鏈黴菌菌株spc6-50-1的誘變篩選方法及應用的製作方法
2023-12-01 05:34:26 1
鏈黴菌菌株spc6-50-1的誘變篩選方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了鏈黴菌菌株SPC6-50-1的誘變篩選方法，是通過亞硝基胍對天藍色鏈黴菌和鏈黴菌Lzsg6進行誘變，得到鏈黴菌突變體庫，再通過利福平及鏈黴素篩選，得到轉錄系統和翻譯系統發生突變的菌株，並公開了鏈黴菌菌株SPC6-50-1及其應用。本發明的有益效果為：本發明提供的鏈黴菌SPC6-50-1菌株具有抑菌活性的物質，而其NTG誘導、利福平和鏈黴素篩選的方法能夠激活鏈黴菌的一些沉默基因，得到新代謝產物，得到新抗生素，同時，上述誘導篩選方法具有操作簡單，周期短，效率高的優點，不僅可適用於鏈黴菌，也適用於粘細菌等有豐富次級代謝產物的微生物，具有很好的推廣使用價值。
【專利說明】鏈黴菌菌株SPC6-50-1的誘變篩選方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及抗生素生產領域，具體涉及鏈黴菌菌株SPC6-50-1的誘變篩選方法、鏈黴菌菌株SPC6-50-1及其應用。
【背景技術】
[0002]自從1928年人類首次發現抗生素一青黴素以來，在這幾十年中，抗生素工業飛速發展，為人類的身體健康做出來巨大的貢獻。但由於人們不合理的使用抗生素，尤其是我國，抗生素耐藥性的問題逐漸爆發出來。解決這一問題，除了注意抗生素的合理使用外，開發新的對耐藥性病菌有抑制活性的新抗生素也是非常重要的。[0003]鏈黴菌是一種廣泛存在於自然界，尤其是在土壤中，原核，革蘭氏陽性菌，屬於放線菌門。鏈黴菌具有複雜的形態分化和次級代謝，而在營養生長和孢子分化的過渡時期能產生多種具有生物活性的次級代謝產物。該屬產生的代謝物除抗生素外，還包括抗腫瘤劑、免疫抑制劑、抗蟲劑以及胞外水解酶，如澱粉酶、幾丁質酶纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和蛋白酶等。這些次級代謝產物在醫療、農業、食品等領域都具有重要應用。
[0004]20世紀40年代至今發現的12000餘種微生物來源的生物活性物質中，55%以上是由鏈黴菌產生的，已發現的抗生素中約有70%是由鏈黴菌產生的。目前臨床上應用的抗生素約三分之二來源於鏈黴菌屬。
[0005]總結過去幾十年從鏈黴菌中得到的抗生素數量，發現90年代以來，人們發現新抗生素的數量急劇減少，這說明傳統的通過篩選新鏈黴菌來得到新抗生素的方法已經遇到了瓶頸(Berdy，2005)。尋找一種新的高效的獲得新抗生素方法很有必要。
[0006]目前，天藍色鏈黴菌(Streptomycescoelicolor)、阿維鏈黴菌(Streptomycesavermitilis)、灰色鏈黴菌(Streptomyces grise μ s)等幾株鏈黴菌已經完成了全基因組測序。研究人員發現，鏈黴菌線性結構的基因中，高度保守的中央核心區基因主要與一些重要的細胞功能相關，而在核心區兩側存在有大量的次生代謝產物基因簇(Chen et al.，2002 ；0hnishi et al.，2008)。例如:在分析天藍色鏈黴菌的基因組，發現有23個參與形成複雜次級代謝產物的基因簇，約佔基因組總量的5% (Bentley et al.，2002)，如表1所示為Streptomyces coelicolor A3 (2)產次生代謝物基因簇；阿維鏈黴菌中有30個次級代謝基因簇，佔全基因組的6.6% (Ikeda et al.，2003)。因此，從這個角度來講，整個鏈黴菌屬就是一個龐大的潛在次生代謝產物庫。通過某些方法使鏈黴菌轉錄、翻譯這些基因，並篩選出具有活性物質的次生代謝物是獲得新抗生素的一種有效辦法(Zazopo μ 1s et al.，2003)。
[0007]表1
[0008]
【權利要求】
1.鏈黴菌(streptomyces linzensis)菌株SPC6-50-1的誘變篩選方法,其特徵在於，是通過亞硝基胍(NTG)對天藍色鏈黴菌(streptomyces coelicolor A3(2))和鏈黴菌(Streptomyces sp.兒zsg 6進行誘變,得到鏈黴菌突變體庫,再通過利福平及鏈黴素篩選，得到轉錄系統和翻譯系統發生突變的菌株。
2.根據權利要求1所述的鏈黴菌linzensis)菌株SPC6-50-1的誘變篩選方法，其特徵在於，包括有以下步驟: 1)化學誘變劑NTG對鏈黴菌進行誘變:將天藍色鏈黴菌(StreptomycescoelicolorA3(2))和鏈黴菌(Sire/--ο焊ces sp.) Lzsg 6製備為菌懸液，以NTG母液對菌懸液進行誘變，得到NTG處理過的菌懸液； 2)以利福平篩選轉錄系統發生突變的菌株:將步驟I)得到的NTG處理過的菌懸液均勻塗於含有5μ g/ml利福平的高氏一號培養基平板上，30°C培養7-15 d，將長出的單菌落分別接於裝有5 mL液體培養基YEME或TSBY的試管中，然後再製備成誘變菌懸液，進行NTG誘變，將處理過的菌懸液均勻塗於含有10 μ g/ml利福平的高氏一號培養基平板上，反覆，進行 15 μ g/ml, 20 μ g/ml, 25 μ g/ml, 30 μ g/ml, 35 μ g/ml, 40 μ g/ml, 45 μ g/ml, 50μ g/ml的利福平篩選，得到利福平篩選後菌株； 3)以鏈黴素篩選翻譯系統發生突變的菌株:將步驟2)得到的利福平篩選後菌株再進行NTG誘變，方法與步驟2)相同，處理過的菌懸液均勻塗於含有5 yg/mL鏈黴素、50 μ g/mL利福平的高氏一號培養基平板上，30°C培養7-15 d，將長出的單菌落分別接於裝有5 mL液體培養基YEME或TSBY的試管中，然後再製備成誘變菌懸液，進行NTG誘變，將處理過的菌懸液均勻塗於含有10 μ g/mL鏈黴素、50 μ g/mL利福平的高氏一號培養基平板上,反覆，利福平濃度均為 50 μ g/mL,鏈黴素為 15 μ g/ml, 20 μ g/ml, 30 μ g/ml, 40 μ g/ml, 50μ g/ml, 60 μ g/ml, 70 μ g/ml,80 μ g/ml,90 μ g/ml, 100 μ g/ml 依次遞增,得到鏈黴素、利福平篩選後的菌株。
3.—株以權利要求1或2所述的誘變篩選方法誘變篩選得到的鏈黴菌(Streptomyceslinzensis)菌株SPC6-50-1，其特徵在於，所述鏈黴菌的保藏號為CGMCC N0.8372。
4.權利要求3所述的鏈黴菌菌株SPC6-50-1在製備抗生素中的應用。
5.權利要求1或2所述的鏈黴菌linzensis)菌株SPC6-50-1的誘變篩選方法在激活鏈黴菌沉默基因中的應用。
6.權利要求1或2所述的鏈黴菌linzensis)菌株SPC6-50-1的誘變篩選方法在製備抗生素中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，是將鏈黴素、利福平篩選後的菌株於高氏一號平板上劃線，收集孢子保存，接於裝有液體培養基YEME或TSBY的三角瓶中，在30°C，200r/min的搖床上培養3_7d, 12000 r/min離心I min,取上清即可。
【文檔編號】C12R1/465GK103882005SQ201410057958
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月20日 優先權日:2014年2月20日
【發明者】張昺林, 陳熙明, 張威, 張滿效, 陳拓, 劉光琇 申請人:中國科學院寒區旱區環境與工程研究所