一種羧甲基纖維素酶活力的測定方法
2023-12-02 09:15:26 3
專利名稱：一種羧甲基纖維素酶活力的測定方法
技術領域：
本發明涉及纖維素酶活力測定方法，具體說是一種羧甲基纖維素酶活力 (CMCNa-DNS)的測定方法。
背景技術：
纖維素酶(Cellulase)是一種多組分的複合酶，不同來源的纖維素酶其組成及各組分比例有較大差異。一般來講，纖維素酶包括外切β-1，4-葡聚糖酶(Exop-1， 4-glucanase,E C3. 2·1. 91)、內切 β-1，4-葡聚糖酶(Endop-1,4-glucanase,E C3. 2.1. 4) 和纖維二糖酶(Cellobiase，E C3. 2.1. 21)。不同來源的纖維素酶製劑產品中三種酶組分含量的比例不同，因此其最終的表觀酶活力會有差異。同時纖維素酶作用的底物也比較複雜，致使纖維素酶活力的測定方法很多，且方法複雜而不統一。常用的方法有羧甲基纖維素糖化力法、羧甲基纖維素液化力法、濾紙糖化力法、濾紙崩潰法和棉花糖化力法等。上述測定方法中，羧甲基纖維素糖化力主要代表外切β_1，4葡聚糖苷酶和內切酶的活力總和， 在研究和實際生產中應用比較普遍。
國內外採用羧甲基纖維素糖化法測定纖維素酶活力的方法很多。目前，國際上有較公認的IPUAC推薦的纖維素酶測定方法(Τ. K. GHOSE, 1987)，該方法分別對來自三個廠家 (Primfast CL購自傑能科公司，Cellusoft L購自諾維信公司,Α5為本公司自主研發產品) 纖維素酶進行多次檢測，其變異係數達2%以上。造成較大誤差的原因可能是加入的羧甲基纖維素鈉濃度高和粘度大，容易在操作過程中帶來較大誤差，且該方法反應時間為30分鐘，利用比色管顯色後需稀釋用分光光度計檢測吸光度值，整個操作繁瑣且耗時；另外，該方法DNS (3，5- 二硝基 水楊酸)試劑配製未經定容，從而造成批次間測定結果存在較大差巳發明內容
本發明為了解決現有技術中存在的測定過程複雜，測定不準確的問題，提供一種新的羧甲基纖維素酶活力的測定方法，採用本發明的方法，測定過程簡便快速，測定現象清晰明了，測定結果準確可靠。
本發明是採用如下技術方案實現的
一種羧甲基纖維素酶活力的測定方法，包括如下步驟
(I)猴頭菌培養物溶液的製備猴頭菌培養物經粉碎，過篩，以適量水溶解，振搖 2^4小時，濾過，定容。
(2)吸光度測定精密量取1%羧甲基纖維素鈉溶液1. 5ml置具塞刻度試管中，精密加猴頭菌培養物溶液O. 5ml，混勻，置45飛5°C水浴中保溫25 35分鐘，取出，立即精密加入DNS試劑1. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫5 15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，靜置廣2小時，以空白管進行調零，在540nm波長處測定吸光度。空白管加1% 羧甲基纖維素鈉溶液1. 5ml，置45飛5°C水浴中保溫25 35分鐘，取出，精密加猴頭菌培養物溶液O. 5ml，混勻，立即精密加入DNS試劑1. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫5 15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，靜置廣2小時。
(3)計算羧甲基纖維素酶活力從葡萄糖標準曲線上讀出猴頭菌培養物溶液中還原糖的重量(mg)，按照下式計算羧甲基纖維素酶活力
U=AX 1/0. 5XnX2
式中U——每Ig含酸性羧甲基纖維素酶活力單位，U/g ;
A——吸光度在標準曲線上查得的還原糖重量，mg ；
η——樣品稀釋倍數；
2——時間換算係數。
Ig固體酶在50±1°C、pH4. 8條件下，I小時水解1%羧甲基纖維素鈉底物，產生出相當於I mg葡萄糖的還原糖量為一個酸性羧甲基纖維素酶活力單位，以U/g表示。
上述的羧甲基纖維素酶活力的測定方法，其中步驟(3)所述的葡萄糖標準曲線測繪方法為:分別精密量取O. 2 mg/ml、0· 4 mg/ml、0. 6 mg/ml、0. 8 mg/ml、1. Omg/ml 的葡萄糖對照品溶液1. 5ml，置具塞刻度試管中，各精密加pH4. 8檸檬酸鹽緩衝液O. 5ml，混勻，立即精密加入DNS試劑1. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫5 15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘， 再加水至刻度，搖勻，靜置廣2小時，以相應的試劑為空白，在540nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，葡萄糖量為橫坐標，繪製標準曲線。
上述的羧甲基纖維素酶活力的測定，其中上述具塞刻度試管容積為25ml。
上述的羧甲基纖維素酶活力的測定，其中上述猴頭菌培養物溶液為8 10 mg/ml, 且臨用新制。
上述的羧甲基纖維素酶活力的測定，其中上述羧甲基纖維素鈉溶液的配置方法是精密稱取1. Og羧甲基纖維素鈉，置具塞錐形瓶中，精密加入pH4. 8檸檬酸鹽緩衝液80ml，稱定重量，85±5°C邊加熱邊磁力攪拌至完全溶解，放冷，再稱定重量，用pH4. 8檸檬酸鹽緩衝液補足減失的重量，搖勻，以3mol/l鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調節pH至4. 8，轉移至IOOml 量瓶中，加PH4. 8檸檬酸鹽緩衝液至刻度，搖勻，即得1%羧甲基纖維素鈉溶液。
上述的羧甲基纖維素酶活力的測定，其中上述DNS試劑的配置方法是取結晶酚 6. 9g，加10%氫氧化鈉溶液15ml溶解後，加水稀釋至70ml，搖勻，再加入6. 9g亞硫酸氫鈉， 即得DNS甲液。取酒石酸鉀鈉255g，加10%氫氧化鈉溶液300ml溶解後，再加入1%3，5- 二硝基水楊酸880ml，搖勻，即得DNS乙液。取上述甲液與乙液混合，搖勻，置玻璃塞的棕色玻瓶中，4°C放置7天後使用。
本發明的測定方法是經過考察顯色劑用量、顯色時間、靜置時間、羧甲基纖維素鈉底物濃度、酶促反應溫度、酶促反應時間、酶液稀釋度等猴頭菌培養物活性成分酸性羧甲基纖維素酶活力測定的影響因素，以及該測定方法的精密度與適應性，最終確立的酸性羧甲基纖維素酶活力的測定方法。採用本發明進行酸性羧甲基纖維素酶活力的測定，測定方法簡便快速，測定現象清晰明了，測定結果準確可靠。
顯色劑DNS試劑用量對吸光度測定的影響精密量取O. 5mg/ml葡萄糖標準溶液1. 5ml置25 ml具塞刻度試管中，精密加入pH4. 8檸檬酸鹽緩衝液O. 5ml及不同體積的DNS 試劑，搖勻，置沸水浴中保溫30分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻， 靜置1. 5小時，在540nm波長處測定吸光度，結果如表I、
圖1所示。
表I顯色劑用量對吸光度測定的影響
體積(.ml)0.50.71.01.21.51.72.0540nm吸光度0.1470.1940.2780.32603670.3760.381
結果表明，當顯色劑DNS試劑用量小於1. 5ml時，吸光度隨顯色劑用量的增加而增大，當顯色劑用量大於1. 5ml時，吸光度則基本保持不變。因此，顯色劑DNS試劑的最適用量為1. 5ml。
顯色時間對吸光度測定的影響精密量取O. 5mg/ml葡萄糖標準溶液1. 5ml置25 ml具塞刻度試管中，精密加入pH4. 8檸檬酸鹽緩衝液O. 5ml及DNS試劑1. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫不同時間，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，靜置1. 5小時， 在540nm波長處測定吸光度，結果如表2、圖2所示。
表2顯色時間對吸光度測定的影響
時間Cmin)I3571012151720540ηηι吸光度0.1730.2870.3560.3680.3780.3840.3910.3920.392
結果表明，隨沸水浴顯色時間的延長，吸光度變大，但在15分鐘之後，吸光度較穩定。因此，沸水浴顯色時間確定為15分鐘。
靜置時間對吸光度測定的影響精密量取葡萄糖標準溶液1. 5ml置25 ml具塞刻度試管中，精密加入PH4 . 8檸檬酸鹽緩衝液O. 5ml及DNS試劑1. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫 15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，立即在540nm波長處進行時間程序掃描3小時，結果如圖3所示。
結果表明，當靜置時間小於1. 5小時時，隨靜置時間的增加，吸光度逐漸增加；當靜置時間大於2. O小時時，隨靜置時間的增加，吸光度逐漸減小；靜置時間在1. 5^2. O小時時，吸光度基本保持不變。因此，靜置1. 5小時後在540nm波長處測定吸光度。
羧甲基纖維素鈉底物濃度對酸性羧甲基纖維素酶活力測定的影響精密量取以 pH4. 8檸檬酸鹽緩衝液配置的濃度依次為O. 2%,O. 4%,O. 6%,O. 8%、1. 0%、L 2%、L 4%的羧甲基纖維素鈉底物溶液各1. 5ml,置25ml具塞刻度試管中，樣品管精密加入纖維素酶液O.5ml，空白管精密加入水O. 5ml，混勻，同時置50°C水浴中保溫30分鐘，取出，均立即精密加入DNS試劑1. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，靜置1. 5小時，在540nm波長處測定吸光度，結果如表3、圖4所示。
表3羧甲基纖維素鈉底物濃度對酶活力測定的影響
底物濃度(％)0.20.40.60.81.01.21.4540nm吸光度O L0.0890.1370.1670.1890.1950.198
結果表明，隨羧甲基纖維素鈉底物濃度的增大，酶活力測定結果也逐漸增加，當其濃度達到1.0%時，酸性羧甲基纖維素酶活力基本趨於平緩。因此，選擇1. 0%羧甲基纖維素鈉底物濃度進行酶活力的測定。
酶促反應溫度對酸性羧甲基纖維素酶活力測定的影響精密量取1. 0%羧甲基纖維素鈉溶液1. 5ml置25ml具塞刻度試管中，樣品管精密加入纖維素酶液O. 5ml,空白管精密加入水O. 5ml，混勻，於不同溫度水浴中保溫30分鐘，取出，立即精密加入DNS試劑1.5ml，搖勻，置沸水浴中保溫15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻， 靜置1. 5小時，在540nm波長處測定吸光度，結果如表4、圖5所示。
表4酶促反應溫度對酶活力測定的影響
權利要求
1.一種羧甲基纖維素酶活力的測定方法，包括如下步驟 (1)猴頭菌培養物溶液的製備猴頭菌培養物經粉碎，過篩，以適量水溶解，振搖2 4小時，濾過，定容。
(2)吸光度測定精密量取1%羧甲基纖維素鈉溶液I.5ml置具塞刻度試管中，精密加猴頭菌培養物溶液O. 5ml，混勻，置45飛5°C水浴中保溫25 35分鐘，取出，立即精密加入DNS試劑I. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫5 15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，靜置廣2小時，以空白管進行調零，在540nm波長處測定吸光度。空白管加1%羧甲基纖維素鈉溶液I. 5ml，置45飛5°C水浴中保溫25 35分鐘，取出，精密加猴頭菌培養物溶液O. 5ml，混勻，立即精密加入DNS試劑I. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫5 15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，靜置廣2小時。
(3)計算羧甲基纖維素酶活力從葡萄糖標準曲線上讀出猴頭菌培養物溶液中還原糖的重量(mg)，按照下式計算羧甲基纖維素酶活力 U=AX 1/0. 5XnX2 式中U——每Ig含酸性羧甲基纖維素酶活力單位，U/g ； A——吸光度在標準曲線上查得的還原糖重量，mg ； η——樣品稀釋倍數； 2—時間換算係數。
Ig固體酶在50±1°C、ρΗ4. 8條件下，I小時水解1%羧甲基纖維素鈉底物，產生出相當於I mg葡萄糖的還原糖量為一個酸性羧甲基纖維素酶活力單位，以U/g表示。
2.如權利要求I所述的羧甲基纖維素酶活力的測定方法，其特徵在於步驟(3)所述的葡萄糖標準曲線測繪方法為分別精密量取O. 2 mg/ml>O. 4 mg/ml>O. 6 mg/ml>O. 8 mg/ml、I.Omg/ml的葡萄糖對照品溶液I. 5ml，置具塞刻度試管中，各精密加pH4. 8檸檬酸鹽緩衝液O.5ml，混勻，立即精密加入DNS試劑I. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫5 15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，靜置廣2小時，以相應的試劑為空白，在540nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，葡萄糖量為橫坐標，繪製標準曲線。
3.如權利要求I所述的羧甲基纖維素酶活力的測定，其特徵在於上述具塞刻度試管容積為25ml。
4.如權利要求I所述的羧甲基纖維素酶活力的測定，其特徵在於上述猴頭菌培養物溶液為8 10 mg/ml,且臨用新制。
5.如權利要求I所述的羧甲基纖維素酶活力的測定，其特徵在於上述羧甲基纖維素鈉溶液的配置方法是精密稱取I. Og羧甲基纖維素鈉，置具塞錐形瓶中，精密加入PH4. 8檸檬酸鹽緩衝液80ml，稱定重量，85±5°C邊加熱邊磁力攪拌至完全溶解，放冷，再稱定重量，用PH4. 8檸檬酸鹽緩衝液補足減失的重量，搖勻，以3mol/l鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調節pH至4. 8，轉移至IOOml量瓶中，加pH4. 8檸檬酸鹽緩衝液至刻度，搖勻，即得1%羧甲基纖維素鈉溶液。
6.如權利要求I所述的羧甲基纖維素酶活力的測定，其特徵在於，上述DNS試劑的配置方法是取結晶酚6. 9g，加10%氫氧化鈉溶液15ml溶解後，加水稀釋至70ml，搖勻，再加入.6.9g亞硫酸氫鈉，即得DNS甲液。取酒石酸鉀鈉255g，加10%氫氧化鈉溶液300ml溶解後，再加入1%3，5-二硝基水楊酸880ml，搖勻，即得DNS乙液。取上述甲液與乙液混合，搖勻，置玻璃塞的棕色玻瓶中， 4°C放置7天後使用。
全文摘要
本發明涉及一種羧甲基纖維素酶活力測定方法。經過考察顯色劑用量、顯色時間、靜置時間、羧甲基纖維素鈉底物濃度、酶促反應溫度、酶促反應時間、酶液稀釋度等猴頭菌培養物活性成分酸性羧甲基纖維素酶活力測定的影響因素，以及該測定方法的精密度與適應性，最終確立了酸性羧甲基纖維素酶活力的測定方法。本發明具有測定方法簡便快速，測定現象清晰明了，測定結果準確可靠。
文檔編號G01N21/31GK102980856SQ20121015457
公開日2013年3月20日 申請日期2012年5月17日 優先權日2012年5月17日
發明者何述金, 常耀臺, 賈林, 周代俊, 周準 申請人:何述金