1-羥基-2-(取代苯基)-4,4,5,5-四甲基咪唑啉,其合成,活性及應用的製作方法
2023-12-02 09:14:34 1
本發明涉及1-羥基-2-[3-(甲醯-Ala)-4-(氧乙醯-Gly)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉,涉及它的製備方法，涉及它的抗血栓活性，涉及它的溶血栓活性，涉及它治療腦缺血大鼠的作用，因而本發明涉及它在製備抗血栓藥物,溶血栓藥物和治療缺血性中風藥物中的應用。
背景技術：
缺血性中風是一類較常見且危害嚴重的腦血管疾病，特點是發病率高、病死率高、致殘率高和復發率高。目前臨床治療缺血性中風面臨沒有有效藥物的現實，尤其中風面4h以上的患者非死即殘。發明對中風面4h以上的患者有效的藥物是臨床的重要需求。發明人曾經公開式II的咪唑啉化合物在中風面24h的大鼠缺血性中風模型上，顯示優秀療效。即連續靜脈注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次劑量為5μmol/kg，後5次的劑量為2μmol/kg具有優秀療效。式中aa1和aa2可為同時存在,aa1存在但aa2不存在,或同時不存在；當aa1和aa2同時存在時,aa1為R(Arg),且aa2為G(Gly),A(Ala)或Q(Gln)；當aa1存在但aa2不存在時,aa1為R(Arg)；aa3可為S(Ser),V(Val)或F(Phe)。式II的咪唑啉化合物的2-位是4-氧乙醯-Lys。而該Lys的側鏈氨基和主鏈羧基分別與RGD抗血栓四肽及ARPAK溶栓肽相連,結構比較複雜需要簡化。此外,1,3-二氧咪唑啉不穩定需要穩定化。
發明人經過5年實驗研究，發現用1-羥基-2-(3-甲醯基-4-氧乙醯基苯基)-4,4,5,5-四甲基咪唑啉代替II式的2-(4-氧乙醯基苯基)-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉,用Ala和Gly代替II式的長肽基可以獲得結構簡單,穩定性高和療效好的三重意想不到的技術效果。按照這個發現，發明人提出了本發明。
技術實現要素：
1.本發明的內容之一是提供下式的1-羥基-2-[3-(甲醯-Ala)-4-(氧乙醯-Gly)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉，
2.本發明的內容之二是提供1-羥基-2-[3-(甲醯-Ala)-4-(氧乙醯-Gly)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉的製備方法,該方法由以下方法構成:
(1)製備2,3-二甲基-2,3-二硝基丁烷；
(2)製備2,3-二甲基-2,3-二羥胺基丁烷；
(3)製備2-(3-羧基-4-羥基苯基)-1,3-二羥基-4,4,5,5-四甲基咪唑；
(4)製備2-(3-羧基-4-羥基苯基)-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉；
(5)製備2-[3-(甲醯-Ala-OtBu)-4-羥基苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉；
(6)製備2-[3-(甲醯-Ala-OtBu)-4-(乙氧羰基甲氧基)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉；
(7)製備2-[3-(甲醯-Ala-OtBu)-4-(羧甲氧基)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉；
(8)製備2-[3-(甲醯-Ala-OtBu)-4-(氧乙醯-Gly-OtBu)苯基]-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧咪唑啉；
(9)製備1-羥基-2-[3-(甲醯-Ala)-4-(氧乙醯-Gly)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉。
3.本發明的內容之三是評價1-羥基-2-[3-(甲醯-Ala)-4-(氧乙醯-Gly)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉的抗血栓活性。
4.本發明的內容之四是評價1-羥基-2-[3-(甲醯-Ala)-4-(氧乙醯-Gly)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉的溶血栓活性。
5.本發明的內容之五是評價1-羥基-2-[3-(甲醯-Ala)-4-(氧乙醯-Gly)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉在腦缺血24h後治療腦缺血的活性。
附圖說明
圖1是1-羥基-2-[3-(甲醯-Ala)-4-(氧乙醯-Gly)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉的合成路線i)Br2,6N NaOH；ii)Zn,NH4Cl,50％乙醇；iii)5-甲醯水楊酸,CH3OH；iv)PbO2,CH3OH；v)DCC/HOBt,HCl·Ala-OtBu；vi)Br2CO2C2H5,NaH,THF；vii)2N NaOH,CH3OH；viii)DCC/HOBt,Arg(NO2)Gly-Asp(OBzl)-AA-OBz；ix)TFA/TFMSA。
具體實施方式
為了進一步闡述本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。
實施例1 製備2,3-二甲基-2,3-二硝基丁烷
冰浴和攪拌下往69.0g(0.78mol,70mL)2-硝基丙烷中依次加130mL 6N NaOH溶液,20mL(0.38mol,緩慢滴加,1小時內滴加完)Br2和240mL乙醇。反應化合物90℃回流3小時,期間出現片狀沉澱。將反應液趁熱倒入800mL冰水中,濾得49.0g(73％)標題化合物,為無色片狀結晶。ESI-MS(m/e):177[M+H]+。
實施例2 製備2,3-二甲基-2,3-二羥胺基丁烷
將7.00g(40mmol)2,3-二甲基-2,3-二硝基丁烷與4.00g NH4Cl溶解於80mL 50％的乙醇水溶液中，冰浴下攪拌，3小時之內分批加入16.00g鋅粉。鋅粉加完後，反應混合物室溫攪拌3h，抽濾，濾餅用50％的乙醇水溶液反覆洗。合併濾液與洗滌液，用濃鹽酸調pH為2,減壓濃縮得泥漿狀物。將泥漿狀物用少量50％的乙醇水溶液溶解，加適量碳酸鉀，拌勻之後裝入索式提取器，用二氯甲烷作提取劑，60℃提取6h，提取液減壓濃縮，殘留物用石油醚研磨得到2.07g(35％)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e):149[M+H]+。
實施例3 製備2-(3-羧基-4-羥基苯基)-1,3-二羥基-4,4,5,5-四甲基咪唑
室溫下將1.48g(10mmol)2,3-二甲基-2,3-二羥胺基丁烷用少量甲醇溶解，加入2.0g(12mmol)3-羧基-4-羥基苯甲醛，反應12小時，過濾得到2.07g(70％)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e):298[M+H]+。
實施例4 製備2-(3-羧基-4-羥基苯基)-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基基咪唑啉
將1.00g(3.38mmol)2-(3-羧基-4-羥基苯基)-1,3-二羥基-4,4,5,5-四甲基咪唑用100mL甲醇溶解之後，用1N NaOH調節pH至7，加入6.77g PbO2。TLC顯示反應結束之後，濾除去PbO2，濾液用1N HCl調節pH至7，減壓濃縮。殘留物用少量丙酮溶解，過濾除鹽，得到693mg(70％)標題化合物，為藍色粉末。ESI-MS(m/e):292[M-H]-。
實施例5 製備2-[3-(甲醯-Ala-OtBu)-4-羥基苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉
將300mg(1mmol)2-(3-羧基-4-羥基苯基)-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基基咪唑啉溶於20mL無水THF中，冰浴下加入135mg(1mmol)HOBt和268mg(1.2mmol)DCC，活化30min之後加入174mg(1.2mmol)HCl·Ala-OtBu,反應液用NMM調pH至9，室溫攪拌8h。結束反應，濾除DCU，減壓濃縮，殘留物用柱層析(氯仿/甲醇,10/1)純化，得到204mg(68％)標題化合物，為藍色粉末。ESI-MS(m/e):421[M+H]+。
實施例6 製備2-[3-(甲醯-Ala-OtBu)-4-(氧乙酸乙酯)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉
將420mg(1mmol)2-[3-(甲醯-Ala-OtBu)-4-羥基苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉溶於20mL無水THF。往溶液中加72mg(3mmol)NaH和0.5mL(3mmol)BrCH2CO2C2H5,60℃反應5h，TLC檢測反應顯示原料點消失。過濾，濾液減壓濃縮，殘留物經幹柱柱層析純化(氯仿/甲醇,10/1),得到400mg(71％)標題化合物，為藍色粉末。ESI-MS(m/e):505[M-H]-。
實施例7 製備2-[3-(甲醯-Ala-OtBu)-4-(氧乙酸)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉
將500mg(1mmol)2-[3-(甲醯-Ala-OtBu)-4-(氧基乙酸乙酯)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉溶於30mL甲醇，冰浴下用2N NaOH調反應液pH至12，反應2h，TLC(氯仿/甲醇,10/1)顯示原料點消失。反應液減濃縮，加入2mL飽和NaCl溶液，用1N鹽酸調pH至3。混合溶液用乙酸乙酯萃取3次，合併的乙酸乙酯相用無水硫酸鈉乾燥12h，過濾，濾液減壓濃縮,得429mg(89％)標題化合物，為藍色粉末。EI-MS(m/z):477[M-H]-。
實施例8 製備2-[3-(甲醯-Ala-OtBu)-4-(氧乙醯-Gly-OtBu)苯基]-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧咪唑啉
將480mg(1mmol)2-[3-(甲醯-Ala-OtBu)-4-(氧乙酸)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉溶於20mL無水THF中，冰浴下加入135mg(1mmol)HOBt和268mg(1.2mmol)DCC，活化30min之後加入174mg(1.2mmol)HCl·Gly-OtBu,反應液用NMM調pH至9，室溫攪拌8h。結束反應，濾除DCU，減壓濃縮，殘留物用柱層析(石油醚/乙酸乙酯,1/1)純化，得到450mg(76％)標題化合物，為藍色粉末。ESI-MS(m/e):592[M+H]+。
實施例9 製備1-羥基-2-[3-(甲醯-Ala)-4-(氧乙醯-Gly)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉(7)
冰浴下將50mg 2-[3-(甲醯-Ala)-4-(氧乙醯-Gly)-苯基]-4,4,5,5-四甲基1,3-二氧咪唑啉與1mL TFA及0.3mL TFMSA混合,攪拌15min，反應混合物用無水乙醚稀釋，靜置，傾倒上清液，殘留物再用無水乙醚稀釋，將殘留物抽乾，用5mL蒸餾水溶解，加入50mg NaNO2，反應液顏色有藍色逐漸變為無色(30min)，將溶液的pH調至7，用Sephadex G10除鹽，凍幹，得20mg白色固體粉末.ESI-MS(m/e):465[M+H]+,FT-MS:465.19756。
實驗例1 評價化合物7的抗血栓活性
將雄性SD大鼠(200±20g)，隨機分組，每組10隻，飼養1天，停止餵食過夜。灌胃給予化合物7的生理鹽水溶液(劑量為100nmol/kg)或阿司匹林的生理鹽水溶液(劑量為167μmol/kg)或生理鹽水(劑量為10mL/kg)30min之後，大鼠用20％烏來糖的生理鹽水溶液麻醉，之後手術。分離大鼠的右頸動脈和左頸靜脈，將準確稱重的絲線置於旁路插管，管的一端插入左靜脈，另一端管插入右側動脈並注射0.2mL肝素鈉抗凝。使得血流從右側 動脈流經旁路插管進入左側靜脈，15min之後取出附有血栓的絲線稱量，計算血液循環前後絲線的重量，得到的血栓重,以均值±SD mg表示並代表抗血栓活性，作t檢驗。數據列入表1。結果表明口服1nmol/kg化合物7能有效地抑制血栓形成。說明本發明獲得了意想不到的技術效果。
表1 100nmol/kg化合物7的抗血栓活性
n＝10；a)與生理鹽水相比p<0.01。
實驗例2 評價化合物7的溶血栓活性
SD大鼠(雄性，200±20g)按1200mg/kg的劑量腹腔注射烏拉坦生理鹽水溶液進行麻醉。麻醉大鼠後將其仰臥位固定，分離其右頸總動脈，近心端處夾住動脈夾，將近心端及遠心端分別穿入手術線，遠心端的手術線結紮，遠心端插管，將動脈夾鬆開，取出約1mL動脈血，置於1mL離心管中。往垂直固定的橡膠管(長15mm，內徑2.5mm，外徑5.0mm，管底用膠塞密封，para膜封緊)內注入0.1mL大鼠動脈血，隨後在管內迅速插入一支不鏽鋼材質的血栓的固定螺栓(血栓固定螺旋用直徑為0.2mm的不鏽鋼絲繞成，螺旋部分長10mm，內含15個螺圈，螺圈的直徑為1.0mm託柄與螺旋相連，長約7.0mm，呈問號型)。血液凝固45min後，從玻璃管中小心取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精確稱其重量。
旁路插管由三部分構成，中間段為長60.0mm，內徑3.5mm的聚乙烯膠管；兩端均為長100.0mm，內徑1.0mm，外徑2.0mm的相同的聚乙烯管，該管一端拉成尖管，長約10.0mm(用於插入大鼠頸動脈及靜脈)，外徑為1.0mm，其另一端的外部套一段長為7.0mm，外徑為3.5mm的聚乙烯管(用於插入中段的聚乙烯膠管內)，3段管的內壁均需要矽烷化(1％的矽油乙醚溶液)。將血栓包裹的血栓固定螺旋置於中段聚乙烯膠管內，膠管的另外兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，保證在循環的過程中不會漏血。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)，排除氣泡，備用。
分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠心端分別穿入手術線，結紮遠心端的血管，在暴露的左頸外靜脈上剪一小口，將上述製備好的旁路管道尖管由小口插入左頸外靜脈開口處，同時遠離旁路管中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)內血栓固定螺旋。用注射器通過 另一端的尖管注入準確量的肝素鈉的生理鹽水溶液(50IU/kg)，此時注射器不要撤離聚乙烯管，用動脈夾夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動脈的近心端用動脈夾止血，結紮遠心端，在離動脈夾不遠處將右頸總動脈剪一小口，從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動脈斜口的近心端。旁路管道的兩端均用4號手術縫線將動靜脈固定。
用頭皮針將生理鹽水(3mL/kg)或尿激酶的生理鹽水溶液(劑量為20000IU/kg)或化合物7的生理鹽水溶液(劑量為100nmol/kg)通過旁路管的中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)，扎入遠離血栓固定螺旋的近靜脈端，鬆開動脈夾，使血流通過旁路管道從動脈流向靜脈。將注射器中的溶液緩慢注入血液，通過血液循環，按靜脈-心臟-動脈的順序作用於螺旋的血栓上。血液循環1h之後，從旁路管道中取出固定血栓的螺旋，精確稱量。計算每隻大鼠旁路管道中固定血栓的螺旋血液循環前後血栓的重量差，以均值±SD mg表示並代表溶血栓活性，作t檢驗。數據列入表2。結果表明100nmol/kg化合物7能有效地溶解形成的血栓。說明本發明獲得了意想不到的技術效果。
表2 1nmol/kg化合物7的溶血栓活性
n＝10；a)與生理鹽水比p0.05。
實驗例3 評價化合物7對缺血性中風大鼠的治療作用
在雄性SD大鼠(體重300±20g)的頸部正中部豎直開約2cm長切口,沿胸鎖乳突肌內側緣分離出右頸總動脈,頸外動脈及頸內動脈。用無創動脈夾分別夾閉頸內動脈開口處和頸總動脈近心端,結紮頸外動脈的遠心端,在頸外動脈剪1小口,鬆開頸總動脈近心端的動脈夾,取10μL血,之後再用無創動脈夾夾閉頸總動脈的近心端。將取得的10μL血放置在1mL EP管中常溫放置30分鐘使血液凝固,然後轉移至-20℃冰箱中放置1小時,使血液凝塊結實。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉,劑量為400mg/kg。取出血液凝塊,加入1mL生理鹽水,用鋼鏟把血液凝塊搗成大小均一的細小血栓塊,製備細小血栓的懸液並轉移至1mL注射器內。鬆開頸總動脈近心端的動脈夾，將1mL血栓混懸液緩慢從大鼠頸外動脈向近心端經過頸內動脈注入大鼠的大腦,然後結紮頸外動脈近心端,打開頸內動脈和頸總動脈處得動脈夾,恢復血流。等待甦醒。大鼠甦醒24小時後按Zealonga方法評定神經功能 缺損程度。0分表示無任何神經功能缺失體徵,1分表示未損傷側前肢不能伸展,2分表示向未損傷側行走,3分表示向未損傷側轉圈成追尾狀行走,4分表示意識障礙無自主行走,5分表示死亡。按照得分平均分組。各組大鼠經尾靜脈每天注射1次化合物7劑量為100nmol/kg。連續注射6天，每天評分。結果列入表3。表3的數據表明,化合物7連續治療6天可使3隻腦缺血24小時的大鼠神經生物學評分為0分，可使8隻腦缺血24小時的大鼠神經生物學評分為神經生物學評分為1分。因為不像已經公開的化合物首次劑量需要5μmol/kg,後5次維持劑量需要2μmol/kg,化合物7的6次劑量均為100nmol/kg。這樣一來,首次劑量和維持劑量分別降低了50倍和20倍。
表3 化合物7連續治療6天對腦缺血24小時大鼠神經生物學評分的影響
n＝11,目標化合物劑量＝1nmol/kg,鼠尾靜脈注射給藥。