大麻藥中抗腫瘤活性組分大麻藥黃酮a的提取方法
2023-12-03 01:52:41
專利名稱：大麻藥中抗腫瘤活性組分大麻藥黃酮a的提取方法
技術領域：
本發明屬於物質的分離技術領域，涉及包含以吸附劑處理液體的分離方法，具體為以樹脂為吸附劑、以移動溶劑為吸附劑取代被置換的液體的方法來分離固體物中的有效成分。同時，還涉及抗腫瘤活性藥物。
背景技術：
癌症是嚴重危害人民生命健康的重大疾病，世界上每年有600多萬人死於惡性腫瘤。目前臨床上使用的治療藥物主要是傳統的細胞毒類化學合成抗腫瘤藥物，雖然部分藥物抗腫瘤作用明顯，但毒副作用大，選擇性較差，容易產生耐藥性。中醫藥學是一門積澱中華民族幾千年來防病治病的實踐經驗結晶，具有鮮明的理論體系，又能體現辨證論治和個體化治療時代特徵的生命科學。中醫能辨西醫不明之症，中藥能治西藥難治、不治之症。因此抗腫瘤中藥的研究越來越收到國內外醫藥界的重視和青睞。
大麻藥為豆科植物鐮果扁豆[Dolichos tenuicaulis(Baker)Craibs]的根，分布於貴州和雲南等地，具有消腫止痛、解毒排膿和抗腫瘤等功效。有關大麻藥化學成分和藥理活性的研究報導較少[田成國，等.中草藥通訊，1977，(2)8～12.黃厚聘，等.中國藥理學報，1983，(4)286～288.]，因此醫藥界急切希望得到該植物有效成分，並對其化學結構、藥理、藥性和在抗腫瘤的作用有所了解，然而至今未見提取其中有效成分和記載其化學結構的報導。
發明內容
針對現有技術存在的缺陷，本發明的目的是提供一種從民族藥用植物大麻藥中提取、分離、純化其具有明顯抗腫瘤活性的組分的方法，分析、測試並確定其化學結構，並測定其抗腫瘤的活性。
本發明的實施方案包括藥材提取、粗提物製備及粗提物的分離純化三道工序工序(1)採用一定濃度的乙醇提取藥材獲取提取物，工序(2)採用大孔吸附樹脂層析得到粗提物，工序(3)採用高速逆流色譜法對粗提物進行分離純化，它包括配製構成固定相、流動相的溶劑體系，使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然後使柱子轉動，再將流動相泵入柱內，由進樣閥進入製備好的粗提物樣品，根據檢測圖譜接收目標組分。具體方法是1.藥材提取取大麻藥適當粉碎後，用6～8倍量的75％～95％乙醇熱提取2～3次，每次1.0～2.0h，合併提取液，減壓濃縮至浸膏。粉碎的藥材以粒徑為0.5～20.0mm為宜。熱提取時以回流狀態下提取效果為好。
2.粗提物製備，取一定量預處理好的弱極性大孔吸附樹脂裝到層析柱中，用水反覆衝洗後將全方提取物浸膏(樹脂與藥材用量比為0.5～1∶1)，吸附完全後，用大量水充分洗去糖分和無機鹽等雜質，再依次用3～5倍藥材量的30％～50％乙醇洗脫，4～6倍藥材量的75％～95％乙醇洗脫，接收相應的乙醇洗脫流份，以此為進一步分離純化樣品提供原料。其中最好使用3～4倍藥材量40～50％乙醇和4～5倍藥材量85～95％乙醇溶液洗脫，洗脫液分成若干份，將其中組分相近數份合併，減壓蒸餾並回收乙醇後真空乾燥得目標成分。大孔樹脂以包括1300、D101或AB-8在內的品種為好。在操作中對吸附完全後用大量水充分洗去糖分和無機鹽等雜質的標誌是洗脫水無色，用水量大約為藥材量的6～7倍。實踐中乙醇洗脫液接取時分成35～45等份，取中間第3～10份合併減壓蒸除乙醇效果為好。
3.分離純化應用高速逆流色譜分離純化，它包括步驟配製構成固定相、流動相的溶劑體系，使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然後使柱子轉動，再將流動相泵入柱內，由進樣閥進樣，根據檢測譜圖接收目標成分，所用溶劑體系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成，其用量比為1∶1.8～2.2∶1.8～2.2∶1。
4.分離物的純度檢測與結構鑑定採用高效液相色譜法對分離所得組分進行純度檢測(峰面積歸一化法)純度大於98.0％，揮幹溶劑後進行MS、1H NMR和13C NMR分析，根據所得數據進行結構確認。其化學結構為
其化學名稱為(2S)-5，2′，6′-三羥基-3，8-二異戊烯基-2，2-二甲基吡喃-[5，66，7]-2 ″″′，4″″′-環己二烯-1′″″-酮-[2′″″，3′″″3′，4′]-二氫黃酮。屬於黃酮類化合物(以下簡稱大麻藥黃酮A dolichnin A)。
5.所得化合物的抗腫瘤活性試驗採用MTT法考察了所得化合物體外對5種人腫瘤細胞株(BEL-7402、SGC-7901、MCF-7、HT-29和A498)的生長抑制作用。結果該化合物對所選5種人腫瘤細胞株的半數抑制濃度均小於4.5μg/ml。
同時也進行了該化合物對小鼠體內S180移植性肉瘤生長的抑制作用試驗。
建立小鼠體內S180移植性肉瘤模型，腹腔注射該化合物，並與陽性對照藥環磷醯胺對照，計算該化合物的抑瘤率，同時觀察該化合物對小鼠的免疫系統和白細胞的影響。結果表明在腹腔注射給藥10mg/kg時，該化合物的抑瘤率達到了61％以上。
本發明對從藥用植物中提取、分離、純化大麻藥黃酮I的工藝合理有效，特別是採用高速逆流色譜對中藥粗提物進行分離純化簡便、快速，同時也避免了樣品損失。克服了傳統製備方法操作繁瑣、分離周期長等缺點，並具有製備量大、分離效率高、產品純度好、簡便易行等優點。同時，經過分析測試，確定其化學結構式，證明這是一個未見報導的新化合物。另外，也為抗腫瘤藥物提供一個具有良好應用前景的新品種。
圖1為大孔吸附樹脂層析物的半製備型高速逆流色譜(HSCCC)的色譜圖(色譜峰I為大麻藥黃酮A)圖2為大孔吸附樹脂粗提物及分離部分的高效液相色譜(HPLC)的色譜圖(圖2A為粗提物的HPLC色譜圖，圖2B為製備流份純度檢測HPLC色譜圖)圖3為化合物大麻藥黃酮A的質譜和紫外圖。
圖4為大麻藥黃酮A體內抗S180肉瘤試驗各給藥組肉瘤的病理切片下面結合具體實施例及附圖對本發明進一步說明。
具體實施例方式
實施例1化合物大麻藥黃酮A(dolichnin A)的提取和結構鑑定。其步驟為1.稱取大麻藥粗粉5.0kg，粒徑0.8～20.0mm，用8倍量80％乙醇回流提取兩次，每次1.5h，過濾，合併濾液，減壓濃縮至浸膏約2000ml。
2.稱取4000g D101大孔吸附樹脂，用95％乙醇浸泡過夜後，再用水浸泡過夜後加到層析柱上(10.0×120cm)，用大量水反覆衝洗。將全方提取物加到樹脂上端，打開活塞，流速為25ml/min，上樣完成後，關閉活塞，靜止吸附約1小時，接著用6倍藥材量的水(30L)衝洗樹脂至洗脫液幾乎無色為止，接著用3倍藥材量的40％乙醇(15L)洗脫，再用4倍藥材量的85％乙醇(20L)洗脫，每1000ml為一接收流份，合併其中的5～9流份，減壓回收乙醇後真空乾燥，得淺黃色粉末，以此為進一步分離純化用樣品。
3.應用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)分離純化大孔吸附樹脂所接收流份。
溶劑體系及用量體積比為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶2∶2∶1，逆流色譜柱體積為300ml，上樣量400mg，轉速850rpm，上相為固定相，下相為流動相，流速1.8ml/min，固定相保留率58.5％，檢測波長280nm，在此情況下記錄的色譜圖見圖1。
具體的操作步驟是按上述溶劑體積比配製溶劑體系，在分液漏鬥中充分振搖後靜止分層，分取上下相，上相為固定相，下相為流動相。先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然後使主機轉動，再泵入流動相，由進樣閥進樣，根據檢測器譜圖接收目標成份，結果分離得到1個部分，即流份「I」。
對該部分進行高效液相分析表明「I」為單一色譜峰，峰純度為98.6％。
HPLC分析條件色譜柱Lichrospher C18(150mm×4.6i.d.，5μm)，流動相為CH3CN∶H2O∶HAC＝60∶40∶2，流速1.0ml/min，檢測波長280mn，在此條件下大孔吸附樹脂層析物及HSCCC分離部分色譜圖見圖2。峰1為大麻藥黃酮A。
結構鑑定對分離得到的大麻藥黃酮A在Varian INOVA-500型核磁共振儀和Varian MAT-212型質譜儀上，進行1H NMR、13C NMR和MS分析，所得數據如下。
白色粉末，mp213～214℃，[α]D25-120(c.0.80，CH3OH)，UVλmax(nm，MeOH)340，294，220nm(見圖3)；ESI-MSm/z583.2[M-H]-(見圖3)。HR-ESI-MSm/z583.2148(calcd.583.2142)，分子式為C36H40O74。13C NMR和1H NMR數據見下表1。
表1 所得化合物的13C NMR和1H NMR數據
實施例21.稱取大麻藥粗粉5.0kg，粒徑0.5～20.0mm，用6倍量90％乙醇回流提取兩次，每次2h，過濾，合併濾液，減壓濃縮至浸膏約2000ml。
2.稱取5000g AB-8大孔吸附樹脂，用95％乙醇浸泡過夜後，再用水浸泡過夜後加到層析柱上(10.0×120cm)，用大量水反覆衝洗。將全方提取物加到樹脂上端，打開活塞，流速為25ml/min，上樣完成後，關閉活塞，靜止吸附約1小時，接著用6倍藥材量的水(30L)衝洗樹脂至洗脫液幾乎無色為止，接著用4倍藥材量的50％乙醇(20L)洗脫，再用5倍藥材量的95％乙醇(25L)洗脫，每2500ml為一接收流份，合併其中的3～7流份，減壓回收乙醇後真空乾燥，得淺黃色粉末，以此為進一步分離純化用樣品。
3.應用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)分離純化大孔吸附樹脂所接收流份。
溶劑體系及用量體積比為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶2.2∶2.2∶1，逆流色譜柱體積為300ml，上樣量400mg，轉速900rpm，上相為固定相，下相為流動相，流速1.6ml/min，固定相保留率61.3％，檢測波長280nm。
具體的操作步驟同實施例1，對分離所得流份進行HPLC分析和結構分析，分析結果均同實施例1。
實施例3化合物大麻藥黃酮A的體內、體外抗腫瘤實驗選擇5種人腫瘤細胞株，BEL-7402、SGC-7901、MCF-7、HT-29和A498在含10％小牛血清的RPMI-1640培養液、37℃、5％CO2培養箱生長至細胞旺盛，經0.25％胰酶加0.02％EDTA消化，製成細胞懸液，將細胞懸液接種於96孔微量培養板中(細胞濃度為5×105個/ml)，給藥組分別加入不同濃度的化合物，對照組加入相應的溶劑，給藥後培養72小時，按MTT法用酶標儀在550nm波長處測定吸光度(A)值，計算化合物的抑制率，由抑制率和樣品濃度繪製相應的抑制曲線，再計算出半數抑制濃度(IC50)。該化合物對各腫瘤細胞株的IC50值見下表2。
表2大麻藥黃酮A對5種人腫瘤細胞株的IC50值
取本室自己傳代呈對數生長期的S180小鼠腹水，用生理鹽水稀釋成2×107/ml，取0.2ml接種於小鼠右腋皮下。小鼠接種後第二天灌胃給藥，空白組給予生理鹽水0.2ml，陽性對照組給腹腔注射CTX0.2ml(20mg/kg)，各治療組分別給予化合物化合物大麻藥黃酮A2.5mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg注射用油溶解後腹腔注射給藥)，連續10天，於次日處死。小鼠處死前眼眶取血，並作白細胞(WBC)計數，之後行脫臼處死小鼠。
剝取肉瘤組織同時取小鼠脾臟和胸腺，稱重後按照下式計算抑瘤率，並計算脾指數和胸腺指數。小鼠服用CTX後，被毛疏鬆，精神較差，飲水飲食減少，與對照組相比體重增加緩慢，但對腫瘤的抑瘤作用十分突出，抑瘤率高於61％。腹腔注射該化合物後的小鼠飲食良好，行動自如，體重與模型組相比無顯著性差異，腫瘤生成時間延後，瘤塊生長緩慢。所得結果表明本工藝製備得到的化合物具有很強的抑制小鼠體內S180肉瘤生長的作用，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。同時，該化合物與CTX配伍給藥後，能明顯見降低小鼠脾指數的升高和胸腺指數的降低，高劑量時的作用尤為顯著(P＜0.01)。白細胞計數表明該製備物能明顯升高由CTX所造成的小鼠白細胞降低(P＜0.01)。
同時，我們也對小鼠S180肉瘤進行了常規石蠟切片和顯微分析，如圖4所示。由圖可知模型組腫瘤細胞生長旺盛，各給藥組腫瘤細胞都有不同程度的死亡，尤其是CTX和給藥高劑量組，腫瘤細胞死亡比例較大，病理切片表明CTX和該化合物都能殺死一定量的腫瘤細胞，從而抑制肉瘤的生長，與上述實驗所得數據一致，具體見表3、4和5。
表3大麻藥黃酮A對S180肉瘤的抑制作用(mean±S)
注與模型組相比ΔP＜0.05；與模型組相比ΔΔP＜0.01；與CTX組相比#P＜0.05
表4大麻藥黃酮A與CTX配伍對移植性小鼠S180肉瘤生長的抑制作用(mean±S)
注與模型組相比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01表5 大麻藥黃酮A與CTX配伍對荷瘤小鼠脾指數、胸腺指數和白細胞數的影響(mean±S)
注與CTX組相比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.0權利要求
1.大麻藥中抗腫瘤活性組分大麻藥黃酮A的提取方法，包括藥材提取、粗提物製備及分離純化三步，其工藝為(1)採用6～8倍藥材量75～95％乙醇熱提取2～3次，每次1.0～2.0h，合併提取液，減壓濃縮至浸膏；(2)採用弱極性大孔吸附樹脂為吸附劑進行柱層析，樹脂與藥材的重量比為0.5～1.1；將所得浸膏入大孔層析柱吸附，吸附後先用大量水充分洗去糖分和無機鹽等雜質，再依次用3～5倍藥材量30～50％乙醇和4～6倍藥材量75～95％乙醇溶液洗脫，洗脫液分成若干份，將其中成分相近份合併，減壓蒸餾並回收乙醇後真空乾燥得目標成分；(3)採用高速逆流色譜法對所得大孔吸附樹脂層析物進行分離純化，高速逆流色譜法中所用的兩相溶劑體系及用量體積比為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶1.8～2.2∶1.8～2.2∶1，在分液漏鬥中充分振搖後靜止分層，上相為固定相，下相為流動相，操作時先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然後使主機轉動，再泵入流動相，由進樣閥進樣，根據檢測器譜圖接收目標成份。
2.根據權利要求1所述大麻藥中抗腫瘤活性組分大麻藥黃酮A的提取方法，其特徵在於所述藥材提取中的藥材為經破碎粒徑為0.5～20.0mm；所述熱提取為回流狀態下提取。
3.根據權利要求1所述大麻藥中抗腫瘤活性組分大麻藥黃酮A的提取方法，其特徵在於所述粗提物製備中所使用大孔樹脂為弱極性樹脂，如1300、D101、AB-8弱極性型樹脂中的一種。
4.根據權利要求1所述大麻藥中抗腫瘤活性組分大麻藥黃酮A的提取方法，其特徵在於所述粗提物製備中吸附後先用大量水充分洗去糖分和無機鹽等雜質為用6～7倍藥材量的水衝洗樹脂至洗脫液幾乎無色為止。
5.根據權利要求1所述大麻藥中抗腫瘤活性組分大麻藥黃酮A的提取方法，其特徵在於所述粗提物製備中乙醇洗脫和洗脫液的接取為使用3～4倍藥材量40～50％乙醇和4～5倍藥材量85～95％乙醇溶液洗脫，乙醇洗脫液接取時分成35～45等份，取中間第3～10份合併減壓蒸除乙醇。
6.根據權利要求1所述大麻藥中抗腫瘤活性組分大麻藥黃酮A的提取方法，其特徵在於所述分離純化步驟中，溶劑體系及用量體積比為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶2∶2∶1，逆流色譜柱體積為300ml，上樣量400mg，轉速850rpm，上相為固定相，下相為流動相，流速1.8ml/min，固定相保留率58.5％，檢測波長280nm。
全文摘要
藥用植物大麻藥中具有明顯抗腫瘤活性化合物大麻藥黃酮A(dolichninA)的提取方法。包括(1)藥材提取乙醇熱提取2～3次，合併提取液，減壓濃縮至浸膏；(2)粗提物製備大孔樹脂吸附，乙醇洗脫，合併近似組分，蒸出乙醇(3)所得粗提物的高速逆流色譜分離純化，由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水構成固定相、流動相的溶劑體系，色譜儀柱中充滿固定相，柱子轉動後將流動相泵入柱內，進樣。根據檢測譜圖接收目標成份，經一步洗脫得到高純度的產物。工藝合理有效，特別、簡便、快速。同時，經過分析測試，確定其化學結構式，證明是從未見過報導的全新化合物。另外，為抗腫瘤藥物提供一個具有良好應用前景的新品種。
文檔編號A61P35/00GK1962665SQ20061013443
公開日2007年5月16日 申請日期2006年12月1日 優先權日2006年12月1日
發明者彭金詠, 董福秋, 齊豔, 許有威, 韓旭, 許麗娜, 徐奇瑋, 劉克辛 申請人:大連醫科大學