植物體地上部位表達的植物轉化啟動子及其用途的製作方法

2023-12-01 05:09:46 1

專利名稱：植物體地上部位表達的植物轉化啟動子及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於植物體地上部位表達的啟動子及其製造方法。具體地說，本發明涉及植物體地上部位表達的單子葉植物轉化啟動子及其製造方法。
背景技術：
啟動子是連接在構造基因上部的基因體部位，具有與其連接的構造基因轉錄到mRNA的調整作用。啟動子是由幾個一般轉錄因子結合才能活化，通常具有調整基因表達的TATA框、CAT框等的鹼基序列。生體基本代謝所需的蛋白質在細胞內要保持一定濃度以上，連接在這些基因的啟動子只靠一般轉錄因子的作用一直保持活性。相對地對平時沒有作用，只有在特定的情況 下被要求功能的蛋白質來講，誘導其構造基因表達的誘導性啟動子連接在其構造基因上。即生物體的發展過程中、或是受周圍環境因素的外部刺激而活化的特異性轉錄因子與誘導性啟動子結合，啟動子才能活化。在具有新特性的耕作植物的生產方面，向植物體引入的外部基因的表達受轉錄性、後轉錄性、轉譯及後轉譯因素等的巨大影響。所述因素中，尤其屬於轉錄因素的啟動子直接影響轉基因的轉錄，結果改變表達的水準。另外，所述啟動子能改變轉基因的表達步驟、組織或細胞特異性的最重要因素。到現在為止，為了表達轉基因多種植物體中分離出許多啟動子，但實際上其中只有少數利用在植物轉化。花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子和其衍生物是目前最廣利用的啟動子，在植物體的全體組織上誘導廣泛的基因表達。花椰菜花葉病毒(CaMV)3尤其在維管束組織及根和葉的大部分細胞上顯示大的活性。但是CaMV 35S啟動子在水稻等單子葉植物顯示的活性比雙子葉植物低，甚至在花粉等特定細包上不顯示任何活性。CaMV 35S以外來自於雙子葉植物的其他多數啟動子利用在單子葉植物轉化上，但是比來自單子葉植物的啟動子顯示較低的活性。對此，水稻的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基(RbcS)啟動子，水稻的肌動蛋白I (Actl)啟動子及玉米的Ubil啟動子一直以為對單子葉植物轉化有用的啟動子而被研究。尤其，因為Actl及Ubil啟動子比CaMV 35S啟動子在單子葉植物顯示較高的活性，一般利用在單子葉植物的轉化上。可是，雖然Ubil啟動子在許多細胞類型上顯示活生，但是不包含植物體的全體組織。另外，在幼根顯示強大的活力，但隨著根的成熟其活性明顯地減少。Actl啟動子主要在生長組織和生殖組織顯示活性，在單子葉植物上要普遍存在的基因表達不太有效果。因此對單子葉植物轉化而言，不斷地提出需要開發顯示強而穩定、全體活性的啟動子。對此本發明人等要開發對單子葉植物轉化有效的啟動子不斷努力的結果，發現來自水稻的特定啟動子適合單子葉植物的植物體地上部位表達，完成了本發明。

發明內容
發明需要解決的技術課題本發明的目的是提供對植物轉化有效的啟動子。本發明的另一目的是提供包含所述啟動子的重組植物表達載體。本發明的另一目的是提供利用所述啟動子和重組植物表達載體生產目的蛋白質的方法和由其生產的蛋白質。本發明的另一目的是提供利用所述重組植物表達載體的轉化植物的製造方法及由所述方法轉化的植物。本發明的另一目的是提供所述轉化植物的種子。解決課題的技術方案 為了完成本發明的目的，本發明提供包含選自由序列號(SEQ. ID. No. ) I及2形成的群 中至少一個序列的啟動子。本發明是涉及來自水稻的特定啟動子，具體地說，所述啟動子可以是植物體地上部位表達的單子葉植物轉化啟動子。另外，適合植物體地上部位表達。所述植物體地上部位可以是葉子。所述序列號I的啟動子命名為「核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基3 (RbcS3),所述序列號2的啟動子命名為「磷酸核酮糖激酶(PRK)」。新分離的2種啟動子比葉子特異性表達啟動子的RbcSl啟動子(GenBankaccession no. D00643)更強的在葉子上表達。並且，所述RbcSl啟動子和PRK啟動子，比現有的玉米泛素啟動子的表達量更強，與OsCcl啟動子(GenBank accession no. AF399666)的葉子上的表達量類似。在本發明的一實施例，上述序列的突變體可包含在本發明的範圍內。所述突變體是鹼基序列有變化，但具有與序列號I或2的鹼基序列類似功能及免疫學特性的鹼基序列。具體地說，所述啟動子可包含與序列號I至2的鹼基序列具有70%以上，較好具有80%以上，更好具有90%以上，最好具有95%以上序列相同度的鹼基序列。對多核苷酸的「序列相同度％」是與兩個優化排列的序列比較比對區而確認，比對區內多核苷酸序列的一部分相對於對兩個序列優化排列的參考序列(不包含添加或刪除)可包含添加或刪除(即，間隔)。所述％是確認相同的核酸鹼基在兩個序列上都存在的位點數而計算匹配位點數，該匹配位點數除比對區內的總位點數，其結果乘100而算出序列相同度％，做比對序列的優化排列是由電腦執行公知的演算方式(例如，GAP，BESTFIT, FASTA及 TFAST in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(GCG) , 575 Science Dr. , Madison, WI, or BlastN and BlastX available from theNational Center for Biotechnology Information),或是以檢查完成。多核苷酸序列的實際同一'I"生是指多核苷酸包含具有70%以上的序列同一'I"生，較好具有80%以上，更好具有90%以上，最好具有95%以上的序列同一性的序列。另一方面，兩分子在嚴格的條件下特異地互相雜交時，核苷酸序列實際上是相同的。嚴格的條件是序列依賴性，在其他情況下是不會相同。嚴格的條件是在指定的離子強度及PH值下選取比對特定序列的熱熔點(Tm)低10°C。Tm是標的序列的50%在完全匹配的探針上雜交的溫度(在指定的離子強度及PH值下)。探計長度及鹼基組成兩者的函數，雜交體的Tm可利用文獻(Sambrook, T. et al. , (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (secondedition), Volume 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring)內的資訊來計算。典型地，對南方轉潰程序的嚴格條件包含以0.2XSSC在65°C洗滌。對於利用較佳的寡核苷酸探針時，洗滌條件是典型地在6XSSC約42 °C。本發明的一實施例中，所述啟動子可包含與序列號I或2的序列互補的序列。術語「互補」，本技術領域中廣泛使用的術語，是指核苷酸或核酸，例如DNA分子的雙股之間的雜交或鹼基配對。本發明的一實施例中，所述單子葉植物可以是水稻、大麥、小麥、玉米、小米或高粱，但不限於此。在本發明的另一方面，本發明提供包含根據本發明的啟動子的重組植物表達載體。重組植物表達載體可列舉圖2記載的為一例，並不限於此。
具體地說，所述載體是把變形的綠螢光蛋白基因(GFP)，蛋白酶抑制劑II終結基因(TPinII)，0sCcl啟動子(Pcytc)，除草劑抗性基因BAR (草丁膦乙轉移基因)及胭脂鹼合成酶終結子(TNOS)可操作地連接在本發明的啟動子上。另外，右邊界序列末端裝上MAR序列使根據染色體內引入部位的表達量變化最少化而使得只能測定本發明啟動子的固有活性。術語「重組」是指細胞複製異源核酸或表達所述核酸，或表達由肽、異源肽或異源核酸編碼的蛋白質的細胞。重組細胞可以以順義或反義的形態表達所述細胞的天然形態中還沒有發現的基因或基因片段。另外重組細胞可以表達天然形態的細胞中發現的基因，但是所述基因是經變形並以人工手段再引入細胞的。術語「載體」在表示傳遞到細胞內的一個或多個DNA片段和核酸分子。所述載體可以複製DNA並能在宿住細胞中獨立複製。術語「傳達體」和「載體」通常互換使用。術語「表達載體」是指包含標的編碼序列，和在特定宿主生物中表達可操作地連接的編碼序列所需的合適核酸序列的重組DNA分子。眾所周知，在真核細胞中可以使用啟動子、增強子、終結信號及多腺_酸化信號。植物表達載體的較佳實例是Ti質體載體，當它存在於如根癌農桿菌的合適宿住時把自身的一部分，即所謂T區域轉移到植物細胞。其他類型的Ti質體載體(參照EP O 116718 BI號)目前以可生產新種植物的原生質體利用在把植物細胞、或雜交DNA適當地插入植物基因體而轉移雜交DNA序列。尤其Ti質體載體的較佳形式是如EP O 120 516 BI號及美國專利第4，940，838號請求的所謂二元載體。向植物宿住引入本發明的DNA，可利用的其他合適載體可以從來自於雙鏈植物病毒包括CaMV、單鏈植物病毒及Gemini病毒等的病毒載體等選擇，例如不完全性植物病毒載體。尤其難以合適轉化植物宿住時，使用所述載體可能有利。所述表達載體最好可以包含一個以上的篩選標誌。所述標誌是核酸序列通常具有以化學方法可選出的特性，包含可從非轉化細胞分別轉化細胞的所有基因。例如，可列舉如嘉磷塞或草銨膦等的除草劑抗性基因，如卡那黴素，G418，博來黴素，潮黴素，氯黴素等的抗生劑耐性基因，但不限於此。術語「啟動子」是指從構造基因起的DNA上遊區域，即意味著為了開始轉錄RNA聚合酶結合的DNA分子。「植物啟動子」是在植物細胞中可以開始轉錄的啟動子。「組成啟動子」是大部分的環境條件及發展狀態或是細胞分化下具有活性的啟動子。因為轉化的選擇在各種步聚中由各種組織完成，組成啟動子在本發明可能比較有利。因此，組成啟動子不限制選擇可能性。所述終結子可以使用通常的終結子，例如可列舉胭脂鹼合成酶(N0S)、水稻α澱粉酶Ramyl A終結子，菜豆鹼終結子，根癌農桿菌的章魚鹼基因的終結子等，但不限於此。關於終結子的心要性，通常認為此種區域增加植物細胞轉錄的可靠性及效率。因此，在本發明的內容最好使用終結子。根據本發明一實施例的重組植物表達載體中，所述植物表達載體是編碼標的蛋白質的標的基因可操作地連接在在本發明啟動子的下遊而製造的。在本發明中，「可操作地連接」是指以單位作用於表達異源蛋白質的表達盒成分。例如，可操作地連接在編碼蛋白質的異源DNA的啟動子促進生產相當於異源DNA的功能性mRNA。所述標的蛋白質可以是所有種類的蛋白質，例如酶，荷爾蒙，抗體，細胞激素等具有醫學活用性，或可以增進包含人類動物健康的大量儲存營養成分的蛋白質，但不限於此。標的蛋白質，例如可列舉介白素、幹擾素、血小板誘導成長因子、血紅素、彈力蛋白、膠原蛋 白、胰島素、纖維母細胞生長因子、人體成長因子、人體血清白蛋白、紅血球生成素等，並不限此。另外，本發明提供以所述重組植物表達載體轉化植物體而在植物體地上部位生產標的蛋白質的方法。另外，提供由所述生產方法生產的標的蛋白質。生產的標的蛋白質如前述一樣。植物轉化是指將DNA轉移到植物的任意方法。此種轉化方法不一定具有再生及(或)組織培養期。植物種的轉化目前不僅對雙子葉植物，也對單子葉植物都很普遍。原則上，可以使用任意的轉化方法將本發明的雜交DNA引入適當的祖細胞。所述的方法可適當地選自用於原生質體的I丐/聚乙二醇方法(Krens, F. A. et al. , 1982, Nature 296,72-74; Negrutiu I. et al. , June 1987，Plant Mol. Biol. 8，363-373)，用於原生質體的電穿孔方法(Shillito R.D. et al. , 1985 Bio/Technol. 3，1099-1102)，用於植物成分的顯微注射方法(Crossway A. et al. , 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185),用於各種植物成分(被DNA或RNA覆蓋的)的粒子衝擊方法(Klein T. M. et al.，1987，Nature327，70)，對植物的浸泡或成熟花粉或是小孢子的轉化由根癌農桿菌媒介基因轉移(非完全性)中的病毒感染(EP O 301 316號)等。根據本發明的較佳方法包含農肝菌媒介的DNA傳移。尤其較好使用EP A 120 516號及美國專利第4，940，838號公開的二元載體技術。利用在植物轉化的「植物細胞」是任意細胞。植物細胞是培養細胞、培養組織、培養器官或全體植物，較好是培養細胞、培養組織或培養器官及更好是任意形態的培養細胞。「植物組織」是分化的或是未分化的植物組織，例如根、莖、葉、花粉、種子、癒合組織及利用在培養的多種形態的細胞，即包含單一細胞、原生質體、芽及癒合組織，但不限於此。植物組織可以是在植物中，或是器官培養、組織培養或細胞培養的狀態。在本發明的另一觀點，提供轉化植物的製造方法，其特徵是包含以根據本發明的重組植物表達載體使植物細胞轉化的步驟；以及從所述轉化植物細胞再分化轉化植物的步驟。本發明的方法是包含以根據本發明的重組植物表達載體使植物細胞轉化的步驟，所述轉化可由根癌農桿菌媒介。另外，本發明的方法包含從所述轉化植物細胞再分化轉化植物的步聚。從轉化植物細胞再分化轉化植物的方法可利用在同業界公開的任意方法。
另外，本發明提供由根據本發明的轉化植物的製造方法製造的轉化植物。較好地所述植物是單子葉植物，更好地可以是水稻、大麥、小麥、玉米、小米或高粱，但不限於此。另外，本發明提供從所述轉化植物獲得的種子。較好地所述種子是來自單子葉植物，更好地可以來自水稻、大麥、小麥、玉米、小米或高粱，但不限於此。有益效果
根據本發明的啟動子可以利用於植物體，尤其是單子葉植物的轉化。特別在如水稻的單子葉植物，對特異地表達葉子基因的轉化植物體將會有巨大的貢獻。


圖I顯示水稻各組織的地上部位表達基因的表達；
圖2是水稻轉化載體的模似 圖3是根據本發明一實施例的啟動子構造 圖4顯示在轉化水稻種子內的GFP螢光表達；
圖5顯示在轉化幼苗上的GFP螢光表達；
圖6顯示在轉化水稻花上的GFP螢光表達；
圖7是利用RT-PCR對幼苗上的螢光表達的分量比較。
具體實施例方式以下，通過實施例對本發明進行更詳細的說明。這些實施例只是例示本發明，並不是以這些實施例限制本發明的範圍。
實施例材料及方法
I.預測啟動子序列及萃取
1997年開始2004年12月完成水稻整體基因體定序的國際水稻基因組測序計劃(IRGSP)序列和根據此實施基因命名的TIGR命名數據，利用所述序列和數據預測啟動子區域來製作水稻轉化載。選定結束命名的BAC，從編碼序列(⑶S)的ATG位置到上遊約2kbp的序列假設為啟動子區域，只萃取此序列，在2kbp之內要分離整體大小為約I. 8-2kb的啟動子，使用為聚合酶鏈反應(PCR)引子製作用模板。.使用RT-PCR(反轉錄酶-PCR)的地上部位表達基因分析
為了分析地上部位表達基因，從種子，和長7天、30天、60天的苗的葉子和根以及花組織採取了試料。為了準備試料以70%乙醇和20%chloraX溶液消毒種子，在無光狀態發育5天,在溫室展開。為了萃取整體RNA,使用了 RNeasy植物小型試劑盒(Qiagen, Cat.No. 74904)。萃取的整體RNA400ng合成了第 I 條cDNA(Invitrogen, Cat. No. 18080-051),cDNA合成反應物I均做為模板實施了 PCR，在PCR反應中使用的引子如下，為了比較使用的cDNA量(loading control)使用了泛素引子(ubi),其序列如下
正方向引子 RbcS3:5』- TATACAGAGGAGACTCGATTGA -3』(序列號 3)
反方向引子 RbcS3 : 5』- TACATACACAGCTGATGTTGAC-3』(序列號 4)
正方向引子 PRK :5』-GGCATCCTCGCATTTCTTGTA-3』(序列號 5)反方向引子 PRK : 5』 -AGAGGTAGGAGCATCCTCAT-3』(序列號 6 )
正方向引子 RbcSl :5』-GGTGGCAACTAAGCCGTCAT-3』(序列號 7)
反方向引子 RbcSl :5』-AAGCAGAGCACGGCCGGTAA-3』(序列號 8)
正方向引子 OsCcl :5』-ACTCTACGGCCAACAAGAAC-3』(序列號 9)
反方向引子 OsCcl :5』-CTCCTGTGGCTTCTTCAACC-3』(序列號 10)
正方向引子 OsUbil :5』-ATGGAGCTGCTGCTGTTCTA-3』(序列號 11)
反方向引子 OsUbil :5』-TTCTTCCATGCTGCTCTACC-3』(序列號 12)
PCR 條件是 PTC200 PCR machine(MJ research), cDNA I 均，2X Taq premix(Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1)，模板特異性引子分別以4pmol，全體以20均反應，95°C30秒，550C 30秒，720C I分，32轉進行。.啟動子的增幅(amplification)及分離(isolation)
預測的2kbp啟動子序列為模板,利用引子designer4 program(ver. 4. 20, Scientific& Educational software),設計了分離整體大小為約I. 8_2kb的啟動子的PCR引子。設計條件是PCR條件是引子的GC%範圍在40-60%，Tm範圍55_66°C，鹼及游離鎂濃度分別為0，0. 15mM，引子(PCR引子)的長度是使模板特異性區域為20bp，使5』接頭序列)為12bp。此接頭序列不是為了利用限制酶和DNA接合酶的現有選殖方法，是為了位置特異性重組而插入的序列。為了獲得PCR反應中使用為模板的DNA，播種日本型Nipponbare品種的水稻,在溫室生長3周後，只切開葉子萃取了基因體DNA。基因體DNA是首先切開的葉子用液體氮急速冷凍，利用研缽微細地磨碎後，利用DNAzol (molecular research center, Cat. No.DN128)溶液分離的。PCR反應分成兩個步驟進行。I次反應是從水稻的基因體中分離特定啟動子的反應，使用了連接在12bp接頭序列的整體大小32bp的模板特異性引子。引子序列的構成如下
正方向模板特異性引子5』 -AAAAAGCAGGCT-模板特異性序列_3』
反方向模板特異性引子5』-AGAAAGCTGGGT-模板特異性序列_3』
具體的基因特異性引子序列如下。a. RbcS3啟動子引子
正方向引子5』 -AAAAAGCAGGCTGCGAGGTGCTTAGGCTATTG-3』(序列號 13)
反方向引子5』 -AGAAAGCTGGGTGCATACAGCTGATCCTTCCAC-3』(序列號 14)b. PRK啟動子引子
正方向引子5』 -AAAAAGCAGGCTGTCTGTTGGCCTACGACAAG-3』(序列號 15)
反方向引子5』 -AGAAAGCTGGGTCTGAGCATGAAACCTGAAAG-3』(序列號 16)
I 次 PCR 是基因體 DNA50ng, 2X Taq premix (Solgent. Co. Cat. No.EP051020-T2B6-1)，模板特異性引子分別lOpmol，全體以50ul反應，95°C I分，55°C I分，680C 2分，30轉進行。2次反應是為了插入啟動子於轉化用載體而插入需要的接頭序列(att site),為了增幅而實施。要附加插入於啟動子的序列長度是約29bp，為了提高PCR的效率此序列的一部分(12bp)懸掛在模板特異性序列執行第一次PCR後，取此PCR反應液的1/50 (Iul)再以具有整體重組序列的引子(接頭序列引子)進行第二次PCR反應。因此，此反應物具有水稻的啟動子和用於重組的att序列。接頭序列引子的序列如下attBl 接頭引子5』 -GGGGACAAGITTGTACAAAAAAGCAGGCT-3』(序列號 17) attB2 接頭引子5』 -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3』(序列號 18)
2 次 PCR 是 I 次 PCR 反應物 lul，2X Taq premix (Solgent. Co. Cat. No.EP051020-T2B6-1)，接頭引子分別 2pmol，全體以 50ul 反應，95°C 30 秒，45。。30 秒，68°C 2分，5轉進行後，再以95°C 30秒，55°C 30秒，68°C 2分，20轉進行。上面的PCR 方法是為了利用 Gateway 系統(Invitrogen, Cat. No. 12535-029)以Invitrogen提示的方法執行的。.增幅的啟動子的選殖
利用Gateway系統(Invitrogen, Cat. No. 12535-029)插入於轉化用載體。首先,增幅的啟動子在1%瓊脂糖凝膠上電泳後，在凝膠上以亮帶分離及Mega-spin瓊脂糖凝膠萃取試劑盒(Intron, Cat. No. 17183)純化,純化的啟動子5ul, BP clonase酶混合物4ul, 5X BP 反應緩衝 4ul，pD0NR 載體 300ng/2ul，TE 緩衝(IOmM Tris/pH8. O, ImM EDTA)，全體 20ulBP反應在25°C執行了 16小時。之後，在此反應物添加LR clonase酶混合物6ul，0. 75MNaCl lul,轉化用轉體450ng/3ul,全體30ul, 25°C,進行了 LR反應8小時，添加porteinaseK 3ul，在37°C反應I小時後，其中取出2ul在DH5a勝任細胞轉化，轉化的DH5a細胞50ug/ml在含有大觀黴素抗生劑的LB瓊脂培養基上展開，在37°C恆溫器培養12小時後，在篩選的細胞中萃取DNA通過PCR反應確認是否插入啟動子後，執行定序及BLASTN，由分離的啟動子確認完整的插入。水稻轉化載體pMJ401如下。右邊界序列和左邊界序列之間重組後與啟動子交替的盒以標誌基因GFP和PINII (蛋白酶抑制劑II)終結子連接在3』方向。能使所述盒執行BP及LR反應具有att序列。篩選基因(篩選標誌基因)是除草劑抗性基因Bar (草丁膦乙轉移基因)，基因Bar製造得可由本發明人開發的持續性表達啟動子OsCcl(參見美國專利第6，958，434)來調整，此基因由NOS (胭脂鹼合成酶)終結子連接。另外,右邊界序列(right-border sequence)末端裝上MAR序列使根據染色體內引入部位的表達量變化最少化而使得只能測定啟動子的固有活性。.利用農桿菌的水稻轉化
Nakdong 水稻種子(Oryza sativa L. cv Nakdong)去外殼後，添加 70% (v/v)乙醇，輕搖I分洗滌。洗滌的種子在放入20%chlorax內搖動I小時消毒，用滅菌水洗滌數次。洗滌的種子為了轉化，如 Jang 所述(Jang, I-C. et al. , Mol breeding, 5:453-461，1999),在癒合組織誘導培養基(2N6)培養一個月誘導胚芽癒合組織後，與由Agrobacterium triplemating方法獲得的農桿菌共同培養，插入所述啟動子的轉化載體插入水稻基因體後，轉化的癒合組織在篩選培養基(2N6-CP)培養一個月。之後,挑選篩選長大的細胞在再分化培養基(MS-CP)培養一個月到兩個月後再分化的植物體在溫室中順化。順化的水稻經一種除草劑處理後，挑選對此顯示抗性的植物體做了後裔檢定。.觀察水稻各器官的GFP表達
為了分析啟動子的活性，使用的標誌基因GFP的表達確認是，在種子、黑暗狀態生長5天的幼苗和花器宮上觀察到的。基因表達的觀察是在能確實觀察基因的插入及分離的T2步驟開始實施。種子的GFP表達是去外殼，利用LAS3000系統(Fuji photo film. co.)和立體顯微鏡SZX9-3122 (Olympus, Tokyo, Japan)在種子的胚和胚乳觀察到GFP表達。對無光培養的幼苗，在種子中觀察到GFP表達的種子再用乙醇和20%chloraX溶液消毒，為了確認篩選標誌bar基因的活性，在含有PPT成分的MS-P培養基(PPT4mg/l)黑暗狀態下發芽了兩天。在黑暗狀態發芽的幼苗是以LAS3000觀察GFP表達，接著在恆溫器中生長三天後，在幼葉和根觀察到基因表達。LAS3000的條件是精確度、標準以及I秒曝光時間(460nm感光濾色片，510nm抑止濾光片)。花在出穗之前採取，利用立體顯微鏡SZX9-3122 (Olympus,Tokyo, Japan)，觀察去花的穎片之前和之後，觀察了各器官的GFP表達。.以RT-PCR分析啟動子活性
無光培養的幼苗分成_葉和根萃取了整體RNA。在種子中觀察到GFP表達的種子用乙醇和20%chlorax溶液消毒，為了確認篩選標誌bar基因的活性，在含有PPT (固殺草)成分的MS-P培養基(PPT4mg/l)，在恆溫器，黑暗狀態下發育了五天。為了在此幼苗中萃取整體RNA，使月了 RNeasy植物小型試劑盒(Qiagen, Cat. No. 74904)。以萃取的整體RNA400ng合成了第 I 條 cDNA (Invitrogen, Cat. No. 18080-051),米取此 cDNA 合成反應物 2ul 做 為模板實施了 PCR。PCR反應使用了兩種引子。第I個引子是要相對比較啟動子間插入的GFP表達量的引子(引子GFP)，第2個引子是要比較cDNA使用量(loading control)的引子(引子OsUbiI )，引子序列如下
正方向引子 GFP :5』-CAGCACGACTTCTTCAAGTCC-3』(序列號 19)
反方向引子 GFP :5』 -CTTCAGCTCGATGCGGTTCAC-3』(序列號 20)
正方向引子 OsUbil :5』-ATGGAGCTGCTGCTGTTCTA-3』(序列號 11)
反方向引子 OsUbil :5』-TTCTTCCATGCTGCTCTACC-3』(序列號 12)
PCR 條件是 PTC200 PCR machine (MJ research), cDNA 2ul, 2X Taq premix (Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1)，模板特異性引子分別以4pmol，全體以20ul反應，95°C30秒，55°C I分，4°C 10分，25轉進行。實施例I :地上部位表達基因的水稻各組織表達分析
為了觀察RbcS3及PRK的地上部位表達啟動子的組織特異活性，在種子，和長7天、30天、60天的苗分別從葉子和根的組織以及花組織採取了試料，在各試料萃取了全體RNA。此RNA為模板合成cDNA，執行PCR而增幅後，在2%瓊脂糖凝膠上電泳。圖I是利用RT-PCR,水稻內2個地上部位表達基因及已公知的啟動子RbcSl (GenBank accession no.D00643), OsCcl (GenBank accession no. AF399666)以及 OsUbil (GenBank accessionno. AK121590)的各組織表達現象的比較結果。如圖I所示，可知在本發明使用的RbcS3及PRK的水稻內各組織的表達在包含葉和花的地上部位組織表達的很強。另外，顯示與已被知曉的持續性表達啟動子RbcSl基因表達類似的現象，由此可確認這些是地上部位表達基因。實施例2 :水稻轉化用載體的製造及啟動子構造
製作了分析啟動子活性的水稻轉化用載體，顯示在圖2。圖2顯示pMJ401載體，是篩殖以PCR分離的啟動子的母載體。attRl，attR2位置是BP反應後與啟動子具有的attLl，attL2序列發生重組(位置特異性重組)的部位，LR反應後,啟動子和盒交替，attRl, attR2序例也和attLl, attL2交替。對各基因的說明如下MAR, matrix attachment region(I. 3kb) , X98408 ;盒 B，轉換盒 B (I. 7kb)，invitrogen, Cat. No. 11828-019 ;GFP，變形綠螢光蛋白基因(O. 74kb)，U84737 ;TPINII，蛋白酶抑制劑II終結子(I. Okb), X04118;OsCcl，細胞色素 c 啟動子(O. 92kb), Af399666 ;BAR，草丁膦乙轉移基因(O. 59kb)，X17220 ；TN0S，胭脂鹼合成酶終結子(O. 28kb)。圖3是顯示本發明啟動子的水稻基因體上的構造。實施例3:轉化水稻種子內的GFP螢光表達
從以各啟動子載體轉化的水稻獲得至T3步驟的後裔後，去掉種子的穎片利用立體顯微鏡 SZX9-3122 (Olympus, Tokyo, Japan)觀察了 GFP 表達。圖4顯示在轉化水稻種子內的GFP螢光表達。在圖4對各基因的說明如下。NC:陰性對照組Nakdong (非轉化種子)；RbcS3 RbcS3啟動子；PRK :PRK啟動子；RbcSl =RbcSl啟動子；0sCcl Oryza sativa L.細胞色素C啟動子；ZmUbil :玉米泛素啟動子載體。在非轉化的對照組(陰性對照組)在胚略有背景，但種子整體上GFP沒有表達。以陽性對照組使用的OsCcl啟動子，RbcSl啟動子在程度上有差異，但都在胚上GFP表達，尤其玉米泛素啟動子不僅在胚，也在胚乳可觀察到很強的GFP。根據本發明的2種新的啟動子(RbcS3以及PRK)，與持續性表達啟動子OsCcl啟動子和玉米泛素啟動子比較時，雖然表達的弱，但在葉子上顯示與特異性RbcSl啟動子類似程度的GFP表達。實施例4 :轉化_曲的GFP螢光表達
從以各啟動子載體轉化的水稻獲得至T3步驟的後裔後，去掉種子的穎片利用立體顯微鏡SZX9-3122 (Olympus, Tokyo, Japan)觀察了 GFP表達,確認是否為同型結合子。確認的種子經消毒後，在恆溫器(27°C)以黑暗狀態發育5天後，以LAS3000系統(Fuji photofilm, co.,精確度、標準、I秒的曝光時間，460nm感光濾色片，510nm抑止濾光片)觀察了 GFP表達。在黑暗狀態下生長的幼苗狀態觀察GFP表達是為了防止發生由植物體內的葉綠素對螢光的幹涉現象而不好觀察GFP螢光表達的情形。圖5顯示在轉化幼苗上的GFP螢光表達。在圖5對各基因的說明如下。NC :陰性對照組Nakdong (非轉化種子)；RbcS3 RbcS3啟動子；PRK PRK啟動子；RbcSl =RbcSl啟動子；0sCcl Oryza sativa L.細胞色素C啟動子；ZmUbiI :玉米泛素啟動子載體。如圖5所示，在非轉化的對照組(陰性對照組)在種子略有背景，但在幼葉和根GFP沒有表達。如現有的公知，以陽性對照組使用的RbcSl啟動子在葉子上表達的很強，OsCcl啟動子和玉米泛素啟動子在葉子和根可觀察到很強的GFP。根據本發明的2種新的啟動子(RbcS3以及PRK)，如同RbcSl啟動子主要在葉子上基因表達。實施例5 :轉化水稻花的GFP螢光表達
在種子及幼苗顯示均等GFP表達的T2後裔種子播種在溫室，採取出穗之前的花，利用立體顯微鏡SZX9-3122(01ympus，Tokyo, Japan)在去花的穎片之前和之後，觀察了各組織的GFP表達。圖6顯示在轉化水稻花上的GFP螢光表達。在圖6對各基因的說明如下。NC:陰性對照組Nakdong (非轉化種子)；RbcS3 RbcS3啟動子；PRK PRK啟動子；RbcSl =RbcSl啟動子；0sCcl Oryza sativa L.細胞色素C啟動子；ZmUbil :玉米泛素啟動子載體。OsCcl :GFP在水稻種子和幼苗的葉子和根都表達的很強，但在花幾乎沒有表達，在葉子顯出特異表達的RbcSl :GFP在花葯觀察到GFP表達。ZuUbil:GFP在外稃，內稃，雄蕊，花葯等所有花器上表達很強，可知在植物體整體表達。
根據本發明的2種新的啟動子與對照組比較時，在所有花器上表達，但表達的分量不多，可稱為葉子特異性表達。由此結果，新分類的本發明啟動子(RbcS3及PRK)與現有的葉子特異性表達的RbcS啟動子比較，可知是較少影響於生殖的葉子特異性啟動子。實施例6 :利用RT-PCR的轉化水稻，在其幼苗上的啟動子活性(GFP表達程度)分析
無光培養5天的幼苗分成_葉和根萃取了 RNA。此RNA為模板合成cDNA，執行PCR增幅後，在I. 2%瓊脂糖凝膠上電泳。標誌使用IOObp ladder 300ng，各PCR產物載入5ul。GFP是增幅GFP引子的PCR產物，是相對地與插入啟動子的GFP表達量做比較的產物，其大小是142bp。OsUbil是增幅Ubi引子IOObp的PCR產物，是與以模板使用的cDNA量(負載控制)做比較。如圖7所示，如觀察水稻幼苗的GFP螢光照片一樣(參見圖5)，RbcSl = GFP在根部 表達很弱，相對地在葉部表達的很強，但是與OsCcl:GFP，ZmUbiliGFP比較表達的相當弱。OsCcI:GFP在葉部和根部都比ZmUbil = GFP表達的強。據此，可以看出根據本發明的2種新的啟動子(RbcS3及PRK)是比葉子特異性啟動子RbcSl在葉部表達的更強。尤其，RbcS3啟動子與RbcSl啟動子和其他啟動子在根部基因表達很弱的情形不同地，只有在葉表達。本發明的RbcS3啟動子和PRK啟動子，比RbcSl啟動子強，與玉米泛素啟動子類似。因此，根據本發明的兩個啟動子是植物體地上部位表達啟動子，可以看出比現有的RbcSl啟動子表達量良好。另外，根據本發明RbcS3啟動子是葉子組織等異性表達，因為PRK啟動子分別在根組織略有表達，在葉組織表達良好，根據表達現象的差異，可選擇合適的啟動子。
權利要求
1.一種啟動子，其特徵是包含從序列號I及2形成的群中選出的至少一個序列。
2.根據權利要求I所述的啟動子，其特徵是所述啟動子是植物體地上部位表達的單子葉植物轉化啟動子。
3.根據權利要求2所述的啟動子，其特徵是所述植體地上部位是葉子。
4.根據權利要求I所述的啟動子，其特徵是所述啟動子包含與從序列號I及2形成的群中選出的至少一個序列具有95%以上序列相同度的序列。
5.根據權利要求I所述的啟動子，其特徵是所述啟動子包含與從序列號I及2形成的群中選出的至少一個序列成互補的序列。
6.根據權利要求2所述的啟動子，其特徵是所述單子葉植物是水稻、大麥、小麥、玉米、小米或高粱。
7.一種包含根據權利要求I至6的任意一項所述的啟動子的重組植物表達載體。
8.根據權利要求7所述的重組植物表達載體，其特徵是所述載體是編碼標的蛋白質的標的基因可操作地連接在所述啟動子的下遊而製造的。
9.一種以根據權利要求8所述的重組植物表達載體使植物體轉化而在植物體地上部位生產標的蛋白質的方法。
10.一種根據權利要求9所述的蛋白質生產方法生產的標的蛋白質。
11.根據權利要求10所述的標的蛋白質是由介白素、幹擾素、血小板誘導成長因子、血紅素、彈力蛋白、膠原蛋白、胰島素、纖維母細胞生長因子、人體成長因子、人體血清白蛋白以及紅血球生成素形成的群中選出的至少一個。
12.一種轉化植物的製造方法，其特徵是包含 以根據權利要求7所述的載體使植物細胞轉化的步驟；及 從所述轉化植物細胞再分化轉化植物的步驟。
13.一種以根據權利要求12所述的方法製造的轉化植物。
14.根據權利要求13所述的轉化植物，其特徵是所述植物是單子葉植物。
15.一種根據權利要求13或14所述植物的種子。
全文摘要
本發明涉及使值物轉化的啟動子。具體地說，本發明涉及植物體地上部位表達用啟動子，包含所述啟動子的重組植物表達載體，利用所述重組植物表達載體生產標的蛋白質的方法，根據所述方法生產的標的蛋白質，利用所述重組植物表達載體的轉化植物的製造方法，根據所述方法製造的轉化植物及所述植物的種子。
文檔編號C12P21/00GK102883596SQ201180017159
公開日2013年1月16日 申請日期2011年4月1日 優先權日2010年4月9日
發明者金周坤, 樸洙賢 申請人:明知大學產學協力團