使用四稜錐鏡產生結構照明的螢光顯微方法和裝置的製作方法

2023-11-30 16:00:46 1

專利名稱：使用四稜錐鏡產生結構照明的螢光顯微方法和裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種螢光顯微方法及裝置。
背景技術：
自從17世紀荷蘭科學家Leeuwenhoek發明了首臺光學顯微鏡並用它觀察微生物 以來，光學顯微技術以其速度快、非接觸、可探測樣品內部等優點，一直是研究活細胞生命 現象的主流方法。光學顯微技術根據探測模式可分為兩大類點掃描成像技術和寬場成像 技術。以雷射共聚焦螢光顯微為代表的點掃描成像技術用高度聚焦的雷射束對樣品逐點掃 描成像，螢光信號經過探測針孔濾波後被光電倍增管探測收集，通過軟體可以重新組合生 成一個三維圖像。在掃描過程中，探測針孔會擋住離焦部分的螢光信號而只讓焦點處的熒 光信號通過並被探測器接收，大部分的螢光信號不會被探測但是依然會對樣品產生漂白作 用(這種情況在3D成像時尤為明顯)。這樣一來，逐點掃描完整個樣品有可能會產生嚴重 的光漂白效應，而且有可能對活體生物組織帶來損傷。寬場成像技術就是「面成像」，採用面 陣圖像傳感器(如CCD相機)，可以在一個時間點獲得一幅完整的二維圖像，與點掃描成像 比，寬場成像技術具有速度快、光漂白效應弱，圖像灰度級高等優點。但是由於受樣品離焦 部分的幹擾，普通的寬場成像技術不具有三維層析成像能力。1997年，牛灃大學Neil等人 提出一種結構照明顯微(Structured Illumination Microscopy,SIM)技術，極大地增強了 寬場顯微鏡的軸向解析度，具有三維層析成像能力。其原理是在非相干成像過程中，只有 圖像的零頻信號隨著離焦而保持不變，其它頻率信號會隨著離焦而迅速衰減。因此在實驗 中可以使用具有固定空間頻率的結構光場激發樣品，這樣一來，只有焦平面處樣品才可以 清晰成像，離焦時結構照明光場會迅速衰減。缺點是採集到的圖像將不可避免地帶有結構 光場的條紋圖案，但該條紋圖案可以通過圖像處理算法而被消除。通過每次平移結構照明 光場三分之一個條紋周期，使CXD曝光得到三幅子圖像I。，I120, 124tl，將三幅子圖像通過公式
Ix(y^) = Wo -Inof+(Ino -I2J2+(h4o _/。)2)]/2⑴計算，最後可以得到焦平面處沒有條紋背景的層析圖像Ix(y，ζ)。普通結構照明顯微技術通常使用非相干光源照明一個一維正弦光柵，用同一個顯 微物鏡將光柵微縮成像在樣品上並且同時採集圖像，通過電控平移臺平移光柵可以移動作 用在樣品上的光柵相位，同時控制CXD曝光得到三幅子圖像Itl, I12tl, I24tl，再通過公式(1)的 運算，得到樣品的層析圖。但是當待觀測樣品比較厚時，普通的結構照明顯微光場將會產生 比較大的畸變，為後期的圖像處理帶來困難。另外普通結構照明顯微技術使用光柵微縮成 像產生結構照明光，振幅型光柵的透過率理論上最大只有50%，因此光能利用率不高。

發明內容
本發明提出一種使用四稜錐鏡產生四光束幹涉場進行結構照明顯微的方法和裝 置，其解決了現有結構照明顯微技術光場畸變大、光能利用率低的技術問題。
本發明的技術解決方案為一種使用四稜錐鏡產生結構照明的螢光顯微方法，包括以下步驟步驟1]雷射器1發出的一束平行光經擴束準直器2後，沿四稜錐鏡3的底面垂直 入射，在四稜錐鏡3後方放置透鏡Ld和透鏡L25，透鏡Ld和透鏡L25組成望遠鏡系統，在 透鏡L25後方放置一玻璃片6，在玻璃片6後方形成四光束幹涉光場；步驟2]經螢光染料標記的樣品放置於四光束幹涉光場中； 步驟3]通過繞χ軸轉動玻璃片6與XY平面之間的夾角，依次改變YZ平面內子光 束k2與k4之間的相位差，每次改變三分之一波長相位差，CCD相機11同時通過顯微物鏡9 分別採集YZ平面內三幅不同相位的二維切面圖像(Itl, I12tl, I24tl)並存儲在計算機12中；再
通過圖像運算/辦ζ)=似。-/120)2+(/120 -/240)2 +(/240 -urn，可以得到樣品的層析 圖像 Ix(y，z)；步驟4]沿χ軸方向垂直移動顯微物鏡9並重複步驟3]，得到樣品其它層的二維層 析圖，最終得到樣品完整的三維螢光圖像信息I (X，1，Z)。為了調整軸向解析度，可以改變望遠鏡系統的擴束比來改變四光束幹涉光場強度 分布周期，從而改變系統的軸向解析度。一種使用四稜錐鏡產生結構照明的螢光顯微裝置，包括雷射器1、結構照明系統、 樣品池8和圖像採集系統，其特徵在於所述結構照明系統包括擴束準直器2、四稜錐鏡3 和玻璃片6，所述擴束準直器2可將雷射器1發出的平行光擴束後垂直入射至四稜錐鏡3的 底面；所述樣品池8放置在四稜錐鏡3後方的幹涉區域，所述玻璃片6放置在四稜錐鏡3和 樣品池8之間。上述螢光顯微裝置還包括放置在四稜錐鏡3和樣品池8之間的透鏡L1 (4)和透鏡 L25，所述透鏡U4和透鏡L25構成望遠鏡系統，所述玻璃片6放置在透鏡L25和樣品池8之 間。上述圖像採集系統包括依次設置在樣品池8上方的顯微物鏡9、濾光片10、(XD相 機11以及計算機12。本發明的特點為1、本發明平行光束經過四稜錐鏡後會發生折射，在四稜錐鏡後的光束重疊區內會 產生四光束幹涉場，形成具有二維空間強度分布的結構照明光場。2、由於本發明光場是通過四束對稱平行光束幹涉形成，所以幹涉場強度分布具有 二維周期結構，並且幹涉極大強度是幹涉前單束光強度的16倍。3、只要在四束光的幹涉區域都會存在幹涉極大，這樣產生的光場就具有類似於貝 塞爾光場的非衍射特性。當樣品位於幹涉光場內部時，不會由於樣品的阻擋而使得樣品後 方的幹涉極大消失，因此具有很大的穿透深度。並且由於光場是通過四光束幹涉形成，幹涉 極大處的光強度是幹涉前單束光強度的16倍。因此可以減少入射雷射的總功率，與普通結 構照明顯微技術相比，可以降低成像過程中對整體樣品的光損傷。4、本發明採用固定空間頻率的幹涉場激發樣品，因此圖像畸變效應微弱。四光束 幹涉場具有光強空間二維周期分布圖案，光場條紋周期△ = X/2nSin(e/2)，其中λ是 雷射波長，η是樣品折射率，θ是幹涉子光束的夾角。理論上，四光束幹涉場結構照明顯微系統的軸向(指X軸)點擴散函數(PSF)可以看作是幹涉場的X軸強度分布與顯微物鏡軸 向點擴散函數的乘積，幹涉場的X軸向強度分布周期可以通過控制幹涉子光束的夾角來控 制，最小可以達到λ/2η。通過改變四光束幹涉場的軸向周期可以得到比普通結構照明顯微 更高的軸向解析度。


圖1(a)為四稜錐鏡產生四光束幹涉示意圖，(b)是四光束幹涉形成的光場強度空 間分布計算結果圖；圖2為使用四稜錐鏡和望遠鏡系統產生四光束幹涉的原理示意圖；圖3為使用四稜錐鏡產生結構照明螢光顯微光路示意圖；附圖標記如下1-雷射器，2-擴束準直器，3-四稜錐鏡，4-透鏡L1, 5-透鏡L2,6-玻 璃片，7-載物臺，8-樣品池，9-顯微物鏡，10-濾光片，Il-CXD相機，12-計算機。圖4為中華大鼠卵巢(CHO)細胞螢光顯微三維層析圖，其中(a)-(d)為使用四光 束幹涉光場照明樣品得到的不同深度層析圖，(e)-(h)是與(a)-(d)對應的相同位置的普 通寬場螢光圖。標尺為10微米，層間距=1.75微米。圖5為果蠅複眼的自發螢光顯微三維層析圖，其中(a)-(f)為使用四光束幹涉光 場照明樣品得到的不同深度層析圖，(g)-(l)是與(a)-(f)對應的相同位置的普通寬場熒 光圖。標尺為20微米，層間距=20微米。
具體實施例方式一種使用四稜錐鏡產生結構照明的螢光顯微方法，包括以下步驟步驟1]雷射器1發出的一束平行光經擴束準直器2後，沿四稜錐鏡3的底面垂直 入射，在四稜錐鏡3後方放置透鏡Ld和透鏡L25，透鏡Ld和透鏡L25組成望遠鏡系統，在 透鏡L25後方放置一玻璃片6，在玻璃片6後方形成四光束幹涉光場；步驟2]經螢光染料標記的樣品放置於四光束幹涉光場中；步驟3]通過繞χ軸轉動玻璃片6與XY平面之間的夾角，依次改變YZ平面內子光 束k2與k4之間的相位差，每次改變三分之一波長相位差，CCD相機11同時通過顯微物鏡9 分別採集YZ平面內三幅不同相位的二維切面圖像(Itl, I12tl, I24tl)並存儲在計算機12中；再
通過圖像運算/加)=風-inof+(in0-I2J2Hi240 -hfm，可以得到樣品的層析 圖像 Ix(y，z)；步驟4]沿χ軸方向垂直移動顯微物鏡9並重複步驟3]，得到樣品其它層的二維層 析圖，最終得到樣品完整的三維螢光圖像信息I U，y，ζ)。為了調整軸向解析度，可以改變望遠鏡系統的擴束比來改變四光束幹涉光場強度 分布周期，從而改變系統的軸向解析度。一種使用四稜錐鏡產生結構照明的螢光顯微裝置，包括雷射器1、結構照明系統、 樣品池8和圖像採集系統；結構照明系統包括擴束準直器2、四稜錐鏡3、望遠鏡系統和玻璃片6，擴束準直器 2可將雷射器1發出的平行光擴束後垂直入射至四稜錐鏡3的底面；樣品池8放置在四稜錐鏡3後方的幹涉區域，望遠鏡系統為放置在四稜錐鏡3和樣品池8之間的透鏡Ld和透 鏡L25，玻璃片6放置在透鏡L25和樣品池8之間。圖像採集系統包括依次設置在樣品池8上方的顯微物鏡9、濾光片10、CXD相機11 以及計算機12。本發明原理本發明提出一種使用四稜錐鏡產生四光束幹涉場進行結構照明顯微的方法和裝 置。如圖1(a)所示，雷射束經擴束準直後正入射四稜錐鏡的底面，在四個側面上入射光被 折射，形成四束與光軸夾角相同的對稱分布子光束，並且它們的振幅和初相位也都相同。在 稜錐鏡的後面，它們有一段相交的區域，在此形成具有二維(XY平面內)空間強度分布的四 光束幹涉場，如圖1(b)所示。當螢光染料標記的樣品位於該幹涉光場時，將會被該光場激 發。改變子光束的相位差可以平移幹涉圖案的空間位置，再利用與普通結構照明顯微同樣 的方法得到三幅子圖像(在YZ平面內)，同樣再通過公式(1)的運算，可以得到樣品的層析 圖像 Ix(y，ζ)。幹涉區的長度為 結構照明光場條紋的周期為 Λ義 其中W0是入射平行光束的半徑，Iitl是四稜錐鏡材料的折射率，是四稜錐鏡的底角， 是雷射波長，i是入射平行光束通過四稜錐鏡後的發散角(如圖2中所示)。在結構照明顯微中，通常會引入一個參數J = ^77來表徵系統的軸向解析度，Δ
A-NA
是結構照明光條紋的周期，NA是物鏡的數值孔徑。J = O代表普通的寬場顯微，系統的軸向 解析度最差W = 1時系統的軸向解析度最好，和相同NA時的共聚焦顯微類似。改變結構照 明光場周期△可以改變J。由公式(3)可以看出，一旦四稜錐鏡的底角和雷射波長固定，那 麼結構照明光場周期△也就固定了。為了在實驗中改變結構照明光場周期△，我們在四稜 錐鏡後放置了一對透鏡L1和L2,如圖2所示(YZ平面內)。L1和L2組成一個望遠鏡系統， 利用幾何光學原理可以得到 從公式(4)可以看出，通過改變望遠鏡系統的擴束比f2/f1;可以改變光束的夾角 22，從而改變結構照明光場周期。另外，由於實驗中待測樣品必須位於幹涉區內，而幹涉區的長度有限並且緊靠著 四稜錐鏡，所以實驗中往往沒有足夠的空間來放置樣品臺。L1和L2組成的望遠鏡系統還可 以將幹涉區域移動到遠離光學元件的位置，方便樣品的放置。利用圖2中的幾何關係還可 以得到 h = W0-Cl1 tan θ jθ i = (no-l) y(5)其中Zmax是光束幹涉區最遠端距離透鏡L2的距離；Zmin是光束幹涉區最前端距離 透鏡L2的距離；θ工是入射平行光束通過四稜錐鏡後的發散角；θ 2是從透鏡L2出射光線的 發散角；f\是透鏡L1的焦距；f2是透鏡L2的焦距；屯是四稜錐鏡和透鏡L1之間的距離；h是 光束入射到透鏡L1上的半徑。實施例實驗中選用底角=7°的四稜錐鏡，材料折射率Iitl = 1.5，雷射波長= 532nm,入射雷射束的半徑Wtl = 1. 5mm,透鏡L1的焦距= 125mm,透鏡L2的焦距f2 = 50mm, (I1 = 5謹。代入公式(3-5)可得到，結構照明光場周期Δ = 1. 75m,Zmax = 77謹，Zmin = 73謹。 這樣極大地增加了系統的工作距離，方便了樣品臺及顯微物鏡等部件的放置。如圖2所示(YZ平面內)，在透鏡L2後放置一個厚度為t，折射率為Ii1的玻璃片。 玻璃片不會改變光束的角度，但是會給參與幹涉的光束k2與k4之間產生一個相位差δΜ^----w^l(6)
A h0S(々 +終)οο^β-θ2))通過繞χ軸轉動玻璃片傾角(玻璃片與XY平面的夾角)，可以改變光束k2與k4之 間的相位差，從而可以在YZ平面內平移結構照明光場條紋的空間位置。此時同步控制CCD， 可以得到三幅不同相位幹涉場照明的子圖像Ici, 112(1，I24。，再通過公式⑴的運算，可以得到 樣品的層析圖。本發明的工作方式本發明的具體實驗光路如圖3所示，探測光路與激發光路獨立並且相互垂直。經 螢光染料標記的樣品放置於圖中的陰影區內，通過四光束幹涉可以在樣品內產生結構照明 光場，該結構照明光場會在樣品內激發出螢光。通過旋轉玻璃片(6)的傾角，可以移動結構 照明光場(YZ平面內)幹涉條紋的相位，同步控制CCD得到三幅子圖像Itl, I120, I240存入計 算機(12)，再通過公式(1)的運算，可以得到樣品的層析圖。垂直移動(沿X軸方向)顯微 物鏡並重複上述步驟，可以得到樣品其它層的二維切面圖。最後通過軟體可以重新組合得 到樣品完整的三維螢光圖像信息。實施例-本發明應用於活體生物樣品的螢光成像圖4是本發明裝置對經過螢光染料碘化丙啶(Propidium iodide)標記的活體中 華大鼠卵巢(CHO)細胞的螢光成像，圖中標尺為10微米。實驗中使用40X顯微物鏡，NA = 0. 85，雷射器為倍頻的YAG雷射器，波長532nm，CXD曝光時間0. 02秒。圖4(a)-(d)為使 用四光束幹涉光場照明樣品得到的樣品內部不同深度的層析圖，層間隔為=1.75微米。圖 4(e)-(h)是與(a)-(d)對應的相同位置的寬場螢光圖。通過比較可以看到，四光束幹涉光 場照明得到的螢光圖像比普通的寬場螢光圖像具有更高的信噪比和更小的層間串擾。圖5是使用本發明裝置拍攝的果蠅複眼的自發螢光顯微圖像，圖中標尺為20微米。果蠅複眼在532nm雷射激發下可發出強烈的自發螢光。實驗中使用20X顯微物鏡，NA =0.6，CCD曝光時間0.02秒。圖5(a)-(f)為使用四光束幹涉光場照明樣品得到的不同位 置的層析圖，層間隔為=20微米。圖5(g)-(l)是與(a)-(f)對應的相同位置的寬場螢光 圖。很明顯，使用四光束幹涉結構照明方式，幾乎沒有背景噪聲的幹擾，圖像對比度比寬場 螢光圖高得多。
權利要求
一種使用四稜錐鏡產生結構照明的螢光顯微方法，其特徵在於其包括以下步驟步驟1]雷射器(1)發出的一束平行光經擴束準直器(2)後，沿四稜錐鏡(3)的底面垂直入射，在四稜錐鏡(3)後方放置透鏡L1(4)和透鏡L2(5)，透鏡L1(4)和透鏡L2(5)組成望遠鏡系統，在透鏡L2(5)後方放置一玻璃片(6)，在玻璃片(6)後方形成四光束幹涉光場；步驟2]經螢光染料標記的樣品放置於四光束幹涉光場中；步驟3]通過繞x軸轉動玻璃片(6)與XY平面之間的夾角，依次改變YZ平面內子光束k2與k4之間的相位差，每次改變三分之一波長相位差，CCD相機(11)同時通過顯微物鏡(9)分別採集YZ平面內三幅不同相位的二維切面圖像(I0，I120，I240)並存儲在計算機(12)中；再通過圖像運算可以得到樣品的層析圖像Ix(y，z)；步驟4]沿x軸方向垂直移動顯微物鏡(9)並重複步驟3]，得到樣品其它層的二維層析圖，最終得到樣品完整的三維螢光圖像信息I(x，y，z)。FDA0000023071980000011.tif
2.根據權利要求1所述的使用四稜錐鏡產生結構照明的螢光顯微方法，其特徵在於 其還包括調整軸向解析度的步驟改變望遠鏡系統的擴束比可以改變四光束幹涉光場強度分布周期，從而改變系統的軸 向解析度。
3.一種使用四稜錐鏡產生結構照明的螢光顯微裝置，包括雷射器(1)、結構照明系統、 樣品池(8)和圖像採集系統，其特徵在於所述結構照明系統包括擴束準直器(2)、四稜錐 鏡(3)和玻璃片(6)，所述擴束準直器(2)可將雷射器(1)發出的平行光擴束後垂直入射 至四稜錐鏡(3)的底面；所述樣品池(8)放置在四稜錐鏡(3)後方的幹涉區域，所述玻璃片 (6)放置在四稜錐鏡(3)和樣品池⑶之間。
4.根據權利要求3所述的使用四稜錐鏡產生結構照明的螢光顯微裝置，其特徵在於 所述螢光顯微裝置包括放置在四稜錐鏡⑶和樣品池⑶之間的透鏡LJ4)和透鏡L2(5)， 所述透鏡L1 (4)和透鏡L2 (5)構成望遠鏡系統，所述玻璃片(6)放置在透鏡L2 (5)和樣品池 ⑶之間。
5.根據權利要求4所述的使用四稜錐鏡產生結構照明的螢光顯微裝置，其特徵在於 所述圖像採集系統包括依次設置在樣品池(8)上方的顯微物鏡(9)、濾光片(10)、CCD相機 (11)以及計算機(12)。
全文摘要
本發明提出一種使用四稜錐鏡進行結構照明螢光顯微的方法和裝置。裝置包括平行光束、結構照明系統、樣品池和圖像採集系統。結構照明系統由四稜錐鏡，望遠鏡系統和相移玻璃片組成；樣品池放置在相移玻璃片後方。平行光束經過四稜錐鏡後發生折射，並產生具有二維空間結構分布的四光束幹涉場。樣品被該光場激發。平移作用在樣品上的幹涉光場並通過圖像處理算法，可以實現三維層析成像。與現有結構照明顯微技術相比，本發明具有更高的軸向解析度和更低的光漂白效應，適用於活體生物的成像研究。
文檔編號G02B21/06GK101893755SQ201010218778
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月6日 優先權日2010年7月6日
發明者葉彤, 姚保利, 雷銘 申請人:中國科學院西安光學精密機械研究所