLC3CL nGVLGKLC 70 #952=504CLG nVLGKLC 2205CLGV nLGKLC 1806CLGVL nGKLC 5507CFGVLG nKLC8CLGVLGK nLC 240 #952=509CLGVLGKL nC其它1 C L G V L G K L CATU-Y300#952=502 Y ATUC L G V L G K L C 1703 C L G V L G K L C TGR樹脂 5004 C L G V L G K L C dCTGR樹脂 6205 dC L G V L G K L C C6 cC L G V L G K L C dCTGR樹脂硫醚單一檢測1 Hc L G V L A K L C2 Hc G V L A K L C3 Hc L V L A K L C4 Hc L G L A K L C5 Hc L G V A K L C6 Hc L G V L K L C7 Hc L G V L A L C8 Hc L G V L A K C收縮最小化1 Hc V L A K L C2 Hc L A K L C3 Hc L A K C支鏈的1 Hc L G V L G K L Pc2 Hc L G V L G K L dPe3 Pc L G V L G K L Hc4 dPe L G V L G K L Hc5 dPe L G V L G K L dPeD胺基酸1 dHc L G V L G K L C2 dHc L G V L G K L dC3 Hc L G V L G K L dC脫氨基1 By L G V L G K L Hc脫氨基HHTE2 By L G V L G K L C脫氨基HCTE3 Pp L G V L G K L Hc脫氨基CHTE4 Pp L G V L G K L C脫氨基CHTE
表9交叉反應的ACA表位的結構/活性關係結構 相對活性AGPCLGVLGKLCPG(3G3)(LJP 688)100CLGVLGKLC (LJP 690)3.5CLGVLAKLC 1.8CLGVLpGKLC 1.4CLGdVdLGKLC 5.9HCLGVLGKLC(硫醚)1.6SLGVLGKLS 00CLGVAGKLC 00CLGVLGALC 00N．利用α-甲基胺基酸取代和非天然的胺基酸來提高肽的免疫反應性並賦與其抗蛋白酶攻擊的抗性脯氨酸殘基有一種特殊的重要性，這是因為它們對多肽的鏈構象的影響。它們經常出現在球狀蛋白的表面上的轉角處。在本發明的噬菌體表位文庫中，所有隨機肽插入片段側連邊界脯氨酸。此外，用ACA-6501發現的大多數模擬表位有第三個脯氨酸，根據基於計算機的預測，該脯氨酸很有可能作為β-轉角的一部分存在。β-轉角模擬物能用來提高小肽中的轉角構象的穩定性。這樣的模擬物是(S)-α-甲基脯氨酸(α-MePro)，這是一種除穩定轉角構象外還賦予抗蛋白酶降解的抗性的脯氨酸類似物。對於所設計的在血漿中起作用的潛在藥物，蛋白酶抗性是一種所需的性質。肽ACA-6501/3B10 AGPCLLLAPDRCPG(斜體部分為插入片段)是一種共有肽。基於與其他35個同源序列的比較，它具有的序列特性是在每個位置有最有優勢的殘基。由於其代表性特徵，可對該序列進行一些系統的修飾和缺失，而後通過aPL抗體結合來評價它的活性。最重要的發現之一是發現在3和9位置上的脯氨酸對於活性來說是重要的。脯氨酸-3來自噬菌體構架而不是隨機插入片段的一部分。最明顯的影響是通過由α-MePro在9位置取代脯氨酸來獲得的。這個取代導致在免疫活性方面提高6倍。
在肽6641/3G3上進行的α-甲基和Nα-甲基胺基酸的取代的研究結果如上表8所示。
除二十種天然存在的胺基酸以及它們的同源類似物(homoanalog)和正類似物(noranalog)之外，其它幾類α-胺基酸也可以用於本發明。這些其它類α-胺基酸的例子包括d-胺基酸、Nα-烷基胺基酸、α-烷基胺基酸、環胺基酸、嵌合胺基酸以及混雜的胺基酸。這些非天然的胺基酸已經廣泛地用來修飾生物活性的多肽以提高抗蛋白酶解降解作用的抗性和/或傳遞構象限制以改善生物活性(Hruby等，(1990)，生物化學雜誌，268:249-262；Hruby和Bonner(1995)在分子生物學中的方法，35:201-240)。
最普通的Nα-烷基胺基酸是Nα-甲基胺基酸，如Nα-甲基半胱氨酸(nC)、Nα-甲基甘氨酸(nG)、Nα-甲基亮氨酸(nL)、Nα-甲基賴氨酸(nK)以及Nα-甲基纈氨酸(nV)。α-烷基胺基酸的例子包括α-甲基丙氨酸(niA)、α-氨基異丁酸(aiB)、α-甲基脯氨酸(mP)、α-甲基亮氨酸(mL)、α-甲基纈氨酸(mV)、α-甲基α-氨基丁酸(tv)、二乙基甘氨酸(deG)、二苯基甘氨酸(dpG)以及二環己基甘氨酸(dcG)(Balararn(1992)，純化學和應用化學，64:1061-1066；Toniolo等(1993)，生物聚合物，33:1061-1072；Hinds等(1991),Med Chem.34:1777-1789)。
環胺基酸的例子包括1-氨基-1-環丙烷羧酸(cG)、1-氨基-1-環戊烷羧酸(Ac5 c)、1-氨基-1-環己烷羧酸(Ac6c)、氨基茚滿羧酸(ind)、四氫異喹啉羧酸(Tic)以及2-哌啶酸(Pip)(C.Toniolo(1990)Int』l.J.Peptide Protein Res.35:287-300；Burgess等(1995)J.Am.Chem.Soc.117:3808-3819)。嵌合的胺基酸的例子包括青黴胺(Pc)、半胱氨酸與纈氨酸的混合物、4R-和4S-巰基脯氨酸(Mpt)、高胱氨酸和脯氨酸以及4R-和4S-羥基脯氨酸(hyP)的混合物、以及高絲氨酸和脯氨酸的混合物。混雜的α胺基酸的例子包括如鳥氨酸(Or)、Nε-甲基賴氨酸(mK)、4-吡啶基丙氨酸(pyA)、4-哌啶子基丙氨酸(piA)以及4-氨基苯基丙氨酸的鹼性胺基酸類似物；如瓜氨酸(Cit)以及3-羥基纈氨酸的酸性胺基酸類似物；如1-萘基丙氨酸(1-Nal)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、苯基甘氨酸(pG)、3,3-二苯基丙氨酸(dpA)、3-(2-噻吩基)丙氨酸(TE)以及滷苯基丙氨酸(例如2-氟苯丙氨酸和4-氯苯丙氨酸)的芳香族胺基酸類似物；如叔丁基甘氨酸(即叔亮氨酸(tL))、2-氨基丁酸(Abu)、環己基丙氨酸(Cy)、4-四氫吡喃基丙氨酸(tpA)、3,3-二環己基丙氨酸(dcA)以及3.4-脫氫脯氨酸的疏水胺基酸類似物。
除了α-胺基酸，其它如β-胺基酸也可用於本發明。這些其它胺基酸的例子包括2-氨基苯甲酸(Abz)、β-氨基丙酸(β-Apr)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)以及6-氨基己酸(ε-Ahx)。在環硫醚肽的合成中，如4-氯丁酸(By)和3-氯丙酸(Pp)的羧酸也已用作為在N-末端上的第一個殘基。O．環硫醚類似物的製備可以進一步修飾由本發明方法鑑別的模擬肽從而使其包含硫醚取代物。環二硫化物類似物變為環硫醚類似物的修飾將延長該類似物綴合物的血漿半壽期，因此需要低劑量。環硫醚類似物也消除了二硫鍵交換的問題，這種交換經常隨環二硫化物多肽發生。此外，環硫醚類似物也可以幹擾MHCⅡ類向T細胞的呈遞，因此有利於無反應性的誘導。最後，環硫醚類似物在用於產生效價平臺分子綴合物的硫醇依賴性綴合反應方面是有用的。
按照在共有的共同未決的專利申請(代理號252312006600)(以其整體與本文一併參考)中描述的方法，製得四種環硫醚類似物。利用RinkTM醯胺4-甲基二苯甲氨基樹脂或者MBHA樹脂製備6641/3G3的全長度肽類似物，將其轉化成氯肽，並從固相支持體上切割下來，然後環化該類似物。參見以下的硫醚反應方案。適合的環硫醚類似物包括以下顯示的類似物。

另外，也可按照以下反應方案製備硫醚類似物。
環硫醚反應方案2
下列類似物表示按照環硫醚反應方案2製得的類似物。
測定例證性的環硫醚類似物抗ACA抗體ACA-6501和ACA-6701的活性。結果如下表10所示。表10IC50值(μg/0.1 mL)硫醚 ACA-6501 ACA-6701CCTE,LJP 698 11.05.0HCTE,LJP 6994.63.0CHTE,LJP 7029.23.2HHTE,LJP 7038.03.6LJP 69010.04.0CTE A 0.08CTE B 0.5CTE C 0.9CTE D 3.2CTE E 6.3HCTE類似物LJP 699，優於參考肽LJP 690,LJP 690是LJP 688(即AGPCLGVLGKLCPG)的截短形式，即CLGVLGKLC。
本文引用的所有文章、文檔、專利和專利申請以其整體與本文一併參考。下列實施例旨在進一步說明本發明和它的獨特性。這些實施例無意以任何方式限制本發明的範圍。實施例實施例1:血清6501中的抗心磷脂抗體(ACA)的測定以每孔30μL乙醇用50μg心磷脂(西格馬化學公司，聖路易斯，MO)塗布Immulon I微量滴定板(Dynatech實驗室，Inc.,Chantilly,VA)的偶數孔。使平板在4℃下乾燥一夜，並在室溫(RT)下在磷酸鹽緩衝鹽水(ABS/PBS)中用200μL 10％的成年牛血清(ABS)(Irvine科學公司，SantaAna,CA)封阻2小時。在加入10μL aPL標準和試驗血清ACA-6501之前，用Tris-緩衝鹽水(TBS)將平板洗滌5次。按照製造廠商的說明重建該aPL標準(APL診斷公司，Louisville,KY)，並用10％ABS-PBS將其稀釋至1∶50。將試驗血清ACA-6501用10％的ABS-PBS稀釋成連續稀釋液(從1∶50到1∶2,000)，將其加到選擇的重複孔中並在室溫下溫育2小時。將平板用TBS和100μL的1∶1,000的山羊抗人IgG/鹼性磷酸酶綴合物(Zymed，南舊金山，CA，目錄號62,8422)洗滌5次，加入10％ABS-PBS並在室溫下溫育1小時。將平板用TBS再洗滌5次並通過添加100μL酚酞脫單磷酸(PPMP)底物溶液(西格馬，目錄號P-5758)進行測定，該溶液是從0.13M PPMP和7.8M 2-氨基-2-甲基-1-丙醇的儲備溶液製備的(在用去離子水稀釋到1∶26之後，用HCl將其pH值調到10.15)。在大約30分鐘之後，在每孔中加入50μL的0.2 M磷酸二鈉(Mallinckrodt，分析試劑)來終止反應。在微量平板自動讀數儀(Bio-Tek儀器，Winooski,VT,EL311型)中在550 nm處讀其光密度。從偶數孔的光密度中減去奇數對照孔(空白，沒有心磷脂(CL))的光密度。用Graph Pad Prizm軟體(graph Pad軟體公司，聖地牙哥，CA)將aPL標準的吸收率讀數製成散點圖從而形成GPL(IgG磷脂)標準曲線。依據GPL標準曲線用稀釋的6501試驗血清吸收率讀數來計算GPL得分。
在改進的ACA ELISA中，Nunc Maxisorp微量滴定平板在室溫下溫育1小時後塗布100μL/mL β2-GPI(用PBS製得)。接著這一步驟，在室溫下用PBS(包含2％無脂牛奶和0.4％(w/v)Tween 80)封阻微量平板2小時。除了利用無脂牛奶/Tween作為稀釋劑和封阻劑外，直接塗布有β2-GPI的Nunc微量平板可用於ACA IgG結合研究，如以前描述的Dynatech微量平板(在β2-GPI加入之前首先在其上塗布一層心磷脂)的ACA IgG結合研究。實施例2來自血清6501的抗心磷脂抗體(ACA)純化在25 ml圓底燒瓶(Kontes Scientific Co.,Vineland,N.J.)中，用Rotavap(Buchi，瑞士)將1.2ml抗心磷脂(西格瑪化學公司，聖路易斯，MO,#C-1649),0.464ml膽固醇(西格瑪Diag.，聖路易斯，MO.,#965-25),0.088ml 5mg三十二烷基磷酸酯(西格瑪化學公司，聖路易斯，MO,D-2631)(在每mL氯仿中)的混合物乾燥約5分鐘。在除去溶劑後，添加2ml 0.96％(wt./vol.)的NaCl(J.T.Baker,Inc..Phillipsburg,NJ,Baker分析試劑)，並在Vortex Genie Mixer(科學工業，公司，Bohemia,NY)中混合1分鐘。於37℃下將脂質體懸液溫育1小時。同時，於8℃下在Sorvall RT 6000離心機(杜邦公司Wilmington,DE)中在600Xg下離心血清6501 10分鐘。將4ml上清液置於含有1ml製備的脂質體懸液的25ml圓底燒瓶中，於4℃下在中等速度攪拌下在有軌搖床TektatorV(Scientific Products，McGraw Park,IL)上溫育混合物48小時，在37℃溫育另外的2小時。加入20 ml冷的TBS，將混合物轉移到50ml聚碳酸酯離心管(Nalge Co.,Rochester,NY)中，於4℃下在27,000Xg下離心15分鐘(在SS-34迴轉裝置中的RC3離心機(Sorvall-DupontWilmington,DE)中)。用RC3離心機以25ml冷的0.96％NaCl洗滌沉澱3次。將沉澱溶解在1ml 2％(wt/vol)(在TBS中)的正-辛基-對-D-葡糖吡喃糖苷(Calbiochem,La Jolla,CA)的溶液中，並用於0.6ml蛋白質A/交聯瓊脂糖(Repligen公司，Cambridge,MA)柱，該柱已以15倍柱床體積的1M乙酸預洗滌過，並用15倍柱床體積的TBS平衡過。用40倍柱床體積的2％辛基葡糖吡喃糖苷洗滌抗體-蛋白質A/瓊脂糖柱，以除去脂質，接著用TBS充分洗滌，直到洗脫物在280nm的光密度接近基線。結合的抗體用1M乙酸洗脫。收集1ml組分，每一組分立即用0.34ml 3M Tris(Bio-Rad，電泳級試劑)中和，並保持在冰浴上。在分光光度計(Hewlett-Packard,8452A Diode Array分光光度計，Palo Alto,CA)中在280nm處測定各組分的光密度。合併含有抗體的組分，按製造者的方案在Centricon-30濃縮器(Amicon Division,W.R.Grace Co.,Beverly,MA)中濃縮和用TBS洗滌4次。通過讀取濃縮試樣在280nm的光密度確定從4ml血清6501產生純化的抗體的最終產率，其中1mg=1.34 OD280。所獲得的平均產率是從4ml血清6501中得到750μg抗體。試驗純化的抗體的ACA活性，並由Laemmli SDS-PAGE檢查其純度。利用市售的純化的β2-GPI(Perimmune,Rockville,MD)，按照製造廠商的說明，利用CNBr活化的瓊脂糖(Pharmacia,Inc.,Piscataway,NJ)或者Affi-Gel10(BioRad,Richmond,CA)，製備包含β2-GPI的親和性吸附劑。在包含β2-GPI親和性吸附劑的1mL凝膠柱中，加入高達100μg的脂質體純化的aPL IgG(在1mL TBS中)。在1小時之後，用緩衝液廣泛地洗滌柱以便置換汙染物和不結合β2-GPI的任何IgG。用1M HOAc置換結合β2-GPI的IgG，並用Tris(如上所述)中和該組分。集中、濃縮包含IgG的組分，並使之進行如前所述的緩衝交換。實施例3:P-Ⅲ文庫載體製劑的構建fUSE 5(Scott,J.K.和G.Smith，同上)用作構建p-Ⅲ文庫的載體，利用Holmes,D.S.和M.Quigley(1981)(Anal.Biochem.144:193)的方法的修改方法來產生雙鏈複製型(RF)。簡言之，在劇烈振蕩下，於37℃下在含有20毫克/mL四環素的2YT培養基(Difco Labs,Ann Arbor,MI)中培養大腸桿菌K802(包含fUSE5)的800ml培養物18小時。通過離心來收集細胞，並將其重懸浮於75ml STET中。STET由在50mM Tris/HClpH8.0中的8％蔗糖、50mM EDTA組成，並含有0.5％Triton X-100。加入10mg/mL溶菌酶(在STET中)至最終濃度為1mg/mL。在室溫下在5分鐘後，將三個等分試樣置於沸水浴(偶爾振蕩)中3.5分鐘。在18000Xg下離心粘性漿狀物30分鐘，將等體積的異丙醇添加到上清液中。將溶液冷卻至-20℃，通過離心收集核酸。按照Sambrook等(分子克隆；實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY，第二版，1989)描述的方法由CsC1梯度分離RF。隨機插入片段的按比例分配由Cwirla等(1990，美國國家科學院院報，87:6378-6382)描述的＂缺口雙螺旋＂法產生用於插入的DNA。在這一方法中，中間含有簡併區的寡核苷酸被寡核苷酸每一端的短的恆定區所包圍。使兩個較短的互補的寡核苷酸退火以形成＂缺口雙螺旋＂，該＂缺口雙螺旋＂具有互補於由用於消化載體的限制性內切核酸酶產生的粘性末端的突出端。在這種情況下，較長的簡併寡核苷酸具有序列5』GGGCTGGACCC(NNK)xCCGGGGGCTGCTG 3』，其中N=A或C或G或T，K=G或T,x是隨機區中的密碼子數量。EpiGS2被設計成簡併寡核苷酸的5』末端的鹼基對，並具有序列5』GGGTCCAGCCCCGT 3′。類似地EpiGS3被設計成退火到簡併寡核苷酸的3』末端，並具有序列5』CAGCCCCCGG 3』。當正確退火時，三種寡核苷酸形成＂缺口雙螺旋＂，當其插入到用Sfil消化的fUSE 5中時，其恢復具有接近5』末端的隨機插入片段的p-Ⅲ讀框。
以上所描述的寡核苷酸是通過從聚丙烯醯胺凝膠上的切除來製備的。1納摩爾的EpiGS2、EpiGS3和50皮摩爾的簡併寡核苷酸分別在66微升體積中用激酶處理。然後集中三種寡核苷酸，添加NaCl至50 mM，並將混合物加熱至65℃並保持5分鐘，其後緩慢冷卻至室溫。將退火的寡核苷酸在冰上冷卻，並直接用於與fUSE 5的連接反應。連接反應物由10微克fUSE 5 DNA(用Sfil完全消化的)、30μL＂缺口雙螺旋＂溶液和1000 U的T4連接酶組成(在450微升總體積中)。於16℃下溫育連接物18小時。然後用苯酚-氯仿提取混合物，用乙醇沉澱，並將沉澱溶解在20μL水中。產生和擴增文庫經電穿孔(Dower等(1988)，核酸研究，16:6127-6145)將連接的DNA引入大腸桿菌中。將冷凍的電感受態MC1061細胞(0.1mL)在冷的2mm透明小容器中與連接的DNA(4μL)混合，用BTX電穿孔裝置(BTX公司，San Diego,CA)施加2.5kV、5.2 mS脈衝。緊接著脈衝之後，加入1 mL SOC(一種細胞生長培養基，參見Dower等，同上)。進行5種不同的電穿孔，收集產物並在37℃培養1小時。此時，移走樣品並稀釋以測定產生的克隆的總數。用包含20微克/毫升四環素的1升2YT(1.6％蛋白腖，140,1％酵母膏，和0.5％NaCl,Difco,Labs,Ann Arbor,MI)稀釋混合物的平衡溶液，並於37℃下在275 rpm振蕩下培養18小時。通過2次PEG/NaCl沉澱和在1.2mL TBS(包含0.02％疊氮化鈉)中懸浮來純化噬菌體。由在269nm的吸收率來估計顆粒數量。通過將10μL稀釋的噬菌體與10微升飢餓的大腸桿菌混合來測定噬菌體的滴度。實施例4篩選具有aPL抗體的P-Ⅲ文庫在矽氧烷化的1.4mL微量離心聚丙烯管中，於室溫下將親和純化的ACA-6501(affACA-6501,10μg；7μL 1.44mg/mL儲備溶液)溫育2小時，其中該微量離心聚丙烯管含有來源於x、y和z文庫(epiXYZ)[分別11μL+8.5μL+2μL；總體積=21.5μL,～1010個克隆]的集中的噬菌體以及有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的最終體積為100μL的TBS(pH 7.4)。在這一溫育期間，進行製備新鮮的飢餓大腸桿菌菌株K-91的最後步驟。用50mL聚丙烯管在1000Xg下於室溫下將在37℃下在250rpm振蕩下在2YT培養基中新鮮生長約5小時的大腸桿菌懸液離心10分鐘。將20 mL 80mMNaCl添加到緊密的大腸桿菌沉澱上，並在100rpm下於37℃下溫育45分鐘。在以上離心後，將飢餓的大腸桿菌沉澱懸浮在1mL 50mM磷酸銨/80mM NaCl中，而後用於噬菌體擴增。將蛋白質G-瓊脂糖珠用TBS/BSA洗滌2次，用TBS/0.5％Tween-20洗滌2次，並以在TBS/Tween中的50％懸液儲備在4℃下。
然後將200μL蛋白質G-瓊脂糖珠懸液添加到ACA-650l/噬菌體混合物中，在室溫下繼續溫育1小時。此時，急冷混合物，用冷的TBS/Tween洗滌3次，通過在冷的房間離心來收集沉澱。將洗滌過的珠轉移到新的用TBS/BSA和TBS/Tween預洗滌的離心管中，以阻止非特異性粘附。在用TBS/Tween額外洗滌3小時後，通過在室溫下攪動用300μL 0.2N HCl/甘氨酸、pH2.1洗脫具有噬菌體(攜帶結合的ACA-6501)的珠10分鐘。以16,000Xg離心後，收集酸性洗脫物上清液，將另外的100μL洗脫液添加到珠沉澱上，重複這一操作。10分鐘後，收集(～400μL)包含噬菌體的洗脫物(代表未擴增的第一輪噬菌體)，並將其置於無菌的17×100mm聚丙烯細胞培養管中，向該管中添加50μL 0.5M NaCl，接著用2.5M Tris鹼(通常～25-35μL)進行pH中和。立即加入等體積的飢餓的大腸桿菌懸液，然後在37℃下在100rpm下培養10分鐘。接著將混合物轉移至250mL無菌培養瓶(含有具有20μg/mL四環素(Tet)的25mL 2YT)中，在37℃下在250rpm下培養一夜。
為了分離從過夜培養物擴增的噬菌體，用聚碳酸酯試管在12,000×g下將懸浮液離心10分鐘。棄去沉澱。在70℃下加熱在聚丙烯管中的上清液30分鐘後，再次用聚碳酸酯管離心，保存上清液。向上清液中加入1/4體積的20％(w/v)分子量為8000(PEG 8000)的聚乙二醇，以沉澱噬菌體。通過倒轉100次來混合溶液，然後在4℃下溫育2小時。於40℃下在35,000Xg下離心30分鐘後，將含有噬菌體的沉澱重懸於～0.5mL TBS/BSA中，並轉移至1.4mL離心管中。在16,000xg下在微量離心機中離心1分鐘後，將上清液轉移至清潔的試管中，標記第一輪擴增的噬菌體。
在第二、三和四輪生物淘選期間，在100微升終體積中將三輪的75μL擴增的噬菌體與7μL affACA-6501一起溫育。對第五輪噬菌體，首先以1∶1000稀釋affACA-6501，然後如其它輪所述處理。如第一輪所述進行所有其它的後續步驟。將生物淘選第五輪的噬菌體點滴(spot-titered)在2YT/Tet平板上，以測定噬菌體濃度。點滴擴增的噬菌體需要利用TBS/BSA或2YT培養基的1×106初始的噬菌體稀釋度。對每一輪，在37℃下將10μL稀釋的噬菌體與40μL飢餓的大腸桿菌一起無振蕩培養10分鐘。在加入950μL2YT/稀釋的Tet(0.2μg/mL)後，於37℃下在250rpm振蕩下將混合物培養30-45分鐘。利用含有20μg/mL Tet的瓊脂板，將10μL純的和稀釋(1∶10,1∶100和1∶1000)的噬菌體溶液試樣點滴在2YT/稀釋Tet上。微量淘選用蛋白質G塗布Immulon 2型平板。用0.1M NaHCO3以10μg/mL製備蛋白質G，以每孔100μL添加到微量滴定板的孔中，於4℃下溫育一夜。在從平板棄去過量的蛋白質G溶液後，於室溫下在攪拌下在振動平臺上用250-300μL 2YT封阻每孔1小時。將Tris緩衝的鹽水(pH 7.4/0.5％Tween 20(TBS/Tween))與自動平板洗滌儀一起使用，以便用200μL洗滌每孔4次。用2YT將100μL affACA-6501(或對照的正常IgG)稀釋成2.5μg/mL，並將其添加到洗滌的孔中。在旋轉平臺上於室溫下溫育接近1小時後，把平板轉移至冷室迴轉裝置(rotator)中。
微量淘選所試驗的噬菌體得自由生物淘選產生的瓊脂板。用無菌牙籤將每個待試克隆轉移至圓底96孔微量滴定板(Corning,Corning,NY)的不同孔(每孔含有250μL 2YT/Tet)中，並在37℃下培養一夜。克隆的命名基於篩選的抗體，起始點的生物淘選輪次以及克隆在過夜培養板上的位置，例如ACA-6501/3B10指這樣一種克隆，其是在第三輪中通過ACA-6501從位於微量滴定板上的命名為B10的孔中分離得到的。在過夜培養後，利用微量滴定板夾持裝置於室溫下在1300Xg下離心噬菌體培養物10分鐘。上清液構成＂純的＂噬菌體的源。
起始微量淘選限制在6個克隆，這些克隆用以1∶10到1∶106的係數擴展的稀釋度來試驗。從這些試點克隆產生的結果用來說明合適的單一稀釋度(對各輪的源平板中的克隆其產生可分級的結果)。將代表培養的從生物淘選的第三、第四和第五輪隨機選擇的克隆的平板用2YT在微量滴定板中以每孔250μL的終體積從「純的」溶液稀釋成1∶100,000。將代表所需稀釋度的最後平板的100μL添加到含有蛋白質G結合的ACA-6501和如上所述製備的正常IgG的平板上。在水平的迴轉裝置上於4℃下進行稀釋噬菌體與aPL抗體或對照IgG的溫育。在自動平板洗滌儀中用TBS/Tween洗滌9次後，用20μL 0.2 N HCl-甘氨酸/0.1％BSA,pH2.2洗脫IgG-結合的噬菌體。在室溫下繼續溫育洗脫物10分鐘，在此期間，製備每孔含有20μL新鮮飢餓大腸桿菌的新的Corning微量滴定板，並冷卻。將140μL 29mM Tris添加到含有噬菌體洗脫物的平板上，以中和pH，接著將20μL噬菌體懸液從各孔轉移到含有飢餓的大腸桿菌的平板的相應的孔中。在37℃下培養10分鐘後，加入200μL 2YT/稀釋Tet，在37℃下進行另外的30分鐘培養。用多道吸移管將各孔的10μL培養液點滴在大的2YT/Tet瓊脂板上，而保留原來的8×12孔格式和最後微量滴定板的方向。在使斑點乾燥30分鐘後，將平板在37℃下溫育。第二天，用0到4+來半定量計分菌落，0表示＜10個菌落；+/-,10-20個；1+,20-50個；2+,50-70％鋪滿；3+,70-90％鋪滿；4+代表＞90％鋪滿菌落。在以1∶105稀釋度[代表81個第三輪、6個第四輪、7個第五輪克隆]來進行測定的94個克隆中，6個克隆具有0的微量淘選得分，3個得分為1+,14個得分為2+,62個得分為3+,9個得分為4+。通過如以下所描述的G-跟蹤DNA測序來進行得自代表生物淘選的第二到第五輪的平板的隨機克隆的測定。結果顯示第四輪生物淘選的序列差異明顯地下降(參見圖8)，因此，第二平板用1∶3×105稀釋度的噬菌體來微量淘選，此時包含較早(第二)輪的克隆。試驗總共94個克隆，包括在1×105稀釋度下具有高分的29個克隆[26個來源於第三輪，1個來源於第四輪，2個來源於第五輪]以及以前還沒有試驗的第二輪的65個克隆。在1∶3×105稀釋度下試驗的94個克隆中，26個得分為0,11個得分為+/-,10個得分為1+,13個得分為2+,34個得分為3+,0個得分為4+。G-跟蹤DNA測序從在37℃下過夜培養的培養物中分離得到單鏈病毒DNA。為了製備培養物，用來源於以前生長的微量滴定板培養物的擴散平板的單個噬菌體來接種2YT/Tet(以在試管中的2mL或者在微量滴定板圓底孔中的250μL)。按照Smith,G.P.和J.K.Scott(＂絲狀噬菌體上顯示的肽和蛋白質文庫＂(1993)，酶學方法，217:228-257)(有關試管中的培養物)描述的方法以及Haas,S.J.和G.P.Smith G.P.(＂從絲狀噬菌體快速測序DNA＂(1993)生物技術，15:422-431)(有關微量滴定板中的噬菌體)描述的方法，通過培養物上清液的20％PEG/2.5 M NaCl沉澱來進行純化噬菌體，以及通過苯酚-氯仿抽提或鹼變性來進行分離或釋放病毒粒子DNA。按照Smith和Scottt(同上)(有關試管培養物噬菌體DNA)描述的方法以及Haas和Smith(同上)(有關微量滴定板上噬菌體DNA)描述的方法，利用市售的測序試劑盒(U.S.Biochemical/Amersharn,Arlington Heights,IL)實施Sanger等(＂用鏈終止抑制劑的DNA測序＂(1970)，美國國家科學院院報，74:5463-5467)的雙脫氧核苷酸鏈終止DNA測序技術。通過僅利用ddCTP終止混合物，在7％聚丙烯醯胺/脲測序凝膠上電泳之後獲得G跟蹤或由單鹼基(G)給出的序列格式，並且為放射自顯影所顯示。而後進行標準的凝膠電泳和放射自顯影過程(Sambrook等，同上)。
G-跟蹤的76個克隆(來源於ACA-6501文庫篩選的、得自在噬菌體稀釋度1∶1×105下試驗的微篩選平板的)揭示出11個獨特的序列，而得自在噬菌體稀釋度1∶3×105下試驗的第二微篩選平板的64個克隆顯示出30個獨特的序列。將利用所有4個雙脫氧核苷酸三磷酸的常規DNA測序用於具有最高微量淘選得分和獨特的序列的噬菌體克隆，結果產生如表1所示的xyz文庫的12個序列。噬菌體俘獲ELISA將克隆ACA-6635/3A12、3B3、3C8、3A5、3C9和3B7以3mL培養物培養。將親和純化的ACA-6635在磷酸鹽緩衝鹽水(pH7.2)中稀釋到2.5μg/mL，向Immulon-2微量滴定板的孔中加入100μL。2小時後，在無振蕩的自動平板洗滌器中用TBS/Tween洗滌平板3次。然後在每孔中用溶解在PBS中的150μL 0.1％BSA(無球蛋白)封阻此平板。在4℃下放置1小時後，將此平板如上所述洗滌3次。以17,000×g將每一種噬菌體培養物離心3分鐘後，在0.1％BSA/PBS中以1∶10稀釋每一種上清液，並在塗上一層親和純化的ACA-6635的每個孔中加入100μL，在4℃下溫育2小時。然後如上所述用TBS/Tween洗滌平板。在0.1％BSA/PBS中以1∶5,000稀釋辣根過氧化物酶-綴合的綿羊IgG抗-M13噬菌體抗體(Pharmacia公司，Piscataway,NJ)，並向每個孔中加入100μL。在4℃下溫育1小時後，如上所述將此平板洗滌4次。將按照綴合物廠商的指導製備的100μL底物加入到每個孔中。19分鐘後，在自動微量平板吸收率讀數儀(Biotek,Winooski,VT)上測定每孔在405 nm處的吸收率。選擇來源於的ACA-6635噬菌體文庫篩選的試驗的7個克隆，這是因為它們的高微量淘選得分和陰性噬菌體ELISA得分(參見下文)。如圖9所示，所試驗的7個克隆中有3個(3A12、3B3和3A5)在噬菌體俘獲ELISA中顯示出很強的免疫專一性信號。噬菌體ELISA由上述以親和純化的ACA-6501在幾個噬菌體文庫篩選物中分離的35個克隆來製備3mL培養物，並以一個缺乏肽插入片段的fUSE 2噬菌體克隆作為對照。在以17,000×g離心3分鐘後，將100μL的各種噬菌體上清液(以吸收率為基礎調至-2×1011粒子/毫升)加入到微量滴定板的孔(Falcon,Becton-Dickinson Labware,Lincoln Park,NY)中，並在40℃下過夜溫育。用TBS7.4洗滌4次後，在室溫下用125μL的0.5％BSA/TBS將此平板封阻1小時。經TBS再洗滌4次後，將100μL原來在TBS/BSA中稀釋至2.5μg/mL的affACA-6501加入到每個孔中，在37℃下溫育1小時。再洗滌4次後，將在TBS/0.5％Tween中以1∶1000稀釋的100μL抗人IgG加入到每個孔中。在室溫下放置1小時後，加入酶底物，並溫育2小時。然後加入50μL 0.2M Na2HPO4以終止反應，在自動平板吸收率讀數儀上在550 nm處測量吸收率。如圖10所示，7個克隆在用ACA-6501的噬菌體ELISA中具有明顯的信號5A12、3B6、3E7、3B10(和2D7具有相同的序列)、2G11、2H1和2H2。這些克隆的序列如表2所示。肽-ELISA在標準方案中，用pH 9.5的碳酸鹽緩衝液將溶解在二甲基甲醯胺中的四體肽儲備溶液稀釋1000倍，即稀釋為10μg/mL。每孔塗布有100μL的稀釋肽的微量滴定板在40℃下放置一夜，然後用緩衝白蛋白封阻。在室溫下將塗布有肽的微量滴定板與不同稀釋濃度(以1∶50開始)的aPL血清一起溫育1-2小時。洗滌後，按照標準的ELISA方法使用酶-綴合的抗人IgG確定結合肽的人IgG的存在。競爭性結合肽-ELISA(A)除用作空白對照的3個孔外，在每個ImmulonⅡ平板(Dynatech實驗室公司，Chantilly VA)的孔中塗上一層含有溶解在50 mM碳酸鈉(pH9.5，含有35 mM碳酸氫鈉)(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA，試劑等級)中的10μg四價肽ACA6501/3B10，在室溫下放置至少1小時。然後，將此液體從孔中除去，向每個孔(包括空白孔)中加入用於封阻的200μL的溶解在TBS中的0.5％(wt/vol)BAS(Sigma化學藥品，St.Louis,MO,#A7638)，將其在室溫下溫育至少1小時。將4個1.5毫升的離心管標記為1-4號。在第一個離心管(Brinkman Instruments,Westbury,NY)中混合下列試劑30μL的5％ BSA；284μL TBS；8 μL大約400-500μg/mL的單體肽(ACA-5A12或-CB2或-3B10或混雜的-3B10作為陰性對照)TBS溶液的儲備溶液；8.2μL 1∶10稀釋的血清6501的0.5％BSA-TBS溶液。在第二個離心管中混合下列試劑；30μL的5％BSA；290μLTBS；2μL大約400-500μg/mL的單體肽(ACA-5A12或-CB2或-3B10或混雜的-3B10作為陰性對照)TBS溶液的儲備溶液；8.2μL 1∶10稀釋的血清6501的0.5％BSA-TBS溶液。在第三個離心管中混合下列試劑；30μL的5％BSA；287μL大約400-500μg/mL的單體肽(5A12或-CB2或-3B10或混雜的-3B10作為對照)的1∶10稀釋液；8.2μL原來以1∶10稀釋的ACA-6501血清的0.5％BSA-TBS溶液。在第四個Eppendorf離心管中混合下列試劑；60μL 5％BSA；584μL TBS和16.5μL的1∶10稀釋的血清6501的0.5％BSA-TBS溶液。用TBS將封阻的平板洗滌5次。將第一個離心管的溶液加入到3個孔中，每孔100μL。將相同數量的第二、第三和第四離心管的溶液也加入到三重孔中。將第四個離心管中的100μL溶液加入到微量滴定板的三個封阻的空白孔的每一個中。在室溫下將此平板在40rpm的有軌振蕩器(American Dade,Miami,FL,RotatorⅤ)中溫育1小時，然後用TBS洗滌5次。加入溶解在0.5％BSA-TBS中的100μL 1∶1000稀釋的山羊抗人IgG/鹼性磷酸酯酶綴合物(Zymed，南舊金山，CA，產品號62-8422)溶液，並在室溫下溫育1小時。然後用TBS洗滌此平板5次，如實施例1所述通過加入100μL PPMP稀釋的底物溶液進行測定。20分鐘後，通過向每孔中加入50μL的0.2M Na2HPO4(Mallinckrodt,St.Louis,MO.，試劑等級)終止反應。在微量平板讀數儀(Bio-Tek儀器，Winoosli,VT,EL 311型)上以550nm測定光密度。將550nm下的光密度對每孔中的肽量在Graph Pad Prizm(Graph Pad軟體公司，San Diego,CA)上作圖。從此圖計算血清6501與四價3B10結合的50％抑制作用所需的肽量。
(B)以30μL/孔的量將Immulon I96孔平底的聚苯乙烯微量滴定板(Dynatech實驗室公司，Chantilly,VA)塗布上心磷脂(CL,50μg；Sigma化學藥品公司，St.Louis,MO)的乙醇溶液。兩個對照孔中只含有30μL的乙醇。4℃下，過夜蒸發後，室溫下將每個孔用200μL 5％(w/v)魚明膠的PBS溶液封阻2小時。然後用TBS洗滌5次塗布有CL的封阻的平板，並向每個孔中加入β2-GPI作為100μL的2.3％(v/v，在PBS中)IgG耗盡的人血清(Sigma化學藥品公司，St.Louis,MO)，並在室溫下溫育2小時。
在溫育過程中，使用Eppendorf離心管，將數量可變化的6種肽的每一種與22μL ACA6501血清混合(所說的血清是用溶解在1∶1 TBS/PBS中的3％魚明膠稀釋(最終為1∶400的稀釋液)的，最終體積為220μL。具體地，在#1管中混合181.3μL的3％魚明膠/TBS-PBS溶液、16.7μL的肽儲備溶液以及22μL的ACA6501血清(在3％魚明膠/TBS-PBS溶液中稀釋40倍)。對於肽#951(二絲氨酸非環化的陰性控制)，#952(大量的LJP 690)和硫醚CCTE-3G3、CHTE-3G3、HCTE-3G3和HHTE-3G3，儲備溶液的濃度變化範圍為450-800μg/mL。在2號管中加入下列物質；148μL的魚明膠/TBS-PBS,50μL的肽儲備溶液+22μL 40倍稀釋的ACA6501血清。3號管含有48μL的魚明膠/TBS-PBS,50μL的肽儲備溶液+22μL 40倍稀釋的ACA6501血清。4號對照管中含有396μL的魚明膠/TBS-PBS和44μL 40倍稀釋的ACA6501血清(不含肽)。在室溫下將每一個管溫育大約1小時。
用TBS洗滌CL/β2-GPI微量滴定板5次，將100μL Eppendorf1、2、3、4號管中的含有抗體-肽(或者沒有肽混合物)的溶液重複加入到這些孔中。將100μL的管4的溶液重複加入到不含心磷脂的對照孔中。室溫下將此平板在40 rpm的軌道振蕩器(American Scientific,RotatorⅤ)中溫育1小時，然後用TBS洗滌5次。加入溶解在0.5％BSA-TBS中的100μL 1∶1000稀釋的山羊抗人IgG/鹼性磷酸酯酶綴合物(Zymed，產品號62-8422)溶液。室溫下溫育1小時後，再用TBS洗滌此平板5次，通過加入100μLPPMP溶液(7.8g酚肽一磷酸+69.5g 2-氨基-2-甲基-1-丙醇的100mL水儲備溶液，用水以1∶26稀釋)進行酶比色測定。21分鐘後，通過向每孔中加入50μL的0.2 M Na2HPO4(Mallinckrodt)來終止反應。在微量平板讀數儀(Bio-Tek儀器，Winooski,VT,EL 311型)上在550nm處測定吸收率。將吸收率對加入的肽量在Graph Pad Prism(Graph Pad軟體公司)上作圖。從此圖的與最大吸收率一半的交叉點的肽加入量來計算50％抑制ACA6501結合(IC50)的肽量。
(C)在Nunc Maxisorp96孔平底微量滴定平板上以100μL/孔(在PBS中)塗布一層純化的人P2-糖蛋白I(Perlmmune,Rockville,MD)。兩個對照孔只接收100μL PBS。在室溫下溫育兩小時之後，除去液體。在室溫下用200μL/孔的包含2％(w/v)無脂幹牛奶(Carnation,Glendale,CA)和0.4％(w/v)Tween 80(Calbiochem,San Diego,CA)的PBS封阻塗布的平板2小時。封阻液也用作為稀釋劑。
在溫育的第二小時期間，利用Eppendorf微量離心管，使可變量的四個檢驗肽之每一個與22μL ACA-6501血清(以220μL的終體積用樣品稀釋劑稀釋的)混合。具體地說，在管1中，加入188μL的樣品稀釋劑、10μL的肽儲備溶液(2mg-4mg/mL稀釋劑)、以及22μL的用樣品稀釋劑稀釋為1∶35的ACA-6501血清。在管2中，加入158μL的樣品稀釋劑、40μL的肽儲備溶液、以及22μL的1∶35稀釋的ACA-6501血清。管3包含38μL樣品稀釋劑、160μL肽儲備溶液以及22μL的1∶35稀釋的ACA-6501血清。對照管(管94)包含396μL樣品稀釋劑和44μL的1∶3.5稀釋的ACA-6501血清(沒有肽)。在室溫下溫育每管大約1小時。
用TBS洗滌β2-GPI微量平板5次，並加入100μL的包含在Eppendorf管1、2、3和4中的混合物至微量平板的重複孔中。將管4的100μL內含物加入到沒有塗布β2-GPI的重複對照孔中。在室溫下溫育平板1小時，用TBS洗滌5次，並加入100μL的用樣品稀釋劑緩衝液稀釋為1∶1000的山羊抗人IgG/A-P綴合物(Zymed，產品號62-8422)。在室溫下溫育1小時後，用TBS再洗滌平板5次，並通過加入100μL PPMP溶液(在100 mL水儲備液中的用水稀釋為1∶26的7.8g酚酞一磷酸和69.5g 2-氨基-2-甲基-1-丙醇)來進行比色酶檢測。在22分鐘之後，通過每孔加入50μL的0.2M Na2HPO4(Mallinckrodt)來停止反應。用微量平板讀數儀(Boi-Tek儀器，EL 311型)讀取A550 nm。將吸光度與加入的肽量點繪在Graph PadPrism(Graph Pad Software公司)上，如圖21所示。從圖上在最大之一半的吸光度與加入的肽量的相交點處，計算50％抑制ACA-6501結合的肽量(IC-50)。實施例5肽3B10的截短實驗和所形成的肽的競爭ELISA結果在室溫下以每孔100μL的四體ACA-6501/3B10肽(為10μg/mL的碳酸鹽緩衝液(pH 9.6,15mM Na2CO/35mM NaHCO3))溶液)塗布微量滴定板(96孔、平底的聚苯乙烯，Immulon-2,Dynatech實驗室公司，Chantilly,VA)。從孔中除去液體後，在室溫下用200μL的0.5％(wt/vol)BSA(無球蛋白，產品號A7638,Sigma化學藥品公司，St.Louis,MO)的TBS溶液封阻每孔1小時。此平板左邊的三重孔沒有塗布四價的肽，目的是作為空白對照孔。
在封阻期間，將每一種可溶的待測的單體肽裝入三個試管(Eppendorf小試管，Brinkmann儀器，Westbury,NY)中，每個管中含有30μL 5％BSA/TBS、8.2μL ACA-6501血清(用0.5％BSA/TBS以1∶10稀釋)+體積可變的肽/TBS儲備物、必要量的TBS，使最終體積為330μL。330μL體積足以產生3個100μL的每一種肽濃縮物的樣品，這些樣品用於檢測其封阻ACA-6501與四價肽塗布的平板的結合能力。對於肽139(其氨基末端是截短的，並缺乏正常試驗的構架ala-gly)，此儲備溶液的濃度為大約340-400μg/mL TBS，除去19μL、75μL和292μL等分溶液以便製備三種肽濃度的管。對於肽142(只是沒有N-末端ala)和肽143(沒有截短)，儲備溶液的濃度為大約400-500μg/mL TBS。從每一種儲備物溶液中除去1μL、4μL和16μL的等分溶液以製備每種肽的三種濃度的管。對於肽單體對照管(沒有肽)，製備最終體積為660μL的管，其包含60μL 5％BSA、16.5μL的ACA-6501的1∶10稀釋液和583.5μL的TBS(即與330μL的管具有相同的最終濃度(0.5％BSA和1∶400的ACA-6501血清)，但是體積是它的兩倍，不含肽)。
封阻溫育後，將用四價肽塗布的平板用TBS洗滌5次。將每一個330μL的以不同濃度含有肽139、142和143的管中的100μL溶液加入到塗布的三重孔中。將不含肽的660μL的對照管中的三份100μL等分溶液分別加入到塗布的孔中，另外三份100μL的等分溶液分別加入到未塗布的空白孔中。在室溫下將此平板在40轉/分鐘的旋轉有軌振蕩器(Rotator V,American Dade,Miami,FL)中溫育1小時，然後用TBS洗滌5次。向微量滴定板每孔中加入溶解在BSA-TBS中的100μL 1∶1000稀釋的山羊抗人IgG/鹼性磷酸酯酶綴合物(產品號62-8422,Zymed,South SanFrancisco,CA)溶液。在室溫下溫育1小時後，然後再用TBS洗滌此平板5次。向每孔中加入100μL新製備的稀釋PPMP底物溶液後可產生顏色。PPMP的稀釋溶液(酚肽一磷酸，產品號P-5758,Sigma化學藥品公司，St.Louis,MO)是通過以1∶26用水稀釋PPMP儲備溶液(0.13MPPMP、7.8M氨基-2-甲基-1-丙醇(用HCl將其pH調至10.15))製備的。30分鐘後，通過向每孔中加入50μL的0.2M Na2HPO4(試劑級，Mallinckrodt,St.Louis,MO)終止反應。在微量平板讀數儀(Bio-Tek儀器，Winooski,VT,EL 311型)上以550nm測定吸收率，將吸收率對每孔加入的肽量在Graph Pad Prizm(Graph Pad軟體公司，San Diego,CA)上作圖。如圖11所示，劃出的基線相當於在沒有單體肽競爭抑制作用時的結合反應最大值的一半。50％的抑制值如圖12所示。所得的結果表明N-末端Ala的缺失沒有負作用，而Gly的再缺失則增加了獲得50％抑制作用所必需的濃度大約8倍。實施例6:3B10中的α-甲基脯氨酸取代及所產生的ELISAs使用實施例5描述的方法試驗肽ACA-6501/3B10和其類似物(其中3和9位上的脯氨酸由α-Me-Pro代替)。使用四體肽3B10塗布的微量滴定板和ACA-6501血清在競爭結合ELISA中檢驗作為可溶單體肽的肽3B10，726(在3位上αMe-Pro被取代)，727(在9位上αMe-Pro被取代)，和728(在3和9位上αMe-Pro被取代)。
如實施例5所述將微量滴定板用四體肽3B10塗上一層。對於所試驗的4種肽的每一種，在管中製備3種濃度的肽。這12個管的最終濃度為0.5％BSA/TBS、以1∶400最終稀釋的ACA-6501血清，終體積為330μL。所有的肽儲備溶液為400-500μL/mL TBS。向含有30μL 5％BSA/TBS和8.2μL ACA-6501血清(用0.5％BSA/TBS以1∶10稀釋)的管中，加入4種肽儲備溶液的每一種的1μL、4μL和16μL的等分溶液，另外加入合適體積的TBS，使最終體積為330μL。如實施例5所述，製備最終體積為660μL的不含競爭肽的對照管。
四價肽塗布的平板的溫育封阻後，如實施例5的描述試驗來源於四種肽的各種肽濃度管中的三份100μL等份樣品、以及來源於不包含肽的對照管和空白對照中的等份樣品。如實施例5的描述實施微量滴定板ELISA方法和進行數據處理。如圖13所示，肽727(其中在9位置上的α-Me-Pro被取代)與未修飾的肽3B10或帶有改變的脯氨酸的類似物(肽728)相比具有明顯提高的活性。肽726(其在3位發生取代)由於這種取代而失去了活性。實施例7利用6626抗體的篩選的簡要描述和相應的序列通過親和純化從上述的8mL ACA-6626血漿中分離親和純化的ACA-6626(AffACA-6626)。將AffACA-6626(10μg)與含有全部的p-Ⅲ感受態的一組文庫(最終體積為100μL)(如上文用於ACA-6501生物淘選的描述)的表位xy』z噬菌體文庫一起溫育。在三輪生物淘選之後，通過微量淘選檢驗從第二輪和第三輪中隨機選擇的噬菌體。只有幾個克隆在1∶1000稀釋度下具有微弱的免疫陽性。對另外的第四輪進行生物淘選。94個第四輪克隆的微量淘選顯示出43個免疫陽性，有些在高達1∶100000稀釋度下表現出免疫陽性。如上文用於ACA-6501的描述所進行的43個免疫陽性克隆的G-示蹤DNA測序表明5個單一序列。在常規的四鹼基DNA測序後，獲得了表3的翻譯胺基酸序列。實施例8對患者6644的ACA特異的序列的鑑定使用與實施例4類似的方法通過患者6644的ACA親和純化的抗體篩選epixy』z噬菌體顯示文庫。在肽合成前使用上述的菌落印跡分析作為最後的鑑定步驟。在原來硝酸纖維素膜上接種大約150個菌落，並對其進行測定。以1μg/mL的濃度使用患者6644的抗體。在此篩選中，在硝酸纖維素膜上平板接種和測定的150個菌落中，只有四個具有較強的陽性，2個表現出微弱的陽性。此篩選中選擇出的6個陽性噬菌體的插入片段的測序表明所有這些插入片段都來自具有游離氨基末端(epiz)的8-mer文庫。
Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Asp-Tyr-Val-Gly-Gly(3個插入片段)Gly-Ile Leu-Thr-Ile-Asp-Asn-Leu-Gly-Gly(1個插入片段)Gly-Ile-Leu-Leu-Asn-Glu-Phe-Ala-Gly-Gly(2個插入片段)實施例9利用ACA-6641的噬菌體文庫篩選的概述從取自患者6641的4mL血漿中分離AffACA-6641。如上所述將AffACA-6641(10μg)與一組p-Ⅲ噬菌體文庫(最終體積為100μL)一起溫育。在四輪生物淘選之後，通過微量淘選檢驗第三輪和第四輪中的45個克隆。在45個克隆中有23個是陰性的。第三輪噬菌體產生得分為4+的兩個克隆、得分為3+的兩個克隆、得分為2+的兩個克隆。在第四輪中一個克隆得分為4+，一個克隆得分為3+,3個克隆得分為2+。G-示蹤的DNA測序顯示出6個單一序列。只有一個克隆(3G3)在噬菌體俘獲ELISA中顯示出較強的陽性。四個鹼基的DNA測序得到下列翻譯的肽序列CLGVLGKLC。實施例10肽與非免疫原性多價載體的綴合如共有共同未決美國專利申請08/118,055(1993年9月8日申請)、08/152,506(1993年11月15號申請)和美國專利5,268,454、5,276,013和5,162,515(其全部內容本文一併參考)中所述，已經開發出用於產生B細胞耐受原的一些四價平臺。結合通過表位文庫的aPL抗體篩選選擇的候選肽，並檢驗它的免疫化學行為(如抗體結合)的改變。
按照下面的方案合成帶有胺基團的非免疫原性多價平臺。平臺上的胺-肽上的羧基
化合物2將溶解在50mL純EtOH和35mL環己烯中的8.0g(5.7mmol)化合物1溶液放置在氮氣中，加入500mg 10％Pd/碳。將混合物攪拌回流2小時。冷卻時經Celite過濾，濃縮得到油狀的5.0g化合物2。1H NMR(50/50CDCl3/CD3OD)d1.21(m,8H),1.49(m,8H).1.62(m,8H),2.19(t,J=7.4Hz,8H),2.67(t,J=7.4 Hz,8H),3.36(bd s,16H),3.67(s,4H),3.71(m,4H)；4.21(m,4H)。帶有游離羧基的保護肽(PHN-肽-CO2H)在Wang(對烷氧基苄基)樹脂上利用FMOC化學經標準固相方法合成肽，其中使用三氟乙酸(TFA)穩定保護基團(在羧基上的苄基酯或環己基酯和在氨基上的苄氧羰基(CBZ))。將胺基酸殘基順序地加入到氨基末端。利用TFA從樹脂上取出肽，以便提供在羧基末端具有一個游離羧基的肽，所有其它的羧基和氨基都被封阻。通過反相HPLC純化保護的肽。肽-平臺綴合物4把保護的肽(0.3mmol)溶解在1mL的二甲基甲醯胺(DMF)中，向溶液中加入0.3mmol二異丙基碳化二亞胺、0.3mmol 1-羥基苯並三唑水合物(HOBT)。將此溶液加入到含有0.025mmol四氨基平臺、化合物2(1mLDMF溶液)的溶液。加入後真空除去DMF以產生粗製的完全保護的綴合物3。在0℃下用氫氟酸(HF)在茴香醚存在下處理綴合物3產生綴合物4。
通過製備型反相HPLC進行純化。
下列的方案顯示出肽的氨基連接到平臺的羧基上。平臺上的羧基-配體上的胺
將琥珀酐(1.0g,10mmol)加入到溶解在20mL1/1二噁烷/水中的861mg(1.0mmol)的化合物2和252mg(3.0mmol)的NaHCO3溶液中，將混合物在室溫下攪拌16小時。用1N HCl將混合物酸化，並將其濃縮。通過矽膠層析純化此濃縮物，產生化合物5。帶有游離胺的保護的肽(H2N-肽-CONH2)使用TFA穩定保護基團(在羧基上的苄基酯或環己基酯和在氨基上的CBZ)在醯胺樹脂上經標準的固相方法合成肽，這樣，從此樹脂上切割後產生羧基末端的醯胺，使用標準的FMOC化學向氨基末端順序加入胺基酸殘基。使用三氟乙酸從樹脂上除去此肽以產生帶有游離胺接頭的保護的肽。經反相HPLC純化此保護的肽。肽-平臺綴合物7製備溶解在1mL的DMF中的0.05mmol帶有游離胺的保護肽(H2N-肽-CONH2)、0.1mmol二異丙乙基胺、0.01mmol的化合物5溶液。加入BOP試劑(苯並三唑-1-基氧-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽)(0.1mmol)，攪拌混合物直到經分析型HPLC確定反應完全。0℃下在茴香醚存在時通過HF處理除去肽保護基團，得到除去肽保護基因的綴合物7。經製備型反相HPLC純化化合物7。
下列方案表明如何將巰基接頭與肽的氨基末端連接，接下來將肽胺頭與四溴乙醯化的平臺連接產生化合物13。平臺上的滷乙醯和肽上的巰基三苯基乙醇
化合物9將濃硫酸(100μL)添加到4.48g(17.2mmol)三苯甲醇和1.62g(15.3mmol,1.3mL)3-巰基丙酸在35mL EtOAc中的60℃溶液中。在60℃將混合物攪拌10分鐘，使其冷卻至室溫(RT)，置於冰上1小時。通過過濾收集所形成的白色固體，給出4.52g(75％)化合物9。化合物10將二環己基碳化二亞胺(DCC)(2.41g,11.7mmol)添加到2.72g(7.8mmol)化合物9和1.08g(7.8mmol)對硝基苯酚在41mL CH2Cl2中的0℃溶液中。將混合物攪拌16小時，使其到達RT。過濾混合物以除去N,N-二環己基脲(DCU)，濃縮濾液。從己烷/二氯甲烷結晶殘渣，產生3.17 g(86％)淡黃色結晶狀的化合物10。化合物11-具有連接的巰基丙醯接頭的環狀硫醚肽將環狀硫醚肽(一種二硫化物環化肽類似物，其中一個硫原子被一個CH2取代)和碳酸氫鈉在水和二噁烷中的溶液用對硝基苯酯10處理。如果肽含有賴氨酸，則其必須進行合適的封阻。將所形成的稀釋肽用三氟乙酸處理，產生硫醇接頭修飾的肽11。化合物13-環狀硫醚肽和溴乙醯化平臺的綴合物向0.10mmol硫醇修飾肽11在100mM硼酸鈉(pH9)中的He吹洗的溶液加入0.025溴乙醯化平臺12(在9/1 MeOH/H2O中的40mg/mL溶液)。在N2氛圍下攪拌溶液，直到由HPLC證實綴合完全。通過反相HPLC純化綴合物。實施例12:LJP 685的合成
γ-溴代-N-BOC-α-氨基丁酸叔丁酯，化合物14:
在40mL幹THF中的4.03g(13.3mmol)N-BOC-穀氨酸-α-叔丁酯和1.61mL(1.48g,14.6mmol)N-甲基嗎啉在N2氛圍下冷卻至15℃。將氯甲酸異丁酯(1.73mL,1.82g,13.3mmol)逐滴加入到混合物中。將混合物攪拌10分鐘，加入2.03g(16.0mmol)N-羥基-2-巰基吡啶在8mL THF中的溶液，接著加入2.23mL(1.62g,16.0mmol)Et3N。將混合物用箔包裹以避光，使其在室溫下攪拌1小時。過濾混合物，在旋轉蒸發器上濃縮濾液，小心儘量不暴露於光下。將濃縮物溶解在20mL BrCCl3中，將溶液冷卻至-70℃。將固體置於真空中，然後用N2清洗，使其達到室溫，置於20℃的水浴中，在近距離內從上方用500W太陽燈照射5分鐘。在旋轉蒸發器上濃縮混合物，經矽膠色譜純化(40mm×150mm，甲苯用作洗脫液直到UV活性物完全洗脫，2％EtOAc/甲苯(500mL),5％EtOAc/甲苯(500 mL)。再純化不純的組分。合併TLC(Rf 0.23,5％EtOAc/甲苯)純化的組分，濃縮，產生3.23g(72％)蠟狀固體狀化合物14。N-BOC-甘氨醯脯氨酸-4-硝基苯酯，化合物15將3.0g(11.6mmol)N-BOC-甘氨醯脯氨酸和1.93g(13.9mmol)4-硝基苯酚在82mL幹THF中的溶液冷卻至0℃，加入3.34g(16.2mmol)DCC。將混合物在0℃下攪拌1小時，移去冰浴。將混合物在室溫下攪拌16小時。將HOAc(579μL)加入到混合物中攪拌30分鐘。將混合物保持在冰箱中30分鐘，在真空下過濾。濃縮濾液，經矽膠色譜(18×150mm柱床，2.5％EtOAc/97.5％CH2Cl2/1％HOAc)純化。通過在旋轉蒸發器上從二噁烷環濃縮幾次除去微量的乙酸。用3/1己烷/Et2O研磨濃縮物，經過濾收集所形成的白色固體，產生4.1g(90％)白色固體狀化合物15。TLC Rf0.09,40/60/1 EtOAc/己烷/HOAc；1H NMR(CDCl3)(1.09-2.55(m,4H),1.48(s,9H),3.47-3.77(m,2H),4.05(m,2H),4.74(m,1H),5.45(bd s,1H),7.35(d,2H),8.30(d,2H)。N-FMOC-S-叔丁基硫代半胱氨酸醯胺(thiocysteineamide)，化合物16將5.0g(11.6mmol)FMOC-S-叔丁基硫代半胱氨酸和1.33g(11.6mmol)N-羥基琥珀醯亞胺在115mL THF中的溶液冷卻至0℃。向溶液中加入3.58g(17.37mmol)DCC，在0℃攪拌混合物1小時，加入1.6g(NH4)HCO3在50mL水中的42.9mL溶液。將混合物攪拌4.5小時，使冰浴逐漸溫熱至室溫，在旋轉蒸發器上濃縮，以除去THF，產生具有白色固體的水相。將混合物與200mL CH2Cl2一起攪拌，直到大多數固體溶解，然後與100mL 1N HCl溶液一起振蕩。用100mL飽和NaHCO3溶液洗滌CH2Cl2層。乾燥(Na2SO4)並過濾。在熱的平板上使濾液沸騰，從300mLCH2Cl2/己烷結晶，產生4.36g(87％)白色固體狀化合物16；mp127-129℃；TLC Rf 0.29,95/5/1 CH2Cl2/CH3CN/MeOH,1H NMR(CDCl3)δ1.36(s,9H)；3.06-3.24(m,2H),4.25(t,1H),4.55(m,3H),5.56(bd s,1H),5.70(bd s,1H),6.23(bd s,1H)；13C NMR(CDCl3)29.8,41.9,47.1,48.5,54.2,67.2,120.0,125.0,127.1,127.8,141.3,143.6,156.1,172.2.分析，計算值C,61.4％；H,6.1％；N,6.5％。實測值C,61.5％；H,6.0％；N,6.5％。化合物17將水(16.9mL)添加到在33.8mL二噁烷中的2.91g(6.75mmol)化合物16中，用氮氣吹洗溶液5-10分鐘。將混合物保持在氮氛圍下，加入1.13g(13.5mmol)NaHCO3，接著加入1.77mL(1.44g,7.09mmol)PBu3。在室溫下攪拌混合物1小時，在1×100mL 1N HCl和2×100mLCH2Cl2之間分配。合併CH2Cl2層，濃縮，將所形成的白色固體部分溶解在33.8mL二噁烷中。加入水(9mL)，用氮氣清洗混合物5-10分鐘。將混合物保持在氮氛圍下，加入2.17g(16.9mmol)K2CO3，接著加入2.63 g(8.1mmol)化合物14。將混合物攪拌16小時，在1×100mL 1N HCl和2×100mL 10％MeOH/CH2Cl2之間分配。合併CH2Cl2層，用硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮成半固體殘渣。經矽膠色譜(1/3 CH3CN/CH2Cl2)純化，產生3.2g(80％)化合物17白色固體；TLC Rf0.27,1/3 CH3CN/CH2Cl2。通過從己烷/EtOAc重結晶進行分析樣品的進一步純化；mp104-106.5℃；1HNMR(CDCl3)δ1.47(s,9H),1.49(s,9H),1.96(m,1H),2.11(m,1H),2.69(m,2H),2.88(m,1H),3.03(m,1H),4.29(t,1H),4.36(m,2H),4.50(m,2H),5.21(m,1H),5.49(m,1H),5.81(m,1H),6.54(m,1H),7.34(t,2H),7.42(t,2H),7.61(d,2H),7.80(d,2H)；13C NMR(MeOH)δ26.1,26.7,28.2,28.7,34.8,54.8,55.7,68.1,80.5,82.7,120.9,126.3,128.2,128.8,142.6,145.2,160.0,162.7,173.4,175.8。C31H41N3O7S分析，計算值C,62.08；H,6.89；N,7.01實測值C,62.23；H,7.12；N,7.39。化合物18將20/1/1 TFA/H2O/巰基乙醇(23.2mL)溶液加入到1.27g(2.11mmol)化合物17中。在室溫下攪拌混合物1小時，濃縮至約3mL體積。添加50mL乙醚以沉澱產物。用兩份更多的乙醚洗滌所形成的固體，並在真空下乾燥，產生812mg固體。將該固體懸浮在10.6mL二噁烷和10.6mL H2O中。將NaHCO3(355mg,4.22mmol)添加到混合物中，接著添加1.33g(3.38mmol)化合物15在10.5mL二噁烷的溶液中。在室溫下攪拌混合物20小時，在100mL 1N HCl和3×100mL CH2Cl2中分配。乾燥合併的CH2Cl2層(Na2SO4)，過濾並濃縮。經矽膠色譜純化(35×150mm；梯級梯度，5/95/1 MeOH/CH2Cl2/HOAc(1L)到10/95/1)。濃縮純的組分，與乙醚一起研磨殘渣，產生881mg(60％)化合物18；TLC Rf 0.59,10/90/1MeOH(CH2Cl2/HOAc；mp 116-117.5℃；1H NMR(CDCl3)δ1.41(s,9H),2.00(m,2H),2.18(m,2H),2.56(m,1H),2.69(m,1H),2.85(m,2H),3.49(m,2H),3.62(m,2H),3.85(m,2H),4.08(m,1H)；4.12(m,1H),4.22(t,1H),4.38(m,1H),4.49(m,2H),4.61(m,2H),7.78(d,bd s,1H),6.12(bd s,1H),6.43(bds,1H),7.35(d,2H),7.40(d,2H),7.61(d,2H),7.78(d,2H)；13C NMR(CDCl3)δ25.3,27.8,28.6,29.4,32.6,35.1,44.1,46.9,47.3,52.2,53.9,61.2,67.8,80.8,120.8,125.7,128.2,129.0,142.0,144.5,157.6,157.8,170.6,181.2,182.9,183.1。C34H43N5O9S分析，計算值C,58.52；H,6.21:N,10.03。實測值C,58.38,11,6.17；N,10.20。
N-FMOC-L-丙氨醯-L-2-甲基脯氨酸，化合物19:
將2-甲基脯氨酸(Seebach等(1983)美國化學會雜誌，105:5390-5398)(1.00g；4.76 mmol),4.00g(47.6mmol)NaHCO3和31mg(0.23mmol)HOBT在6.9mL DMF中的溶液冷卻至0℃，加入3.18g(6.66mmol)N-FMOC-L-丙氨酸。在0℃攪拌反應物1小時，然後在室溫下攪拌18小時。將混合物在50mL EtOAc和3×50mL 1N HCl中分配，乾燥EtOAc層(MgSO4)，過濾並濃縮。經矽膠色譜(梯級梯度45/55/1 EtOAc/己烷/HOAc到47/53/1 EtOAc/己烷/HOAc到50/50/1 EtOAc/己烷/HOAc)純化，產生1.72g(86％)化合物19白色固體。將產物從二噁烷濃縮幾次，以除去微量的乙酸；mp 59-60℃；1H NMR(CDCl3)δ1.39(d,3H),1.93(m,2H),2.06(m,2H),3.78(m,2H),4.22(m,1H),4.40(d,2H),4.56(m,1H),5.09(t,1H),5.69(d,1H),7.32(t,2H),7.42(t,2H),7.62(d,2H),7.78(d,2H)；13C NMR(CDCl3)δ17.8,21.8,23.8,37.9,47.1,48.5,65.9,67.0,120.0,125.1,127.1,127.7,141.3,144.1,155.6,172.9,175.1。N-FMOC-L-亮氨醯-HMPB-MBHA樹脂製備N-FMOC-L-亮氨酸在22.5mL CH2Cl2中的溶液和幾滴DMF，冷卻至0℃。向溶液中加入1.71mL(1.38g,10.9mmol)二異丙基碳化二亞胺(DIC)，在0℃下攪拌混合物20分鐘。將混合物濃縮成油狀，同時，將足夠量的DMF(約3mL)加入到2.5g(0.87mmol/g,2.18mmol)HMPB-MBHA樹脂(Nova Biochem)上，以溶脹樹脂。將濃縮的油狀物溶解於少量DMF(約1mL)中，並添加到溶脹的樹脂上，接著加入溶解在約1mLDMF中的266mg(2.18mmol)DMAP溶液。輕輕搖動混合物1小時，洗滌(2XDMF,2XMeOH,2XDMF,2XMeOH)。將樹脂在真空下乾燥，產生2.77g(85％)，取代由Geisen試驗測得為0.540mmol/g。具有在天冬氨酸上的叔丁酯和在精氨酸上的Pmc基以及具有硫醚插入片段的N-FMOC-線性肽，化合物20在N-FMOC-L-亮氨醯-HMPB-MBHA樹脂上經標準FMOC合成法製備該肽。除了化合物18的偶聯步驟外，在各偶聯步驟中使用三當量的胺基酸，HOBT和(DIC)。兩當量的化合物18與三當量的HOBT和二異丙基碳化二亞胺一起使用。利用10μL溴酚藍指示劑監測各步反應。也用茚三酮試驗(在100℃加熱2分鐘，用1滴吡啶和1滴在EtOH中的5％茚三酮和1滴在EtOH中的80％苯酚，液滴變藍)估計反應的完成情況。這樣，將1.13mg(0.613mmol)樹脂用於製備所說的肽。在最後的偶聯步驟後，通過用1％三氟乙酸在CH2Cl2中的溶液處理2分鐘完成從樹脂上裂解。2分鐘後，減壓過濾到30mL 10％吡啶在MeOH中的溶液中。重複這一操作10次。合併經HPLC(C18，梯度，60/40/0.1 CH3CN/H2O/TFA到90/10/0.1CH3CN/H2O/TFA,210nm,1mL/min,4.6mm×250mm柱)正實含有肽的濾液並濃縮。將濃縮物溶解在40mL 10％HOAc溶液中，經HPLC純化，產生0.528g(49％)肽20。將肽20轉化成環狀肽21(除去FMOC基，環化和除去保護基)將99μL DBU在10mL CH3CN中的溶液(5mL)添加到96mg(0.052mmol)肽20中。攪拌溶液1小時，濃縮成殘渣。將該殘渣與2×10mL Et2O一起研磨，產生白色固體。將該固體溶解在100mL CH3CN和312μL(0.312mmol)0.1M二苯基磷醯基疊氮化物(DPPA)在CH3CN中的溶液中。將混合物攪拌20小時，並在旋轉蒸發器上濃縮。將該殘渣與2×50mL Et2O一起研磨，白色的不透明殘渣用5mL 92/3/2/3 TFA/茴香醚/EDT/Me2S處理1小時。通過將混合物加入到在50mL聚丙烯離心管中的40mL Et2O中沉澱產物。將沉澱冷卻至0℃，在2000rpm下離心5分鐘。傾析上清液，用Et2O洗滌沉澱並再離心。乾燥沉澱並溶解在4mL 50/50 CH3CN/H2O中。用36mL H2O/0.1％TFA稀釋混合物，經HPLC(1＂C18柱，梯度，10/90/0.1 CH3CN/H2O/TFA到35/65/0.1 CH3CN/H2O/TFA,230nm)純化。冷凍乾燥經HPLC證實的純化的組分，產生52 mg(90％)化合物21。實施例13:LJP 685綴合物的合成
用3-三苯甲基巰基丙酸PNP酯處理LJP 685(也稱為化合物21)，將產生的產物脫三苯甲基化，產生化合物22，具有游離硫醇接頭的肽。過量化合物22與效價平臺分子12的反應產生四價的綴合物25。用較長的接頭，化合物33(參見以下反應方案)處理化合物21，接著脫三苯甲基產生化合物24。化合物24與效價平臺分子12反應產生四綴合物26。通過HPLC，兩種綴合反應看來非常清楚。將MTU接頭連接到LJP685上，合成化合物24向15mg(0.013mmol)化合物21中加入160μL 29.5mg化合物23的溶液和17.5μL在0.5mL DMF中的二異丙基乙胺的溶液。將混合物攪拌2小時，並從Et2O中沉澱。乾燥沉澱並溶解在650μL1/1/0.056/0.040TFA/CH2C12/苯硫酚/Me2S溶液中，使溶液靜置1小時。從Et2O沉澱，產生粗化合物24，經HPLC(C18,15-45％CH3CN/H2O,0.1％TFA)純化。將含有純化的產物的組分冷幹，產生8.6mg化合物24白色固體。LJP 685-MTU-AHAB-TEG，化合物26:
向8.6mg(6.3×10-6mol)化合物24在630μL He吹洗的pH8.5 200mM硼酸鹽緩衝液中的溶液中加入40μL 40mg/mL化合物12在9/1MeOH/H2O中的溶液，攪拌混合物24小時，加入1mL 10％HOAc/H2O溶液，經HPLC(C18，梯度25-55％CH3CN/H2O,0.1％TFA)純化混合物，產生8.3mg化合物26(LJP 685-MTU-AHAB-TEG)。實施例14展開延伸的SH接頭從化合物27製備硫代苯甲酸酯，化合物28。將化合物28部分轉化成化合物29。經乙醇解除去硫代苯甲酸酯，將形成的硫醇三苯甲基化。然後水解乙基醚，產生化合物29。從化合物29製備硝基苯基磷酸(PNP)酯，化合物30。通過用疊氮化鈉處理化合物27並還原成胺製備氨基十一烷酸乙基酯，化合物31，用化合物30使胺31醯基化，產生化合物32。通過用氫氧化鈉處理進行化合物32的水解，產生游離的羧酸。用對硝基苯酚縮合中間體羧酸，產生對硝基苯基(PNP)酯，化合物33。將接頭33連接到肽上，除去三苯甲基，產生化合物34，其用於產生MTU-ATU-AHAB-TEG綴合物。
實施例15合成(LJP685)4/MTU-ATU-AHAB-TEG綴合物，化合物35如下所示製備四價綴合物35。將具有連接的接頭的肽(化合物34)溶解在He吹洗的(pH8.5)200mM硼酸鹽緩衝液中，向混合物中加入0.3mol當量的平臺化合物12。將混合物攪拌1小時，經HPLC純化產物。
實施例16合成(LJP685)4/DABA-PEG綴合物，化合物36用在8.5硼酸鹽緩衝液中的化合物24處理IA-DABA-PEG產生綴合物36。
實施例17T細胞活化測定在96孔圓底平板中監測肽-刺激T細胞對三苯甲基化胸腺嘧啶核苷的攝取。將消耗淋巴結細胞(小鼠)或分離的外圍血淋巴細胞(人)的單-細胞懸液5×105以每孔150μL終體積與1和30μg之間的肽混合，在5％二氧化碳中於37℃下培養5天。培養結束時加入1微居裡標記的胸腺嘧啶核苷，並培養另外的15-24小時。將收穫的細胞收集在濾器上，由液態閃爍光譜測定法計數。實施例18耐受性的體外誘導8組(每組包含5隻C57B1/6隻小鼠)用10μg/小鼠在明礬上的LJP685-KLH綴合物加作為佐劑的百日咳巴爾通氏體(B.pertussis)疫苗致敏。在3周之後，收穫脾並製備單細胞懸液，用平衡鹽溶液洗滌3次，以等同於1個脾/1.5mL培養基的濃度重懸於完全RPMI-1640培養基中。將細胞懸液分成2.5mL/培養皿的等分試樣，在37℃以100μM、20μM和4μM濃度與(LJP685)4-DABA-PEG(化合物36)和(LJP685)4-TEG(化合物35)一起培養2小時。一組細胞在沒有耐受原存在下培養，作為陽性對照。然後用大體積的平衡鹽溶液洗滌細胞，並重懸於2.5mL平衡鹽溶液中。接著將細胞注射進650R放射同系(syngeneic)受體小鼠，使得所有來源於給定處理組的細胞平等地分成5組受體。用10μg鹽水中的LJP 685-KLH腹膜內加強免疫包括陽性對照在內的所有受體小鼠。在加強免疫後七天，對小鼠放血，其血清用於試驗抗LJP 685抗體的存在。用兩種綴合物處理產生如圖16和圖17所示的抗LJP 685抗體的明顯劑量依賴性降低，其是通過如Iverson,G.M.，在試驗免疫學手冊，第二卷，細胞免疫學中的＂體內過繼免疫反應測定＂(Weir,D.M.,ed.,Blackwell科學出版社，Pale Alto,CA,1986)中所描述的抗原結合能力(ABC)測定的。實施例19:5A12、CB2和3G3肽的NMR溶液結構分析對利用以上實施例中所描述的方法從噬菌體文庫篩選分離的兩種肽進行NMR分析。原來的肽在倒數第二位有脯氨酸，而這一胺基酸被除去，因為二維(2D)雙量子濾過相關光譜學(DQF-COSY)NMR數據表明兩個在這一位置上的不同於順式和反式異構體的結構。除去脯氨酸給出具有結合ACA抗體的在50-100nM範圍內的K』D和在DQF-COSY譜指紋區中預期數目的峰的肽。所形成的環狀肽是5A12(GPCLILAPDRCG)和CB2(GPCILLARDRCG)。所述肽之間的主要區別是8位上脯氨酸取代精氨酸，其導致CB2(與5A12是剛性更強的肽是一致的)的1D1H NMR譜中少得多的分散。精氨酸取代也產生pKa值所反映的離子化天冬氨醯基羧基的0.55kcal/mol穩定化。在更加規則的5A12肽上進行結構分析。儘管重氫交換和溫度係數數據顯示沒有氫鍵合的證據，但核歐沃毫斯效應(NOE)、旋轉歐沃毫斯效應(ROE)和連接數據是與一個結構一致的。距離幾何學計算給出50個結構的家族。15個最好的具有2.1±0.2埃的所有原子的平均根平均平方偏差(RMSD)。我們確定,所說的肽具有橢圓形，在分子相對的端、二硫化物和脯氨酸8(其是順式的)處有轉角。在骨架LIL區中也有結。最後，羧基末端甘氨酸是非常易變的，因為其是具有陽性內殘基NOE的僅有的殘基。這代表有關肽(其模仿在β2-GPI上的ACA表位)的所確定的第一結構信息。
與距離幾何學計算相聯繫的NMR數據用來確定肽925(CLGVLAKLC)、具有在肽925的6位丙氨酸取代甘氨酸的截短的肽3G3(AGPCLGVLGKLCPG)的三維結構。於25℃pH3.8下在水中測定肽925的結構。計算了全部9個結構，所有的均與NMR數據一致。當每一結構與質心比較時，所有非氫原子的RMSD是2.45±0.36埃。圖18顯示最接近質心的結構，因此是肽925分子形狀的合理的代表。圖19將肽925的結構(在圖的底部標記為3G3)與肽5A12的結構進行了比較。在肽序列中兩種肽大約在相同的位置具有轉角。
肽的藥效基團已被暫時鑑定為小的疏基團和帶正電荷的基團。肽925的偕二甲基和氨基已被暫時鑑定為這一肽的藥效基團，如圖20所示。限制藥效基團在某些支架上的碳氫化合物接頭具有圖20限定的長度，這些接頭連接到支架上的位點由限定的距離分開。最後，限定兩種接頭相對取向的兩面角被確定為22°。
實施例20:TEG氨基甲酸酯接頭的合成
2-[2-(2-叔-丁基硫代乙氧基)乙氧基]乙醇，化合物38:
在2-[2-(2-氯代乙氧基)乙氧基]乙醇(11.0g,65.24mmol)和叔丁基硫醇(7.35mL,65.23mmol)的混合物(在冰浴中冷卻)中緩慢加入1,8-二氮雜二環[5.40]十一-7-碳烯(DBU,9.75mL,65.23mmol)。將反應混合物溫暖至室溫，並且攪拌一夜。然後用乙酸乙酯稀釋這一混合物，並過濾之。在用乙酸乙酯洗脫過的過濾柱上純化濾液中的粗產物以給出淡黃色油(14.4g,64.6mmol,99％):1H NMR(300Mhz,CDCl3):d 3.73(brs,2H),3.69-3.60(m,8H,2.75(t,J=7.4,2H),2.62(brs,1H),1.32(s,9H)；13C NMR(75 Mhz,CDCl3):d 72.47,71.08,70.33,70.27,61.71,42.09,30.95,27.87；MS(ESI):m/e(M+1)C10H23O3S的計算值223，觀測值223。2-[2-(2-叔-丁基硫代乙氧基)乙氧基]乙基對硝基苯基碳酸酯，化合物39:
在化合物38(2.0g,8.98mmol)和對硝基苯酚氯甲酸酯(1.81g,8.98mmol)的溶液(在5mL幹THF中，在冰浴中冷卻)中緩慢加入在1mL幹THF中的無水吡啶(0.73mL,8.98mmol)。立即形成白色沉澱。在室溫下攪拌15分鐘之後，用10mL乙醚稀釋反應混合物，並過濾之。濃縮濾液並將其直接用於肽合成而無須進一步純化。實施例21四價平臺IA/DABA/ATEG 46的合成雙-N-(叔-丁氧基碳醯)-二氨基苯甲酸，化合物40在3,5-二氨基苯甲酸(2.5g,16.4mmol)和NaHCO3(2.76g,32.9mmol)的溶液(在44.5mL水和22.5mL MeOH中)中緩慢加入在5.5mLMeOH中的二叔丁基重碳酸酯溶液(7.18g,32.9mmol)，並在室溫下攪拌該混合物24小時。將混合物冷卻至0℃，並加入6.53g檸檬酸，然後用EtOAc提取混合物。乾燥(MgSO4)合併的EtOAc層，過濾之，並濃縮之。將殘餘物溶解在40mL Et2O中，並通過Celite過濾溶液。用兩份各40mL的HCl提取該Et2O層。乾燥(MgSO4)、過濾和濃縮該Et2O層從而給出3.81g(66％)的化合物40(為泡沫狀的粉紅色固體)。化合物40的N-羥基琥珀醯亞胺基酯，化合物41在化合物40(3.8g,10.8mmol)和N-羥基琥珀醯亞胺(1.24g,10.8mmol)的溶液(在55mL EtOAc中，已冷卻至0℃)中，加入二環乙基碳化二亞胺(3.34g,16.2mmol)，並在使所產生的混合物升至室溫的過程中將其攪拌18小時。在混合物中加入0.55mL乙酸。攪拌混合物30分鐘，並將其放置在冷凍器中凍結2小時。過濾混合物以除去固體，並濃縮濾液以給出5.80g的粉紅色的泡沫狀固體。矽膠色譜(60/40/1己烷/EtOAc/HOAc)的純化給出4.30g(89％)的化合物41(為淡粉紅色固體)。單-N-(叔丁氧基碳醯)-乙二胺，化合物42將1.5g(25.0mmol)乙二胺溶液(在15mL CH2Cl2中)冷卻至0℃，並在該混合物中緩慢加入1.82g(8.33mmol)的二叔丁基重碳酸酯溶液。在室溫下攪拌該混合物18小時並過濾之，然後濃縮濾液。矽膠色譜(90/10/1CH2Cl2/MeOH/HOAc)的純化給出0.98g(67％)的化合物42(為油狀物)。雙-N-(叔丁氧基碳醯)-氨基-TEG，化合物43在750mg(4.25mmol)化合物42和345μL(337mg,4.25mmol)吡啶的溶液(在6mL CH2Cl2中)中，加入445μL(559mg,2.02mmol)三甘醇二氯甲酸酯。攪拌該化合物3.5小時，並在35mL CH2Cl2和35mL 1N HCl之間分配該混合物。用水洗滌CH2Cl2層，乾燥(NaSO4)、過濾並濃縮之，從而給出1.14g的直接用於下一步的粗化合物43。二氨基-TEG雙三氟乙酸鹽，化合物44將300mg(0.57mmol)的化合物43溶解於3.5g CH2Cl2中，並加入3.5mL三氟乙酸。在室溫下攪拌混合物3小時，並濃縮溶液以給出398mg的直接用於下一步的粗化合物44。化合物45在398mg粗化合物44(估計為316mg,0.57mmol)和193mg(2.30mmol)NaHCO3的溶液中，加入在6mL二噁烷中的化合物41(567mg)的溶液。攪拌混合物3小時，並用1N HCl酸化之，並且在20mL 1N HCL和30mL EtOAc之間分配之。用飽和NaHCO3溶液洗滌合併的EtOAc層，乾燥(MgSO4)、過濾並濃縮之以給出490mg(86％)的粗化合物45(為白色的泡沫狀固體)。矽膠色譜(EtOAc)的純化給出276mg(48％)的化合物45(為白色的泡沫狀固體)。IA/DABA/ATEG，化合物46製備100 mg(0.1mmol)的化合物45溶液，並加入1mL三氯乙酸，同時在室溫下攪拌混合物1小時。在真空下濃縮混合物。用Et2O研製殘餘物，並在真空下乾燥之以給出一種白色的晶狀固體。用1mL DMF溶解該固體，加入104μL(77mg,0.6 mmol)二異丙基乙胺，將混合物冷卻至0℃，並加入212mg(0.6mmol)的碘乙酸酐。移去冰浴，並在室溫下攪拌該混合物2小時。將混合物冷卻至0℃，用1N H2SO4酸化之，並在10ml 1N H2SO4和6×20mL部分的8/2 CH2Cl2/MeOH之間分配之。乾燥(MgSO4)、過濾並濃縮合併的有機層以給出330 mg的橙色油狀物。製備HPLC(25cm×22.4mM C18，梯度30％B至40％B 0-40分鐘。A=H2O/0.1％TFA。B=CH3CN/0.1％TFA,12 mL/分鐘)的純化給出19mg的化合物46(為白色固體)。
實施例22四價平臺BA/PABA/DT/TEG,51的合成N-(叔丁氧基碳醯)PABA，化合物47製備3.0g(21.9mmol)的在60mL水中的對氨基苯甲酸溶液。緩慢加入Na2CO3(2.16g,25.7mmol)，隨後加入30mL MeOH。當所有固體都溶解時，加入4.77g(21.9mmol)二叔丁基重碳酸酯(在10mL MeOH中)，並在室溫下攪拌18小時。在上述混合物中加入4.92g(25.6mmol)檸檬酸，並將所產生的混濁的混合物分配在200mL水和200mL EtOAc之間。用200mL 0.1N HCl和200mL水連續洗滌EtOAc層，乾燥(Na2SO4)、過濾並濃縮之從而產生3.0g(58％)的化合物47(為白色固體)。N-(叔丁氧基碳醯)PABA N-羥基琥珀醯亞胺基酯，化合物48在2.0g(8.43mmol)化合物47和0.97g(8.43mmol)N-羥基琥珀醯亞胺的0℃溶液(在50mL EtOAc中)中，加入DCC(2.61g,12.6mmol)。移去冰浴，在室溫下攪拌混合物16小時，並加入0.5mL乙酸。攪拌混合物附加的30分鐘，在冷凍器中放置1.5小時，過濾並濃縮之從而給出3.75g粗化合物48。矽膠層析(50/50己烷/EtOAc)的純化給出2.53g(90％)的化合物48(為白色固體)。化合物49在485μL的二亞乙基三胺溶液(在30μL CH2Cl2中，已在冰浴中冷卻)中，滴加入3.00g(8.97mmol)的化合物48(在50mL CH2Cl2中)，歷時30分鐘。在5-7℃下攪拌混合物30分鐘，然後在室溫下攪拌16小時。用200mL水將牛奶狀混合物放置在分液漏鬥中，用3M NaOH溶液將水層的pH值調整至10，並用200mL 4/1 CH3Cl/MeOH提取該混合物。乾燥(Na2SO4)有機層，並濃縮之從而給出0.971g(40％)的化合物49，該化合物純得足以用於以下步驟。用六份各100mL的4/1 CH3Cl/MeOH提取含水層。合併有機層，乾燥(Na2SO4)並濃縮之從而給出另一個1.08g(44％)的化合物49，該化合物需要進一步純化。由矽膠色譜(梯度，80/20-70/30CH3Cl/MeOH)實現進一步純化。化合物50在855mg(1.58mmol)化合物49和275μL(1.mmol)二異丙基乙胺的0℃溶液(在13mL THF中)中，加入135μL(0.66mmol)三甘醇雙氯甲酸酯溶液(在0.3mL THF中)。當移去冰浴時，混濁的混合物變清。再加入70μL二異丙基乙胺以便保持鹼性pH。在室溫下攪拌混合物共3小時，並將其分配在25mL水和25mL EtOAc之間.用第二份25mL的EtOAc提取含水層，並乾燥(Na2CO3)、過濾和濃縮合併的EtOAc層，從而給出0.986 g的粗化合物50。矽膠色譜(80/4/16 CH3Cl/二噁烷/異丙醇)的純化給出516 mg(61％)的化合物50(為一種白色固體)。製備BA/PABA/DT/TEG，化合物51將化合物50(487mg,8.79mmol)溶解在9mL CH2Cl2和5mL三氟乙酸中。攪拌混合物1.5小時並濃縮之。用7ml Et2O研製殘餘物，並將其溶解在5mL MeOH和1mL 48％HBr溶液中。濃縮混合物並將其放置在真空下直到乾燥。將所產生的HBr鹽溶解在10mL水中，並加入191mg(2.27mmol)NaHCO3。將591mg(2.27mmol)的溴乙酸酐溶液(在10mL二噁烷中)加入至混合物中。再用2mL二噁烷來衝洗。需要時加入更多的NaHCO3以保持鹼性pH。在室溫攪拌混合物2小時，並用1N H2SO4酸化之。用3×25mL EtOAc提取混合物。乾燥(Na2SO4)合併的EtOAc層，過濾並濃縮之，從而給出773mg的油狀物。由矽膠色譜(梯度，90/10-85/15CH3Cl/MeOH)實現純化，從而給出401mg(77％)的化合物51(為一種白色固體)。
實施例23四價平臺BMP/TEG,55的合成二甲基-5-羥基異鄰苯二甲酸酯，化合物52將2.00g(11mmol)5-羥基異鄰苯二甲酸和0.5mL濃鹽酸的溶液(在30mL MeOH中)回流5小時。濃縮混合物，並將所產生的殘餘物溶解在100mL EtOAC中。用兩份各50mL的5％NaHCO3溶液和兩份各50mL的NaCl溶液連續洗滌上述EtOAc溶液，乾燥(Na2CO3)、過濾並濃縮之，從而給出2.09g(90％)的化合物52(為一種白色結晶固體)。化合物53在500mg(2.38mmol)化合物52和395mg(2.86mmol)K2CO3的懸浮液(在11mL CH3CN中)中，加入546mg(1.19mmol)三甘醇二甲苯磺酸酯並在N2下回流該混合物16小時。濃縮混合物，並將殘餘物溶解在25mLCHCl3中，然後用25mL水和25mL飽和NaCl溶液洗滌之。乾燥(Na2SO4)、過濾並濃縮CHCl3層。矽膠色譜(梯度，50/50己烷/EtOAc-100％EtoAc)的純化給出93 mg(41％)的化合物53。化合物541.82mL(1.82mmol)1M LiBHEt3溶液滴加入混合物時，在N2氣氛下攪拌在4mL THF中的93mg(0.18mmol)化合物53的懸浮液。獲得一種清亮的溶液，該溶液攪拌了18小時，攪拌的同時加入10％HOAc水溶液直到pH呈酸性。在真空下濃縮混合物，並將殘餘物溶解在10mL水中。用3×10mL部分的EtOAc提取混合物，並乾燥(Na2SO4)、過濾和濃縮合併的EtOAc層。由矽膠色譜(梯度，90/10-85/15 CH3Cl/MeOH)實現純化，從而給出20mg(27％)的化合物54(為一種白色固體)。化合物55在20mg(0.048mmol)化合物54的懸浮液(在5mL Et2O和1mL THF中)中，加入9.6μL(0.1mmol)PBr3。攪拌混合物3小時，並將其分配在水和EtOAc之間。乾燥(Na2SO4)EtOAc層，過濾和濃縮之，並由矽膠色譜(CH3Cl/MeOH)純化殘餘物，從而提供了化合物55。
實施例24四價平臺BA/PIZ/IDA/TEG,60的合成化合物56在1.02g(4.37mmol)N-(叔-丁氧基碳醯)-亞氨基二乙酸(該化合物5在美國專利5,552,391，「化學限定的非聚合價平臺分子及其綴合物」中)和1.01g(8.75mmol)N-羥基琥珀醯亞胺的溶液(在50mL的幹THF中，冷卻至0℃)中，加入2.26g(10.94mmol)二環己基碳化二亞胺。在緩慢溫暖至室溫的過程中，攪拌混合物16小時。並在混合物中加入2.22g(10.1mmol)單-CBZ-哌嗪(在25mL THF中)，隨後加入1.22mL(887mg,8.75mmol)Et3N。在室溫下攪拌混合物7小時，並過濾之。濃縮濾液，並將殘餘物溶解在125mL EtOAc中，同時與2×125mL部分的1N HCl和125mL的飽和NaHCO3溶液一起振蕩，乾燥(MgSO4)、過濾並濃縮所得產物，從而給出2.39 g的粘性固體。矽膠層析(95/5；CH2Cl2/MeOH)的純化給出1.85g(66％)的化合物56。化合物57在1.74g(2.74mmol)化合物56的溶液(在10mL CH2Cl2中)中，加入10mL三氟乙酸，並在室溫下攪拌混合物3小時。濃縮混合物，並將殘餘物溶解在5mL CH2Cl2中。將混合物冷卻至0℃並加入100mL飽和NaHCO3。然後用四份各100mL的CH2Cl2提取混合物。合併CH2Cl2層，乾燥(MgSO4)、過濾並濃縮之，從而給出1.46g(99％)的化合物57(為一種粘性吸溼固體)，其直接用於下一步。化合物58在0.7g(1.3mmol)化合物57和226μL(168mg,1.30mmol)二異丙基乙胺的0℃溶液中，加入127μL三甘醇雙氯甲酸酯溶液(在4 mL CH2Cl2中)，並在室溫下攪拌混合物3小時。將混合物分配在80mL CH2Cl2和80mL 1N HCl之間。用兩份各80mL的水洗滌CH2Cl2層，乾燥(MgSO4)、過濾並濃縮之，從而給出736 mg(93％)的化合物58(為結晶固體)。化合物60將化合物58(61mg,0.48mmol)溶解在3mL 30％HBr/HOAc中，並在室溫下攪拌所產生的混合物1小時，其時加入5mL Et2O。在冰箱中放置混合物1小時並離心之。用Et2O洗滌所產生的沉澱並乾燥之，從而給出四氫溴化物鹽59，該化合物被溶解在1mL水中。在混合物中加入49mg(0.58mmol)NaHCO3和3mL二噁烷。如果需要的話，加入更多的NaHCO3以產生鹼性混合物。將混合物冷卻至0℃，並加入748mg(2.89mmol)溴乙酸酐。攪拌混合物2小時，並將其分配在20mL 1N H2SO4和20mL 80/20CH2Cl2/MeOH之間。乾燥(Na2SO4)有機層，過濾並濃縮之，從而給出粗化合物60，該化合物由矽膠色譜(CH2Cl2/MeOH)純化以給出化合物60。
實施例25四價平臺四-BAIPIZ/PMA,63的合成化合物61在640mg(2.52mmol)1,2,4,5-苯四酸和1.16g(10.1mmol)N-羥基琥珀醯亞胺的0℃溶液(在50mL THF中)中，加入2.6g(12.6mmol)二環己基碳化二亞胺，並將混合物升至室溫，其時攪拌16小時。在混合物中加入2.5g(11.3mmol)單-CBZ-哌嗪的溶液(在25mL THF中)，其後加入1.4mL(1.02g,10.1mmol)Et3N。過濾混合物，並濃縮濾液。將殘餘物分配在100mL EtOAc和2×100mL 1N HCL之間，並用100mL飽和NaHCO3、100mL水、100mL飽和NaHCO3洗滌EtOAc層，乾燥(MgSO4)、過濾並濃縮之。由矽膠色譜(97.5/2.5 CH2Cl2/MeOH)實現純化以給出1.78g(66％)的化合物61(為白色結晶固體)。化合物63以本質上與上述把58轉化成60相似的方法(在實施例23中)將化合物61轉變成化合物63，利用矽膠色譜實現純化。
實施例26四價平臺BA/PIZ/IDA/HB/TEG,68的合成化合物64在725mg(4.36mmol)4-羥基苯甲酸乙酯和723mg(5.23mmol)K2CO3的溶液中，加入三甘醇二甲苯磺酸酯(1.0g,2.18mmol)，並回流該混合物16小時。濃縮該混合物，並將殘餘物分配在20mL水和3×20mLEt2O之間，用2×40mL飽和NaHCO3溶液、40mL飽和NaCl溶液洗滌合併的有機層。用Et2O洗滌含水層，乾燥(MgSO4)合併的Et2O層，過濾並濃縮之。矽膠色譜(70/30己烷/EtOAc)的純化給出902 mg(93％)的化合物64(為結晶固體)。化合物65將化合物64溶解在包含2.2當量LiOH的丙酮中，並攪拌混合物3小時(直到為TLC所證明的完全溶解)。以乙酸酸化混合物並濃縮之，並且由矽膠色譜純化殘餘物以給出化合物65。化合物66以與實施例23中的製備化合物56的同樣的方法製備化合物66。用化合物65代替N-BOC-亞氨基二乙酸，並用化合物57代替單-CBZ-哌嗪。利用矽膠層析實現純化。化合物68以本質上與實施例23所描述的把化合物58轉化成化合物60相同的方法，將化合物66轉化成化合物68。利用矽膠層析實現純化。
實施例27四價平臺BA/PIZ/HIP/TEG,72的合成化合物69以本質上與實施例25所描述的水解化合物64相同的方法(例外情況是利用4.4當量的LiOH)，用LiOH水解化合物53。化合物70以本質上與實施例24所描述的把1,2,4,5-苯四酸轉化成化合物61相同的方法(例外情況是利用化合物69代替1,2,4,5-苯四酸)，將四酸(化合物69)轉化成化合物70。化合物72以本質上與實施例23所描述的把化合物58轉化成化合物60相同的方法，將化合物70轉化成化合物72。利用矽膠色譜實現純化。
實施例28因乙醯化的四價化合物的綴合物的合成(LJP685)4/MTU/A/DABA/ATEG綴合物，化合物73的合成在He吹洗的pH 8.5 200mM硼酸鹽緩衝液中，製備21mg(15.5μmol)化合物24的溶液。在該溶液中加入包含3.25mg(2.6μmol)IA/DABA/ATEG(化合物46，溶解在396μL MeOH中)的第二種溶液。形成沉澱，並加入1mL MeOH以溶解所有固體。在室溫下攪拌混合物18小時，並加入6mL 9/1水/HOAc。以50mL水/CH3CN稀釋混合物，並將其裝載在HPLC製備柱上。由製備HPLC(25cm×22.4mm C18。梯度35％B-40％B 0-40分鐘。A=水/0.1％TFA,B=CH3CN/0.1％TFA,12mL/分鐘)實現純化以提供10.8mg(67％)的化合物73(在冷凍乾燥之後為固體)。
合成(LJP685)4/MTU綴合物，化合物74、75、76、77和78利用與上述用於合成(通過用適當平臺化合物替代平臺化合物46)化合物73相同的反應條件，分別由化合物51、60、63、68和72製備這些綴合物。製備物可以是LJP685或者其它有關肽。
實施例29合成四價平臺55綴合物，綴合物79,(LJP685)4/MP/TEG在DMF中製備四當量化合物24和五當量Cs2C3的溶液。在混合物中加入一當量BMP/TEG，平臺化合物55，並攪拌1小時。以80/20/10水/CH3CN/HOAc稀釋混合物，並將其裝載在製備HPLC柱上。由製備HPLC(C18,A=H2O/0.1％TFA,B=CH3CN/0.1％TFA)實現純化以在冷凍乾燥之後給出化合物79。製備物可以是LJP685或者其它有關肽。
實施例30合成綴合物四價平臺四-BMB，綴合物80,(LJP685)4/MTU/四-MB在DMF中製備四當量化合物24和五當量Cs2C3的溶液。在混合物中加入一當量四-溴甲基苯，然後將其攪拌1小時。以80/20/10水/CH3CN/HOAc稀釋混合物，並將其裝載在製備HPLC柱上。由製備HPLC(C18,A=H2O/0.1％TFA,B=CH3CN/0.1％TFA)實現純化以在冷凍乾燥之後給出化合物80。製備物可以是LJP685或者其它有關肽。
實施例30:FITC-GPCILLARDRCG(CB2*)的螢光極化肽結合測定合成在室溫下攪拌環狀二硫化物肽GPCILLARDRCG(20.0mg,14.4μmol)和螢光素異硫氰酸酯(FITC)(5.6mg,14.4μmol)的溶液(在20mLACN/水中，包含20 mg碳酸鈉(Na2CO3,pH約為10.5)。由分析HPLC監控反應。在消耗螢光標記試劑之後，在以10mL/分鐘洗脫的製備HPLC(具有30至50％B的線性梯度，歷時40分鐘，其中A是在水中的0.1％(v/v)TFA,B是在CAN中的0.085％(v/v)TFA)上純化粗產物。在凍幹之後獲得一種亮黃色的FITC肽粉末(3.7mg,15％產率)MS(ESI):m/e(M+1)對於C73H102N19O20S3的計算值為1661，觀測值為1661。直接結合螢光極化結合測定(dbFP)該方法描述在PanVera應用指南(1994,PanVera公司)中。簡言之，以抗體(ACA 6501或者6701)滴定痕量螢光素異硫氰酸酯(FITC)標記的肽(CB2*-F)，並將樣品的極化與抗體濃度繪製成圖。用Pan Vera Beacon儀器測量極化。該數據適應於公式1。公式1Y=[PL*(KD/R)+PH]KD/R+1.0]]>其中Y是Y軸值(毫極化單位，mP),R是抗體受體的總濃度，PL是游離FITC標記的肽(F)的極化，PH是與R複合的F(FR)的極化，KD是F(來源與FR複合體)的離解常數(對偶結合常數)。為使這些公式有效，F＜＜R必須是真的。對於分別與ACA-6701和ACA-6501抗體結合的CB2*-F，這一滴定分別顯示在圖22和23中。如圖23所示，用ACA-6501沒有獲得完全的滴定，但是顯示在圖24中的以前的滴定給出241nM的KD。通過加入稍比抗體6701多的CB2*(GPCILLARDRCG)以從6701中置換出CB2*-F，測得CB2*-F的離解速度常數為Koff=0.0184秒-1(其對應於t1/2=38秒)。假如KD為256nM，那麼這對應於離解速度常數為Kon=3.6×104M-1秒-1(在校正為抗體雙價之後)。因此，結合到ACA-6701上的CB2*-F只受這兩個分子的共同擴散作用限制。競爭螢光極化測定(cFP)上述的dbFP測定提供了FITC標記的肽的結合常數，並需要約為0.5mg的純化的抗體。cFP測定提供了缺乏FITC基團的肽的結合常數，並且它只消耗很少的抗體(大約10μg)。cFP測定由在Pan Vera應用指南(1994,PanVera公司)中報導的測定方法修改得到，因此它消耗少50倍的抗體。簡言之，將抗體(ACA-6701)與痕量FITC標記的肽(CB2*-F)混合，用足夠時間使之達到平衡。對於ACA6701和CB2*-F，這需要1小時。然後在管中加入逐漸增加濃度的所檢驗的未標記的肽(CB2*或者3B10)。在每一次加入之後，用足夠時間(大約15分鐘)使之達到平衡，並讀取mP值。雖然需要選擇6701和CB2*-F(F)的濃度以便達到F＜＜R，但是R的濃度只需要高到足以使所測量的極化(PH)明顯比PL高(參見圖22)。這一△(mP)值應該是20或者更多個mP單位以確保獲得可靠的結果。公式2△(mP)=PH-P1當加入未標記的(無FITC的)肽(I)以抑制F與R的結合時，Y從它的最大值PH降至平頂值PL，這與公式1一致。對於分別為CB2*和3B10所置換的來源於ACA-6701的CB2*-F，這些滴定分別顯示在圖26和27中。得到描述這一滴定的公式，其如下所示公式3Y=PH+PL*(I/K1)I/KL+1.0]]>其中，PL如同公式中的PL一樣，I是未標記的肽競爭劑的濃度，K1』是該肽的表觀離解常數。通過將cFP滴定數據代入上述公式得到這些參數的值。
I的真實離解常數得自公式4。公式4K1=K1』/(1.0+R/KD)其中，R和KD如公式1所定義。R/KD利用公式5得自PH』(來源於公式3)以及PH和PL(來源於公式1)的值。公式5 R/KD=(PH』-PL)/(PH-pH』)一般來說，一旦由公式1所定義的滴定得到標準曲線，那麼公式5就可用來確定aPL抗體濃度。因此。除為確定K1提供一種手段外，這一方法還提供了使所有aPL抗體儲備液濃度標準化的一種手段以及分析(每個cFP測定在整個時間只利用5-10μg抗體)它們的結合活性/穩定性的一種手段。
由dbFP和cEP確定的離解常數肽 抗體序列 KDa或KICB2*-F 6501FITC-482nMaGPCILLARDRCGCB2*-F 6701FITC-512nMaGPCILLARDRCGCB2*6701GPCILLARDRCG 35nM3B106701AGPCLLLAPDRCPG313nMaKD值已乘以2以校正由公式1確定的在二價抗體中沒有乘以因子的KD值。
結果表明CB2*-F與兩種極為不同的aPL抗體ACA-6501和ACA-6701進行交叉反應，並以相等的高親和性與兩種抗體結合。FITC基團的除去使CB2*與ACA-6701的結合能力提高14倍。有關肽3B10與ACA-6701的結合能力比CR2*與ACA-6701的結合能力少9倍。而這一結果可能是因為在3B10上的附加的構架殘餘物所致，也可能是由於在CB2*中的位置8的由脯氨酸對精氨酸的取代所致。5A12(一種類似於3B10的肽)的NMR結構的以前研究表明位於轉角位置的這一脯氨酸給出結構剛性。CB2是更具柔性的肽，它在此位置上有精氨酸。如同CB2一樣的更具柔性的肽能夠具有更強的交叉反應，因為它更容易調整它的形狀以適合一個給定的抗體結合位點。在結合親和性方面的藥物剛性的含義已在Koehler等(251頁，在藥物設計中的分子模擬指導手冊，學院出版社，N.Cohen編輯，1996)中討論。實施例31肽綴合物的耐受活性兩種含相同肽的不同綴合物，檢驗其體內誘導抗原特異性耐受性的能力。簡言之，用連結於免疫原性載體匙孔血藍蛋白(KLH)的肽免疫接種小鼠，以便產生肽特異性記憶B細胞。三周後，利用不同劑量的檢驗綴合物處理每組小鼠(每組5隻)，其中一組小鼠不進行綴合物處理作為對照。五天後，以連結於KLH的肽加強免疫所有小鼠(包括對照組在內)，七天後，對所有小鼠取血樣並利用一種改進的Farr測定來檢測它們的血清的抗肽抗體。根據由G.M Iverson(「體內過繼免疫反應的測定」，第Ⅱ卷，第67章，實驗免疫學手冊，Blackwell科學出版社，Weir等編輯，第4版，牛津大學，1986)所描述的方法計算每一個體血清樣品的抗原結合量(ABC)。這些值隨後用於確定一組中所有個體的平均值和標準差。
當綴合物之一引起耐受性時，另一種綴合物在檢驗的劑量範圍之內並不抑制抗肽抗體。這一差別的最可能解釋是後一種綴合物具有短的體內半壽期。為解決這一問題，使用在體內誘導耐受性並由此取消對半壽期的考慮的一種系統，並把細胞轉移至擴散受體上。簡言之，收穫用連結於KLH的肽致敏的小鼠的脾細胞，並在37℃下在完全RPMI-1640培養基中用不同劑量的檢驗綴合物溫育該脾細胞2小時。一組細胞不用耐受原培養，作為陽性對照。洗滌細胞，將其轉移到擴散的同系受體上，並用連結於KLH的肽加強免疫。七天後，對所有小鼠取血樣並化驗其血清的抗肽抗體。當在體外模型中檢驗時，在體內模型中檢驗時不引起任何可檢測耐受性的綴合物的確引起耐受性。這一結果支持了綴合物之間的差別是由於綴合物具有短的半壽期的假定。為了直接驗證這一假說，在一延長的時段內通過植入滲透泵連續地施用綴合物。結果清楚地表明這一綴合物引起耐受性，這發生在通過持續釋放來施用的情況下而不是在以大丸劑施用的情況下，如圖32所示。用體內模型檢驗(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG的耐受活性在明礬加作為佐劑的百日咳上用LJP-685-KLH致敏小鼠。三周後，用-定範圍劑量的(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物處理小鼠。不用綴合物處理的一組小鼠作為對照組。五天後，以10μg的LJP685-KLH加強免疫所有小鼠(包括對照組在內)，七天後，取小鼠血樣。利用改進的上述Farr測定法來分析它們的血清的抗LJP685抗體。顯示在圖28中的結果表明利用(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物的處理(在1至50 nmoles的劑量範圍內)對抗LJP685反應沒有任何可檢測的效應。用體內模型檢驗(LJP685)4/MTU-DABA-TEG的耐受性誘導在明礬加百日咳上用LJP 685-KLH致敏小鼠。三周後，用5、10或者50 nmoles的(LJP685)4/MTU-DABA-TEG綴合物處理小鼠。其中一組不用綴合物處理，作為對照組。五天後，以10μg的LJP685-KLH加強免疫所有小鼠(包括對照組在內)，七天後，取小鼠血樣。利用改進的Farr測定法分析它們的血清的抗LJP685抗體。顯示在圖29中的結果表明(LJP685)4/MTU-DABA-TEG綴合物在體內模型中以5 nmoles的ED50誘導耐受性。用體外模型檢驗(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG的耐受性誘導收穫用LJP685-KLH致敏3周的小鼠的脾細胞，在37℃下在完全RPMI-1640培養基中用4、20或者100μM的(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物培養該脾細胞2小時。其中一組不用耐受原培養，作為對照組。洗滌細胞，將其轉移到擴散受體上，並以10μg的LJP685-KLH加強免疫。七天後，取小鼠血樣，並利用改進的Farr測定法分析它們的血清的抗LJP685抗體。顯示在圖30中的結果清楚地表明(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物可以引起耐受性，當其在體內模型中檢驗時達到IC50＜4μM。用體外模型檢驗(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG的耐受性誘導收穫用LJP685-KLH致敏3周的小鼠的脾細胞，在37℃下在完全RPMI-1640培養基中用0.4、1.3或者4μM的(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物培養該脾細胞2小時。其中一組不用耐受原培養，作為對照組。洗滌細胞，將其轉移到擴散受體上，並以10μg的LJP685-KLH加強免疫。七天後，取小鼠血樣，並利用改進的Farr測定法分析它們的血清的抗LJP685抗體。顯示在圖31中的結果清楚地表明(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物可以引起耐受性，當其在體內模型中檢驗時達到IC50＜4μM。利用連續輸送泵體內檢驗(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物的耐受性誘導小鼠在明礬加百日咳上用LJP685-KLH致敏。三周後，將小鼠分成5組，每組五隻小鼠。在第一天，一組用鹽水丸劑處理，另一組用包含50 nmole(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物的丸劑處理。餘下的三組用滲透泵植入。在一組中，泵用鹽水充滿，並以1μL/小時的速度釋放3天。餘下的兩組接收裝滿(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物(50nmole)的泵。一組接收以1μL/小時的速度釋放三天的泵，其它組接收以0.5μL/小時的速度釋放七天的泵。在第5天，以外科手術移去釋放三天的泵。在第七天，以10μg的LJP685-KLH加強免疫所有小鼠(包括對照組)。在第10天，以外科手術移去釋放七天的泵。在第14天，取所有小鼠血樣。利用改進的Farr測定法分析它們的血清的抗LJP685抗體。結果顯示在圖32中。用體內模型檢驗(LJP-肽)4/MTU-BMP-TEG綴合物的耐受性誘導在明礬加百日咳上用LJP685-KLH致敏小鼠。三周後，用(LJP-肽)4/MTU-BMP-TEG綴合物處理小鼠，其中一組不用綴合物處理作為對照組。五天後，以10μg的肽-KLH加強免疫所有小鼠(包括對照組)，七天後，取小鼠血樣。利用改進的Farr測定法加強免疫它們的血清的抗肽抗體。結果表明在體內模型中，(LJP-肽)4/MTU-BMP-TEG綴合物以等於或大於(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG綴合物的效力誘導耐受性。
權利要求
1．一種aPL類似物，其特異性結合到B細胞上，aPL表位結合到所說的B細胞上。
2．權利要求1的類似物，其中所說的類似物缺少T細胞表位。
3．權利要求1的類似物，其中所說的類似物是肽。
4．權利要求3的類似物，其中所說的肽包括序列CLILAPDRC、CLILTPDRC、CLLLAPDRC、CTILTLDRC、CLVLALDRC、CTILTPDRC、CILLAHDRC、CGNAADARC、CTNWADPRC、CGNIADPRC、CTNLTDSRC、CGNPTDVRC、GILLNEFA、GILTIDNL、GILNALDYV、LSDPGYVRNIFH或LTDPRYTRDISNFTD。
5．權利要求3的肽類似物，其中所說的肽包括序列AGPCLGVLGKLCPG、GPCLGVLGKLCPG、PCLGVLGKLCPG、CLGVLGKLCPG、AGPCLGVLGKLCG、CLGVLGKLC、GPCILLARDRCG或AGPILLATDTCPG。
6．權利要求3的類似物，其中所說的肽含有至少一個脯氨酸，並且其中α-甲基脯氨酸取代了至少一個所說的脯氨酸。
7．權利要求3的類似物，其中D-胺基酸取代了至少一個L-胺基酸。
8．權利要求3的類似物，其中所說的肽是被二硫鍵環化的。
9．權利要求8的類似物，其中硫醚鍵取代了二硫鍵。
10．權利要求3的類似物，其中所說的肽包含至少一個亮氨酸，並且其中異亮氨酸取代了至少一個所說的亮氨酸。
11．一種誘導特異性B細胞耐受aPL免疫原的組合物，該組合物包含非免疫原性效價平臺分子和aPL抗體結合類似物，所說的抗體結合類似物(a)特異性結合aPL免疫原結合於其上的B細胞和(b)缺少免疫原的T細胞表位。
12．權利要求11的組合物，其中所說的aPL抗體結合類似物是包含以下序列的肽CLILAPDRC、CLILTPDRC、CLLLAPDRC、CTILTLDRC、CLVLALDRC、CTILTPDRC、CILLAHDRC、CGNAADARC、CTNWADPRC、CGNIADPRC、CTNLTDSRC、CGNPTDVRC、GILLNEFA、GILTIDNL、GILNALDYV、LSDPGYVRNIFH或LTDPRYTRDISNFTD。
13．權利要求11的組合物，其中所說的aPL抗體結合類似物是包含以下序列的肽AGPCLGVLGKLCPG、GPCLGVLGKLCPG、PCLGVLGKLCPG、CLGVLGKLCPG、AGPCLGVLGKLCG、CLGVLGKLC、GPCILLARDRCG或5AGPILLARDRCPG。
14．權利要求11的組合物，其中所說的aPL抗體結合類似物是按照權利要求6的類似物。
15．權利要求11的組合物，其中所說的aPL抗體結合類似物是按照權利要求7的類似物。
16．權利要求11的組合物，其中所說的aPL抗體結合類似物是按照權利要求8的類似物。
17．權利要求11的組合物，其中所說的aPL抗體結合類似物是按照權利要求9的類似物。
18．權利要求11的組合物，其中所說的aPL抗體結合類似物是按照權利要求10的類似物。
19．權利要求11的組合物，其中所說的非免疫原性效價平臺分子包括三甘醇。
20．權利要求19的組合物，其中所說的效價平臺分子包括AHAB-TEG。
21．權利要求19的組合物，其中所說的效價平臺分子包括化合物46,A-DABA-ATEG。
22．權利要求19的組合物，其中所說的效價平臺分子包括化合物51,A-PABA-DT-TEG。
23．權利要求19的組合物，其中所說的效價平臺分子化合物55,MP-TEG。
24．權利要求19的組合物，其中所說的效價平臺分子包括化合物60,A-PIZ-IDA-TEG。
25．權利要求19的組合物，其中所說的效價平臺分子包括化合物68,A-PIZ-IDA-HB-TEG。
26．權利要求19的組合物，其中所說的效價平臺分子包括化合物72,A-PIZ-MP-TEG。
27．權利要求11的組合物，其中所說的非免疫原性效價平臺分子包括聚乙二醇。
28．權利要求28的組合物，其中所說的效價平臺分子包括DABA-PEG。
29．權利要求11的組合物，其中所說的非免疫原性效價平臺分子包括四氨基苯。
30．權利要求11的組合物，其中所說的非免疫原性效價平臺分子包括七氨基β-環糊精。
31．權利要求11的組合物，其中所說的非免疫原性效價平臺分子包括四氨基季戊四醇。
32．權利要求11的組合物，其中所說的非免疫原性效價平臺分子包括1,4,8,11-四氮雜環十四烷(Cyclam)。
33．權利要求11的組合物，其中所說的非免疫原性效價平臺分子包括1,4,7,10-四氮雜環十二烷(Cyclen)。
34．權利要求11的組合物，其中所說的非免疫原性效價平臺分子包括化合物63，四-A-PIZ-PMA。
35．權利要求11的組合物，其中所說的非免疫原性效價平臺分子包括化合物55,MP-TEG。
36．權利要求11的組合物，其中所說的綴合物得自四-BMB。
37．一種非免疫原性效價平臺分子，其包括AHAB-TEG。
38．一種非免疫原性效價平臺分子，其包括化合物46,IA-DABA-ATEG。
39．一種非免疫原性效價平臺分子，其包括化合物51,BA-PABA-DT-TEG。
40．一種非免疫原性效價平臺分子，其包括化合物55,BMP-TEG。
41．一種非免疫原性效價平臺分子，其包括化合物60,BA-PIZ-IDA-TEG。
42．一種非免疫原性效價平臺分子，其包括化合物68,BA-PIZ-IDA-HB-TEG。
43．一種非免疫原性效價平臺分子，其包括化合物72,BA-PIZ-HIP-TEG。
44．一種非免疫原性效價平臺分子，其包括化合物63，四-BA-PIZ-PMA。
45．一種治療患有aPL抗體介導的疾病的患者的方法，其包括給其所需個體施用有效量的權利要求11組合物。
46．權利要求45的方法，其中所說的aPL抗體介導的疾病是中風。
47．權利要求45的方法，其中所說的aPL抗體介導的疾病是流產。
48．權利要求45的方法，其中所說的aPL抗體介導的疾病是抗磷脂抗體綜合症(APS)。
49．權利要求45的方法，其中所說的aPL抗體介導的疾病是原發性抗磷脂抗體綜合症(PAPS)。
50．權利要求45的方法，其中所說的aPL抗體介導的疾病是血栓形成。
51．一種用於鑑別特異性地與自患有aPL抗體介導的疾病的人體分離得到的aPL抗體結合的表位之類似物的方法，該方法包括(a)製備噬菌體隨機肽文庫；(b)篩選所說的具有aPL抗體的文庫，以鑑別aPL模擬肽，其中所說的篩選包括(ⅰ)通過生物淘選篩選所說的文庫；(ⅱ)通過微量淘選進一步篩選在(ⅰ)中的由生物淘選分離得到的噬菌體；以及(ⅲ)通過免疫測定鑑別包含在(ⅱ)中回收的aPL抗體高親和性結合肽的噬菌體。
52．一種生物淘選噬菌體隨機肽文庫以鑑別和分離結合到aPL抗體上的肽的方法，該方法包括(a)使親和純化的aPL抗體與攜帶隨機肽插入片段的噬菌體反應；(b)回收攜帶有結合到aPL抗體上的隨機肽插入片段的噬菌體；(c)用在(b)中回收的噬菌體感染微生物；以及(d)在包含抗生素的培養基中培養感染過的微生物以分離噬菌體。
53．一種微量淘選噬菌體隨機肽文庫以鑑別和分離對aPL抗體有高結合親和性的肽的方法，該方法包括(a)通過生物淘選分離攜帶隨機肽插入片段的噬菌體；(b)在塗布有結合到蛋白質G上的aPL抗體的微量板孔中培養在步驟(a)中回收的噬菌體；(c)洗滌微量板孔，以除去未結合的噬菌體，(d)洗脫結合的噬菌體；和(e)用在(d)中回收的噬菌體感染微生物；以及(f)在包含抗生素的培養基中培養感染過的微生物以分離噬菌體。
54．權利要求51的方法，其中所說的免疫測定是噬菌體俘獲ELISA，其包括(a)在塗布有aPL抗體的微量板孔中培養經微量淘選分離的攜帶隨機肽插入片段的噬菌體；(b)洗掉未結合的噬菌體；(c)在孔中溫育標記的抗噬菌體抗體；(d)洗掉未結合的標記的抗噬菌體抗體；(e)添加標記底物；以及(f)測量底物的信號發展以鑑別高親和性結合的噬菌體。
55．權利要求54的方法，其中所說的標記是酶。
56．權利要求的54的方法，其中所說的底物是比色的。
57．權利要求54的方法，該方法還包括進行高親和性結合噬菌體的附加的噬菌體俘獲ELISA測定，其包括(a)在微量板孔上塗布上相同數量的噬菌體；(b)在孔中溫育aPL抗體；(c)洗掉未結合的抗體；(e)將結合的aPL抗體與標記的抗aPL抗體一起溫育；(f)洗掉未結合的標記的抗-aPL抗體；(g)將底物添加至孔中；以及(h)測量底物的信號發展以測量噬菌體的相對結合親和性。
58．權利要求57的方法，其中所說的標記是酶。
59．權利要求57的方法，其中所說的底物是比色的。
60．權利要求51的方法，其中所說的免疫測定是菌落印跡免疫測定，其包括(a)在包含瓊脂的培養基頂部的膜上培養受攜帶隨機肽插入片段的噬菌體感染的微生物；(b)通過在包含瓊脂的培養基頂部的膜上印跡微生物來重複轉移在(a)中培養的微生物；(c)培養轉移的微生物；(d)裂解所說的微生物；(e)消化所說的微生物；(f)封阻上述膜；(g)將上述膜與aPL抗體一起溫育；(h)洗掉未結合的aPL抗體；(i)將標記的抗-aPL抗體與上述膜一起溫育；(j)洗掉未結合的標記的抗-aPL抗體；(k)添加底物；以及(l)測量底物的信號發展以鑑別高親和性結合的噬菌體。
61．權利要求60的方法，其中所說的膜是硝酸纖維素。
62．權利要求60的方法，其中所說的微生物用溶菌酶消化。
63．權利要求60的方法，其中所說的封阻液是明膠。
64．權利要求60的方法，其中所說的標記是酶。
65．權利要求60的方法，其中所說的底物是比色的。
66．一種用於測定和分級親和結合特徵表位的方法，所說的表位特異性結合分離自患有aPL抗體介導的疾病的患者的aPL抗體，該方法包括(a)用心磷脂塗布微量滴定板的孔；(b)添加成年牛或人類血清，其作為結合到心磷脂上的β2-GPI源，並阻止非特異性結合到平板的孔上；(c)溫育單體類似物和高滴度aPL抗體溶液一段預定的時間；(d)向微量滴定板孔中添加aPL抗體/類似物混合物並溫育一段預定的時間；(e)洗滌孔以洗掉未結合的aPL抗體；(f)將與標記綴合的抗人IgG添加到平板孔中，溫育一段預定的時間；(g)洗滌孔以洗掉未結合的抗人IgG綴合物；(h)添加標記的綴合物的底物，將底物/標記反應進行一段預定的時間；(i)測量底物/標記反應的最終-產物，並定量結合至孔上的aPL抗體的量；(j)計算aPL抗體結合的抑制(如果有的話)百分比，以確定類似物對aPL抗體的親和性。
67．權利要求66的方法，其中所說的綴合物是用酶標記的。
68．權利要求66的方法，其中所說的底物是比色的。
69．一種用於確定體液中aPL抗體存在的診斷免疫測定法，上述體液得自懷疑患有aPL抗體介導的的疾病的患者，該測定法包括(a)將特異性結合aPL抗體的表位類似物與體液樣品接觸，(b)檢測與上述類似物結合的aPL抗體。
70．權利要求69的免疫測定法，其中所說的免疫測定法包括(a)將特異性結合aPL抗體的表位的類似物塗布在微量滴定板的孔上；(b)洗滌孔以洗掉未結合的類似物；(c)將一種體液試驗樣品添加至孔中，並溫育一段預定的時間；(d)洗滌孔以除去未結合的試驗樣品；(e)將與標記綴合的抗人IgG添加到平板孔中，溫育一段預定的時間；(f)洗滌孔以洗掉未結合的抗人IgG綴合物；(g)添加標記的綴合物的底物，並將底物/標記反應進行一段預定的時間；(h)測量底物/標記反應的最終-產物，以確定抗-aPL抗體在試驗樣品中的存在。
71．權利要求70的免疫測定法，其中所說的標記是酶，並且所說的底物是比色的。
72．用於將肽或其它生物活性分子與效價平臺分子連接起來的具有下式的親水接頭；R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2其中n=0-200；m=0-10；R1=H或如三苯甲基的保護基；R2=H或烷基或如4-硝基苯基酯的芳基。
73．權利要求72的接頭，其中m=0或2。
74．權利要求11的綴合物，其中所說的aPL類似物通過包含巰基的部分與非免疫性效價平臺分子結合。
全文摘要
本文公開了(a)特異性結合B細胞(aPL表位與其結合)的aPL類似物。無T細胞表位的優化類似物作為治療aPL抗體介導的疾病的綴合物是有用的。本文提供了作為新的非免疫性效價平臺分子和接頭的、包含aPL類似物和非免疫性效價平臺分子的綴合物。本文也公開了製備和鑑別所說的類似物的方法、利用所說的類似物的治療方法、製備所說的類似物的綴合物的方法和組合物以及aPL抗體的診斷免疫測定法。
文檔編號C07K7/50GK1225015SQ97196260
公開日1999年8月4日 申請日期1997年6月6日 優先權日1997年6月6日
發明者E·J·維多利亞, D·M·馬奎斯, D·S·瓊斯, L·於 申請人:拉卓拉藥物公司