檢測牛奶中結合珠蛋白含量的免疫傳感器及檢測方法
2023-12-02 19:22:21 1
專利名稱：檢測牛奶中結合珠蛋白含量的免疫傳感器及檢測方法
技術領域：
本發明屬於生物化學及電化學技術領域，特別涉及針對奶牛隱形 乳腺炎的重要標誌物一牛奶中結合珠蛋白含量的快速檢測方法。
背景技術：
奶牛乳腺炎(mastitis)是所有奶牛疾病中發病率最高、危害最為 嚴重的一種乳腺炎症性疾病，主要包括臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎兩 種類型，其中又以隱性乳腺炎的發病最為普遍。隱性乳腺炎的發生可 引起奶牛的產奶量下降，並導致牛奶中體細胞數量(SCC)升高而降 低乳品質量。若處理不當，則有可能發展成為臨床型乳腺炎，帶來更 大的危害。因此，對隱性乳腺炎進行適時、準確的監測是奶牛場最為 重要的工作。由於隱性乳腺炎患牛缺乏明顯的乳腺炎症表現，臨床上必須藉助 特殊手段才能建立該病的診斷。現階段臨床上診斷奶牛隱性乳腺炎的 常規方法包括牛奶體細胞計數法和乳汁細菌培養法。體細胞計數又包 括採用體細胞計數儀進行直接計數和採用CMT法(加利福利亞乳腺 炎檢測方法)進行間接計數兩種方法。丹麥福斯公司生產的系列體細 胞計數儀是目前唯一商品化的體細胞計數裝置，但該類儀器的價格非 常昂貴，檢測成本亦較高，很難在國內中小牛場普及；CMT法以及國內一些研究機構根據CMT原理開發出來的HMT法、SMT法等不 需特殊設備，檢測成本較低廉，但容易出現假陽性或假陰性反應，檢 測結果的可靠性相對較低。乳汁細菌培養法是診斷奶牛隱性乳腺炎較 為可靠的一種方法，但存在檢測過程耗時較長、不能進行實時在線診 斷等缺點。可用於診斷隱性乳腺炎的方法還包括牛奶電導率檢驗法、 酶類檢測法、PCR檢測法等，這些檢測方法或者要求苛刻的檢測條件， 或者要求較高的專業技能，難以在基層單位推廣應用。
近年來的科學研究表明，牛奶中結合珠蛋白(Haptoglobin, Hp) 的含量升高可作為診斷奶牛隱性乳腺炎的敏感指標，目前國外已有商 品化的檢測牛結合珠蛋白的ELISA試劑盒問世。雖然ELISA檢測方 法具有靈敏度高、特異性強的優點，但亦存在檢測成本高、操作步驟 繁瑣等不足。
鑑於奶牛隱性乳房炎的嚴重危害及以上診斷方法的缺點和局限 性，臨床上急需一種快速、靈敏、操作簡單、檢測成本低廉且能實現 在線診斷的檢測方法。
免疫傳感器檢測技術是將免疫檢測技術與傳感檢測技術相結合 而形成的一類新型檢測技術，是生物傳感器領域發展最迅速的技術之 一，具有靈敏度高、特異性強、檢測快速、使用簡便、低成本和容易 實現在線檢測等許優點。電流型免疫傳感器是免疫傳感器的一種類 型，通常由轉換元件(支持電極)、生物敏感元件(抗體或抗原修飾 的工作電極)、電解池以及數據採集與處理系統組成，通過檢測抗原-抗體反應前後電流的變化而實現定性/定量檢測。近十餘年來，電流型免疫傳感器在醫學、動物醫學、環境分析和食品安全檢測等多領域 中得到了廣泛的研究，其中工作電極上生物分子的組裝技術一直是該 研究領域的關鍵內容。
發明內容
本發明的目的在於提供了一種檢測牛奶中結合珠蛋白含量的免 疫傳感器，包括工作電極、輔助電極和參比電極，其特徵在於，免疫 傳感器的工作電極為金電極，金電極上結合有納米金顆粒，納米金顆 粒上連接有抗結合珠蛋白抗體。
進一步地，所述的金電極為圓盤金電極，輔助電極為鉑絲電極，
參比電極為Ag/AgCl標準電極。
更進一步地，所述納米金粒子的直徑為15~25nm。 本發明的免疫傳感器以電化學三電極系統為基本裝置，以圓盤金 電極為工作電極，在金電極上組裝納米金顆粒，納米金顆粒上連接抗 結合珠蛋白抗體，利用抗體-抗原的特異性親和作用捕獲牛奶中的待 測抗原——結合珠蛋白，採用循環伏安法檢測免疫反應前後傳感器的 電流變化，實現對牛奶中結合珠蛋白的定量檢測。
本發明免疫傳感器結構簡單，在製備時，首先對金電極表面進行 拋光等預處理，以氯金酸溶液為電解質溶液、用循環伏安法使金離子 在電極表面發生還原反應產生金單質，金單質以納米粒子形態沉積在 電極表面，再通過納米金粒子吸附抗結合珠蛋白抗體，用小牛血清封 閉非特異性結合位點，製得工作電極，最後將工作電極與參比電極、輔助電極組裝形成納米金免疫傳感器。
本發明還提供了一種使用上述免疫傳感器檢測牛奶中結合珠蛋 白含量的方法，其特徵在於包括以下步驟-
a. 將已知濃度的結合珠蛋白抗原溶液進行梯度稀釋，分別將權 利要求1所述免疫傳感器在上述結合珠蛋白抗原溶液中浸泡30分鐘後 放入電解池溶液中，設置掃描電壓為-0.2V-0.6V、掃描速度0.1V/s，進 行循環伏安掃描檢測，得到一系列氧化峰電流下降百分比數據，將該 數據與結合珠蛋白抗原溶液的濃度建立關聯，得結合珠蛋白抗原溶液 的工作曲線圖和線性回歸方程；
b. 取待測的新鮮牛奶樣品，3000rpm離心10分鐘，取乳清用超純 水稀釋，將上述免疫傳感器在稀釋液中浸泡30分鐘後放入電解池溶液 中，設置掃描電壓為-0.2V-0.6V、掃描速度0.1V/s，進行循環伏安掃描 檢測，得氧化峰電流下降百分比數據，將該數據代入步驟a所得線性 回歸方程，計算得出牛奶樣品中結合珠蛋白的含量。
進一步地，所述的電解池溶液含5mM鐵氰化鉀、5mM亞鐵氰化 鉀、0.1M氯化鉀。
本發明檢測方法通過採用循環伏安法檢測抗體與被檢抗原反應 前後傳感器的電流響應變化，確定被檢抗原的含量。
將標準濃度的抗原溶液按照繪製標準曲線的要求進行系列稀 釋，分別用本發明的免疫傳感器對上述抗原溶液進行循環伏安掃描檢 測，可得到一系列氧化峰電流(力下降百分比數據^式中力為免疫反應前的氧化峰電流，A為免疫反應後的氧化峰電流。
分別以峰電流電流下降百分比《及與其相對應的抗原濃度為縱
坐標和橫坐標，用Excel軟體處理繪製標準曲線圖，獲得其相應的回 歸方程，並對該方法組裝的免疫傳感器檢測的靈敏性、特異性和穩定 性進行分析。
當檢測牛奶樣品中的結合珠蛋白含量時，用本發明的免疫傳感器 對樣品溶液進行循環伏安掃描檢測，計算得出氧化峰電流(力下降百 分比A，將該數據代入上述線性回歸方程，計算得出牛奶樣品中結合 珠蛋白的含量。
本方法基於電流型免疫傳感器，採用電化學循環伏安掃描法對牛 奶中結合珠蛋白進行定量測定，操作簡單、檢測快速、靈敏度高、檢 測成本低廉、易於推廣，可作為臨床上通過檢測牛奶中結合珠蛋白含 量而建立奶牛隱性乳腺炎診斷的一種實用、簡便的方法。
圖1為本發明納米金免疫傳感器檢測結合珠蛋白的工作曲線。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明的內容作進一步的說明。
實施例l:製備納米金免疫傳感器 1)溶液的配置Piranha溶液98%濃硫酸和30%過氧化氫溶液按體積比為3 : l的 比例配製。
氯金酸電解液溶液:將lg氯金酸溶解到100ml純水中配製成1% 氯金酸溶液，再取lml 1%的氯金酸溶液加入到30ml 0.5M稀硫酸溶 液中，混合均勻。
電解池溶液稱取0.0832g鐵氰化鉀，0.1056g亞鐵氰化鉀，0.3728g 氯化鉀溶解到50ml純水中。 2)製備納米金免疫傳感器
將圓盤金電極依次用直徑為l(im、0.3^im和0.05pm的氧化鋁粉末拋 光至光亮，用上述配製好的Pimnha溶液浸泡10分鐘，再依次浸泡於無 水乙醇和雙蒸水中超聲波清洗15分鐘，將清洗後的電極放入0.5M硫 酸溶液中，用循環伏安法在-0.3 1.5V電壓下拋光30分鐘，晾乾備用。
以上述配製的氯金酸電解液為底液，採用線性循環伏安掃描法， 設置起始電壓為1.1V，末電壓為OV，掃面速度0.1V/s，掃描圈數為l 圈，在圓盤金電極上沉積納米金顆粒，所得納米金顆粒的直徑約為 20nm，得納米金電極。
將納米金電極浸入0.5嗎/ml的牛結合珠蛋白抗體溶液中，室溫下 孵育20分鐘後取出，用0.25%小牛血清封閉15分鐘，純水洗淨後晾乾 備用，得納米金免疫電極。
將免疫電極與參比電極、輔助電極組裝形成納米金免疫傳感器。
在納米金免疫電極的製備過程中，採用循環伏安法(電壓 -0.2V-0.6V，掃描速度0.1V/s，電解池溶液為5mM鐵氰化鉀，5mM亞鐵氰化鉀，0.1M氯化鉀溶液)對每一步處理進行表徵。
實施例2:結合珠蛋白的檢測 1)繪製工作曲線
將牛結合珠蛋白標準抗原(濃度為0.77mg/ml)分別稀釋至 1540ng/ml、 770ng/ml、 385ng/ml、 154ng/ml、 77ng/ml、 38.5 ng/ml、 7.7ng/ml、 3.85 ng/ml、 1.54 ng/ml和0.77 ng/ml。
用實施例l所製得的納米金免疫傳感器分別在上述濃度的標準抗 原溶液中浸泡30分鐘後，採用循環伏安法對牛結合珠蛋白標準抗原進 行定量檢測，以免疫反應前後氧化峰電流O')下降的百分比《作為 定量依據。
加(厶-力)/厶x1000/0，
式中力為免疫反應前的氧化峰電流，力為免疫反應後的氧化峰電流。
對每一濃度標準抗原檢測三次，取氧化峰的平均值作為每一標準 抗原濃度所對應的峰電流值。以標準抗原濃度的對數值為橫坐標 (X)， W直為縱坐標(Y)，用Excel軟體處理並繪製標準曲線，即得 到標準抗原溶液的工作曲線圖(如圖l所示)和其相關的線性回歸方
程
Y=0.2672X-0.0567
其中X二log^C， C為抗原濃度，Y為氧化峰下降百分比)，線性相 關係數R2 = 0.9959，滿足定量分析方法對精密度的要求。牛結合珠蛋白抗原的稀釋濃度(V=V標準抗原V水)在7ng/ml(V=l: 100000) 350ng/ml (V=l: 2000)時，免疫傳感器氧化峰電流(i)下降的百分數A與抗原濃度的以IO為底的對數呈良好的線
性關係。
2)牛奶樣品中結合珠蛋白的檢測
取待測新鮮牛奶2ml， 3000rpm (離心力為603g)離心10分鐘，棄乳脂，用超純水稀釋1000倍。室溫下，將免疫傳感器在乳清稀釋液中浸泡孵育30分鐘，取出放入電解池溶液中，設置掃描電壓為-0.2V-0.6V、掃描速度0.1V/s，進行循環伏安掃描檢測，計算出其氧化峰下降百分比h對每一樣品使用不同工作傳感器連續測量三次，K值分別為1.94， 1.86， 1.92 ，取其平均值1.91代入上述回歸方程Y二0.2672X-0.0567中，計算出結合珠蛋白的含量為92ng/ml。乘以乳清的稀釋倍數IOOO，得被測牛奶中的結合珠蛋白含量為92ug/ml。
實施例3:回收率試驗
取3份牛結合珠蛋白抗原溶液進行稀釋後，按實施例2所述步驟測定結合珠蛋白含量，測定結果如下表
樣號 加入濃度(ng/ml) 回收量(ng/ml) 回收率(％)
1 15.4 14.85 96.44
2 77 71.96 93.45
3 154 137.26 89.13其平均回收率為93.01%，相應的回收率的標準偏差(RSD)為0.09%，符合定量分析方法的精密度要求。
實施例4:穩定性試驗
取3份牛結合珠蛋白標準抗原溶液進行稀釋後，按實施例2所 述步驟測定結合珠蛋白含量；重新製備納米金免疫傳感器，置4。C冰 箱中保存48h後，重新測定3份同樣濃度標準抗原溶液，測定結果如
樣號第 一 次測量濃度放置48h後測量濃度 偏差％ (ng/ml) (ng/ml)
1 14.8514.02 5.59
2 137.26 149.35 8.10
3 71.96 75.12 4.21 平均偏差為6.07%，說明傳感器穩定性良好。
實施例5:重複性試驗
製備2個納米金免疫傳感器，分別標記為1#， 2#傳感器。取3 份牛結合珠蛋白標準抗原溶液進行稀釋後，分別用1#， 2#傳感器檢 測，測量結果如下表-
樣號1#傳感器測量濃度 2#傳感器測量濃度 偏差％
(ng/ml) (ng/ml)
1 57.98 63.29 8.39
122 74.06 83.47 11.27
3 7.311 7.590 3.68
用2個傳感器一起檢測三組抗原溶液，同一濃度下傳感器之間檢測偏差分別為8.39%， 11.27%和3.68% 。平均偏差為7.79%，符合免疫傳感器重複性要求。
權利要求
1、檢測牛奶中結合珠蛋白含量的免疫傳感器，包括工作電極、輔助電極和參比電極，其特徵在於，免疫傳感器的工作電極為金電極，金電極上結合有納米金顆粒，納米金顆粒上連接有抗結合珠蛋白抗體。
2、 如權利要求1所述檢測牛奶中結合珠蛋白含量的免疫傳感器， 其特徵在於所述的金電極為圓盤金電極，輔助電極為鉑絲電極，參比 電極為Ag/AgCl標準電極。
3、 如權利要求2所述檢測牛奶中結合珠蛋白含量的免疫傳感器， 其特徵在於所述納米金粒子的直徑為15 25nm。
4、 檢測牛奶中結合珠蛋白含量的方法，其特徵在於包括以下步驟a. 將已知濃度的結合珠蛋白抗原溶液進行梯度稀釋，分別將權 利要求1所述免疫傳感器在上述結合珠蛋白抗原溶液中浸泡30分鐘後 放入電解池溶液中，設置掃描電壓為-0.2V-0.6V、掃描速度0.1V/s，進 行循環伏安掃描檢測，得到一系列氧化峰電流下降百分比數據，將該 數據與結合珠蛋白抗原溶液的濃度建立關聯，得結合珠蛋白抗原溶液 的工作曲線圖和線性回歸方程；b. 取待測的新鮮牛奶樣品，3000rpm離心10分鐘，取乳清用超純 水稀釋，將權利要求1所述免疫傳感器在稀釋液中浸泡30分鐘後放入 電解池溶液中，設置掃描電壓為-0.2V-0.6V、掃描速度0.1V/s，進行循 環伏安掃描檢測，得氧化峰電流下降百分比數據，將該數據代入步驟 a所得線性回歸方程，計算得出牛奶樣品中結合珠蛋白的含量。
5、如權利要求4所述檢測牛奶中結合珠蛋白含量的方法，其特徵在於所述的電解池溶液含5mM鐵氰化鉀、5mM亞鐵氰化鉀、0.1M氯化鉀。
全文摘要
本發明公開了一種檢測牛奶中結合珠蛋白含量的免疫傳感器，包括工作電極、輔助電極和參比電極，其特徵在於，免疫傳感器的工作電極為金電極，金電極上結合有納米金顆粒，納米金顆粒上連接有抗結合珠蛋白抗體。本發明利用抗體-抗原的特異性親和作用捕獲牛奶中的待測抗原——結合珠蛋白，採用循環伏安法檢測免疫反應前後傳感器的電流變化，實現對牛奶中結合珠蛋白的定量檢測。本發明還提供了一種結合珠蛋白的檢測方法，該方法操作簡單、檢測快速、靈敏度高、檢測成本低廉、易於推廣，可作為臨床上通過檢測牛奶中結合珠蛋白含量而建立奶牛隱性乳腺炎診斷的一種實用、簡便的方法。
文檔編號G01N33/68GK101666804SQ20091015318
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月24日 優先權日2009年9月24日
發明者丁守強, 韜 潘, 勳 譚 申請人:浙江大學