重組人促卵泡激素的純化方法

2023-12-03 04:46:41 3

專利名稱：重組人促卵泡激素的純化方法
技術領域：
本發明涉及蛋白的純化方法。具體而言，本發明公開了重組人促卵泡激素的純化新工藝。
背景技術：
促卵泡激素(FSH)是由垂體前葉分泌的能促進並增強卵巢中的卵泡發育和成熟的最重要的內分泌激素，可用於誘發排卵或超排卵，在男子可以促進精子的發育。FSH同LH和絨毛膜促性腺激素(hCG) —樣都是一種異源二聚體糖蛋白，由非共價結合的α和β亞基組成，分別含有92個和111個胺基酸。糖基是以N-糖苷鍵的方式連接在α和β兩個亞基各自的區域。糖在糖蛋白激素分子中佔15% 30%，主要包括甘露糖、巖藻糖和半乳糖， N —乙醯葡萄糖胺。糖鏈末端含唾液酸，與蛋白以共價鍵的方式結合，通常連接在天冬醯胺上，形成所謂的N-連糖鏈。FSH每個亞基上有2個糖基位點(α-亞基的分別位於第52位和第78位胺基酸殘基上，β -亞基的分別位於第7位和第24位胺基酸殘基上)，這2個位點還會有一些糖鏈分枝。糖鏈的組成直接影響著激素的生物學活性，採用化學或酶解的方法解離除去糖鏈，FSH的生物學活性降低，直到消失，且α鏈上糖鏈的解離對激素的影響比 β鏈更大。
FSH的應用價值
由於FSH合成和分泌的不足所致的FSH濃度的不同，是男性和女性不育的主要原因。在女性中，這一狀態的特徵表現為不排卵或排卵異常。在男性中，可能會由於沒有足夠量的有活力的精子的產生而導致不育。單獨注射FSH或者與LH合用，已被成功用於治療不育症。以前商業化的用於治療的FSH是由尿源提取的(來自絕經婦女的uFSH)。然而,應用重組DNA技術生產的人重組FSH(rhFSH)在臨床上體現了更好的質量和有效性。目前國內該類產品有瑞士雪蘭諾公司生產的Gonal-F (果納芬)和荷蘭歐加農公司生產的Puregon (普利康)。
糖蛋白激素是一類重要的生物大分子，它的分離純化，不但對研究其結構與功能具有重要的學術意義，而且作為特殊應用的醫藥，分離純化出大量的高活性純品，更有巨大的經濟效益與實用價值。但是，糖蛋白激素在糖鏈上的不均一性為其色譜分離增加了難度， 概括起來包括三個方面的問題低含量、不穩定性及不均一性。
糖蛋白激素在生物體內的含量一般都是很低的，這就要求首先採用一定的方法進行濃縮與富集。在酸性、熱、有機溶劑的作用下糖蛋白激素中唾液酸易於解離，亞基易於解離，這就要求必須採用中性pH、溫和及低溫的分離技術與環境。甚至冷凍乾燥也會引起糖蛋白激素的失活，一般不適於在分離純化中採用這種方法進行濃縮，而採用超濾的方法。這對於粗製原料的製備是很難能全部達到要求的。傳統的分離純化方法，由於太長的分離時間顯然對保持生物學活性也是不利的。
目前純化重組人的FSH的文 獻中多數使用染料親和層析或者金屬螯合填料層析作為捕獲手段，後期通過親和層析、反相層析、離子交換層析、分子篩層析、疏水層析等多種手段、多步處理來實現該蛋白質的純化。例如CN201080056651公開了反相、凝膠過濾、疏水層析等；在專利CN100554277C中提到利用陰離子交換層析和固定金屬離子層析(即金屬螯合層析)以及疏水層析對重組或天然促卵泡激素進行純化。更多使用的捕獲手段是染料親和層析US7939296涉及陽離子交換層析、染料親和、疏水、凝膠過濾；EP1106623 A I涉及染料親和、洗滌、梯度洗脫等手段(rhFSH最終收率、生物活性等未明);CN200580037591.9涉及染料親和、疏水、反相；US2009209454層析方法包括染料親和、陰離子、疏水、強陰離子， CN201080022681涉及陰離子交換層析、疏水作用層析和染料親和層析且排斥弱的陰離子交換層析。另外值得注意的是，這些純化方法所涉及的陰離子交換層析採用的是吸附一洗脫模式。
反相層析需要使用有機溶劑作為蛋白質的洗脫介質，蛋白質長時間暴露在有機溶劑中將導致分子結構不同程度的改變，嚴重的可導致不可逆變性，嚴重影響蛋白的生物學活性。金屬螯合層析會導致高濃度金屬離子引入蛋白溶液中，不同程度導致蛋白活性的降低，並且增加了金屬離子去除的難度。疏水層析用於促性腺激素的分離，本發明人發現活性回收率較低，具體失活機理不明，為此，開發一種減少蛋白活性喪失的FSH純化工藝具有重要的現實意義。發明內容
本發明解決的技術問題是，提供了一種重組人促卵泡激素的純化工藝，避免了使用對蛋白活性影響較大的反相層析、金屬螯合層析或疏水層析，操作簡便，蛋白活性高且收率高。
本發明的一種技術方案為
一種重組人促卵泡激素的純化方法，包括以下步驟
I)陰離子交換層析含重組人FSH的細胞培養物上清液，在平衡陰離子交換層析柱後上樣，收集含重組人FSH的流穿液；
2)親和層析將FSH特異的CaptureSelect親和層析柱(荷蘭BAC公司產品)平衡， 上樣，再用洗脫緩衝液洗脫層析柱，收集含重組人FSH的洗脫峰；
3)凝膠過濾層析平衡凝膠層析柱後上樣，收集含有重組人FSH的組分。
上述純化方法中所述陰離子交換層析柱的介質的配基為季銨基或二乙胺乙基。優選的陰離子交換層析柱的介質為Q sepharose F. F或DEAE sepharose F. F。其中所述陰離子交換層析所用平衡緩衝液中含有O. 1-0. 2M NaCl, pH為7. 0-7. 5。所述陰離子交換層析所用平衡緩衝液中還可以進一步含有O. 02-0. 05M Tris和O. 01-0.1M甲硫氨酸。
上述純化方法第二個步驟所述的親和層析中所用平衡緩衝液含有O. 02-0. 05M Tris, pH 為 7. 0-7. 5 ;洗脫重組人 FSH 的緩衝液含有 O. 02-0. 05MTris 和1. 5-2. OM MgCl2, pH 為 7. 0-7. 5。
上述純化方法中所述凝膠層析柱的介質為分離範圍在3-600kD、適於重組人FSH 純化的凝膠，優選米用 Superdex75、Superdex200、Sephadex G-50、Sephadex G-75 或 Sephadex G_100。所述凝膠層析所用平衡緩衝液含有0. 02-0.1M枸櫞酸鈉和O . 01-0.1M甲硫氨酸，pH為7. 0-7.5。
更進一步說，上述純化方法的步驟I和/或步驟3中上樣前，將樣品在超濾系統中進行濃縮和緩衝液置換。所述置換所用的緩衝液含O. 02-0. 05M Tris,O. 1-0. 2M NaCl和O.01-0.1M 甲硫氨酸，pH 為 7. 0-7. 5。
本發明所用原料可取自按各種方法製得的含重組人FSH的細胞培養物，宿主細胞可為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
本發明提供了一種新的純化思路，利用陰離子交換、親和、凝膠過濾的層析組合即可得到純的重組人FSH，成本低，步驟少，簡便易行，質量穩定，不存在複雜的變復性過程，避免了使用對蛋白活性影響較大的反相層析、金屬螯合層析或疏水層析；先利用流穿模式的陰離子交換，除去大量雜蛋白、色素以及部分殘留DNA、內毒素及宿主蛋白，既保護了後續的親和填料，又實現了粗純與濃縮富集；親和介質偶聯了駱駝源的抗體，載量高，只特異性地結合FSH的完整分子，而不結合單個亞基，更好地去除了降解的單體亞基；凝膠過濾可進一步除去殘留DNA、內毒素及宿主蛋白，還可起到去除蛋白聚體以及糖基化不足的FSH蛋白， 使FSH的純度從親和層析後得到的90%進一步提高到了 98%。
本發明還在超濾濃縮與置換、陰離子交換、親和、凝膠過濾時均使用近中性的緩衝液，尤其是用中性緩衝液將FSH從親和柱洗脫，不採用酸液洗脫再加鹼中和的傳統方法，因而避免了 PH劇烈變化帶來的蛋白沉澱以及糖脫落問題，保證了洗脫得到的蛋白的純度和活性；超濾置換、陰離子交換所用緩衝液中含甲硫氨酸，凝膠過濾還一併將FSH溶液置換為含甲硫氨酸的緩衝體系，避免再次濃縮置換造成的回收率下降，並可減少FSH的氧化，利於 FSH最終的保存。
本發明所述的重組人促卵泡激素的純化新工藝，經過對重組人促卵泡激素純度驗證與活性驗證，並顯示了良好的實際效果。本發明製備重組人促卵泡激素與市售的促卵泡激素Puregon (普利康)經過對照，顯示了本發明製備產物具有更高的生物學活性。


圖1市售的促卵泡激素Puregon (普利康)SEC-HPLC檢測圖譜。其中，縱坐標 mAU表示A214紫外吸收值，橫坐標為時間，目的蛋白於15. Smin左右出峰。
圖2實施例1最終製備的促卵泡激素的SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標mAU表示 A214紫外吸收值，橫坐標為時間，目的蛋白於15. Smin左右出峰。
圖3實施例2最終製備的促卵泡激素的SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標mAU表示 A214紫外吸收值，橫坐標為時間，目的蛋白於15. Smin左右出峰。
圖4實施例3最終製備的促卵泡激素的SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標mAU表示 A214紫外吸收值，橫坐標為時間，目的蛋白於15. Smin左右出峰。
圖5實施例1、2 、3最終製備的促卵泡激素的以及蛋白質Marker的SDS-PAGE電泳圖譜。
條帶1、2、3分別為實例1、2、3最終製備的重組人促卵泡激素；
條帶4 :蛋白質Marker ；
圖6實施例1、2、3最終製備的促卵泡激素的以及蛋白質Marker的 WesternBloting 圖譜。
條帶1、2、3分別為實例1、2、3最終製備的重組人促卵泡激素；
條帶4 :蛋白質Marker ；
圖7實施例2最終製備的促卵泡激素的氧化亞基檢測圖譜。其中，縱坐標mAU表示A214紫外吸收值，橫坐標為時間。
圖8實施例3最終製備的促卵泡激素的氧化亞基檢測圖譜。其中，縱坐標mAU表示A214紫外吸收值，橫坐標為時間。
圖9含有氧化產物的rhFSH樣品的氧化亞基檢測圖譜，其中，縱坐標mAU表示A214 紫外吸收值，橫坐標為時間。
具體實施方式
儀器與材料
Pellicon2超濾膜(截流分子量10K，0. 5M2，Millipore公司產品)，Pellicon超濾系統(Millipore公司產品)，Amicon超濾離心管(Millipore公司產品)，AKTA Purifier層析系統(GE healthcare 公司產品)；TSK gelG_2000wxl 柱(Tosoh 公司產品)；Vydac Protein and Peptide C4柱(美國格雷斯公司產品)；高壓液相色譜儀(美國安捷倫Agilent公司產品);
具FSH 特異性的 CaptureSelect 填料(荷蘭 BAC 公司產品)，Superdex75prep grade 填料、Superdex75prep grade 填料以及 Sephadex G-75 (GEhealthcare 公司產品), Q sepharose F. F 填料、DEAE sepharose FF 填料(GEhealthcare 公司產品)。·
一、重組人FSH的純化
實施例1重組人促卵泡激素蛋白的純化途徑一
I)含重組人FSH的細胞培養物上清液的預處理
清潔超濾系統，並作去熱原處理，濃縮上清液，用(O. 02MTris+0. 2MNaCl + O.1M甲硫氨酸)緩衝液(PH7. O)置換濃縮液。
2) Q sepharose F. F陰離子交換層析
清潔Q sepharose F. F柱層析系統,並作去熱原處理,依次按以下步驟進行
用A相(O. 02MTris+0. 2MNaCl + O.1M甲硫氨酸)緩衝液(pH7. O)平衡層析柱，上樣，在此條件下，雜質結合在陰離子交換柱上，而重組人促卵泡激素蛋白不結合在陰離子交換柱上，收集流穿組分。
3)親和層析
清潔親和層析系統，依次進行以下操作用(O. 02M Tris)緩衝液(pH7. O)平衡層析柱；上樣後用(O. 02M Tris)緩衝液(pH7.0)平衡層析柱；用(O. 02MTris+l. 5M MgCl2 · 6H20)緩衝液(pH7. O)洗脫層析柱上的重組人FSH，收集該洗脫峰。
清潔超濾系統，並作去熱原處理，用0. 02M Tris (pH7. 0)循環清洗超濾系統後，超濾濃縮前述層析柱洗脫峰收集液，並用0. 02M Tris (pH7. 0)充分置換。
4) Superdex75prep grade 層析
清潔Superdex75prep grade柱層析系統,並作去熱原處理,依次按以下步驟進行 用0. 02M枸櫞酸鈉+ 0.1M甲硫氨酸緩衝液(pH7. 5)平衡層析柱；將上步收集的濃縮蛋白溶液，上樣，收集含重組人FSH的組分。
實施例2重組人促卵泡激素蛋白的純化途徑二
I)含重組人FSH的細胞培養物上清液的預處理
清潔超濾系統，並作去熱原處理，濃縮上清液，用(O. 02MTris+0.1MNaCl + O. OlM 甲硫氨酸)緩衝液(PH7. 2)置換濃縮液。
2) DEAE sepharose F. F 陰離子交換層析
清潔DEAE sepharose F. F柱層析系統,並作去熱原處理,依次按以下步驟進行
用A相(O. 02MTris+0.1MNaCl + O. OlM甲硫氨酸)緩衝液(pH7. 2)平衡層析柱，上樣，在此條件下，雜質結合在陰離子交換柱上，而重組人促卵泡激素蛋白不結合在陰離子交換柱上，收集流穿組分。
3)親和層析
清潔親和層析系統，依次進行以下操作用(O. 02M Tris)緩衝液(pH7. 2)平衡層析柱；上樣後用(O. 02M Tris)緩衝液(pH7. 2)平衡層析柱；用(O. 02MTris+2. OM MgCl2 · 6H20)緩衝液(pH7. 2)洗脫層析柱上的重組人FSH，收集該洗脫峰。
清潔超濾系統，並作去熱原處理，用O. 02M Tris (pH7. 2)循環清洗超濾系統後，超濾濃縮前述層析柱洗脫峰收集液，並用O. 02M Tris (pH7. 2)充分置換。
4) Superdex200prep grade 層析
清潔Superdex200prep grade柱層析系統,並作去熱原處理,依次按以下步驟進行用O.1M枸櫞酸鈉+ O. OlM甲硫氨酸緩衝液(pH7. O)平衡層析柱；將上步收集的濃縮蛋白溶液，上樣，收集含重組人FSH的組分。
實施例3重組人促卵泡激素蛋白的純化途徑三
I)含重組人FSH的細胞培養物上清液的預處理
清潔超濾系統，並作去熱原處理，濃縮上清液，用(O. 05MTris+0. 2MNaCl + O.1M甲硫氨酸)緩衝液(PH7. 5)置換濃縮液。
2) Q sepharose F. F陰離子交換層析
清潔Q sepharose F. F柱層析系統,並作去熱原處理,依次按以下步驟進行
用A相(O. 05MTris+0. 2MNaCl + O.1M甲硫氨酸)緩衝液(pH7. 5)平衡層析柱，上樣，在此條件下，雜質結合在陰離子交換柱上，而重組人促卵泡激素蛋白不結合在陰離子交換柱上，收集流穿組分。
3)親和層析
清潔親和層析系統，依次進行以下操作用(O. 05M Tris)緩衝液(pH7. 5)平衡層析柱；上樣後用(O. 05M Tris)緩衝液(pH7. 5)平衡層析柱；用(O. 05MTris+2. OM MgCl2 · 6H20)緩衝液(pH7. 5)洗脫層析柱上的重組人FSH，收集該洗脫峰。
清潔超濾系統， 並作去熱原處理，用O. 05M Tris (pH7. 5)循環清洗超濾系統後，超濾濃縮前述層析柱洗脫峰收集液，並用O. 02M Tris (pH7. 5)充分置換。
4) Superdex75prep grade 層析
清潔Superdex75prep grade柱層析系統,並作去熱原處理,依次按以下步驟進行 用O. 05M枸櫞酸鈉+ O.1M甲硫氨酸緩衝液(pH7. O)平衡層析柱；將上步收集的濃縮蛋白溶液，上樣，收集含重組人FSH的組分。
實施例4目標蛋白的檢測
I) SDS-PAGE 檢測
將分離純化的蛋白樣品進行SDS-PAGE分析，通過實施例1、2、3最終所獲得目標蛋白以及蛋白質Marker的檢測結果如圖5所示，目標蛋白表觀分子量與理論值一致，約40kD。
2) WesternB Ioting 檢測
將分離純化的蛋白樣品進行還原型WesternBloting分析,通過實施例1、2、3最終所獲得目標蛋白以及蛋白質Marker的檢測結果如圖6所示，目標蛋白表觀分子量與理論值一致，約 40kD。
3)純度與收率
A、ELISA 檢測
此方法用於FSH免疫活性分析以及定量分析，利用抗原抗體結合來檢測FSH的含量。使用促卵泡激素ELISA kit (上海西唐生物科技公司產品)，檢測過程按說明書進行。
B、SEC-HPLC 法
色譜柱TSKgel G_2000wxl 柱(30cmX 7. 8mm)
流動相(磷酸鹽緩衝液)0. lmol/L的Na2SO4H. 2g，加950ml的水溶解，加6. 75ml 磷酸，用飽和NaOH(5-6ml)調節至pH6. 7，用水定容至1000ml，O. 45um膜過濾。
流速0.5mT ,/min,
檢測波長214nm，
ST0P:30min。
通過實施例1、2、3最終所獲得目標蛋白檢測結果如圖2、3、4所示，目標蛋白於 15. 9min出峰。對照藥普利康檢測結果如圖1所示。
平均純度與收率
通過ELISA、SEC_HPLC檢測與計算，目標蛋白總回收率44%，其中培養物上清液中目標蛋白濃度12mg/L ;經過超濾濃縮以及緩衝液置換，目標蛋白回收率85% ;Q_S印harose FF層析目標蛋白回收率90% ;親和層析目標蛋白回收率大於80%，蛋白質純度約90%，緊接的超濾與緩衝液置換步驟中目標蛋白回收率80% ；Sephadex G-75凝膠過濾層析目標蛋白回收率90%以上，目標蛋白純度大於98%。
4)蛋白質活性檢測
生物活性檢測根據螢光素酶(Luciferase)化學發光法。其原理為穩定表達FSHR 的細胞系在與FSH共同孵育時，將在FSH的誘導下啟動與FSHR偶聯的螢光素酶基因(報告基因)的表達，這種受體-報告基因的緊密關係構成本檢測方法的理論基礎。通過螢光素酶定量試劑盒測定報告基因的表達水平，來間接反應上遊誘導物FSH的相對生物活性。在同步檢測多濃度FSH國際標準品，並繪製出精確濃度相關的標準曲線後，即可通過比對檢測讀數和標準曲線，得到未知FSH樣品的準確活度。普利康比活性值為90833IU/mg，通過實施例1、2、3最終所獲得目標蛋白的活性檢測結果見表I。
表I本發明純化的重組`人促卵泡激素與原研藥普利康的活性比較
實施例1實施例2實施例3活性含量11916IU/mg98333IU/mg11583IU/mg與普利康之比131. 1%108.2%127. 5%
5)RP_HPLC測氧化亞基的含量rhFSH的一級結構中含有甲硫氨酸殘基，所以容易受到空氣中氧氣的氧化。根據質 量標準要求氧化亞基含量與a亞基的含量比不大於5%。1. RP-HPLC 色譜條件色譜柱VydacProtein and Peptide C4 柱(25cmX4. 6mm, 5um)流動相A(0. lmol/1 TEAP緩衝液):85%磷酸6. 75ml，加水9500ml，用三乙胺調pH 至6. 00 + 0. 05，用水定容至1000ml，用0. 45um膜過濾後，放置24小時後使用。流動相B:乙腈流動相C:水乙腈三氟乙酸=20:82:0. 1%流速1.OmL/min ；檢測波長214nm;柱溫4(TC;表2 RP-HPLC洗脫梯度表
權利要求
1.一種重組人促卵泡激素的純化方法，包括以下步驟1)陰離子交換層析含重組人FSH的細胞培養物上清液，在平衡陰離子交換層析柱後上樣，收集含重組人FSH的流穿液；2)親和層析將FSH特異的CaptureSelect親和層析柱平衡,上樣,再用洗脫緩衝液洗脫層析柱，收集含重組人FSH的洗脫峰；3)凝膠過濾層析平衡凝膠層析柱後上樣，收集含有重組人FSH的組分。
2.如權利要求1所述的純化方法，其特徵是所述陰離子交換層析柱的介質的配基為季銨基或二乙胺乙基。
3.如權利要求2所述的純化方法，其特徵是所述陰離子交換層析柱的介質為Q sepharose F. F 或 DEAE sepharose F. F。
4.如權利要求1所述的純化方法，其特徵是陰離子交換層析所用平衡緩衝液中含有0.1-0. 2M NaCl，pH 為 7. 0-7. 5。
5.如權利要求4所述的純化方法，其特徵是陰離子交換層析所用平衡緩衝液中還含有 O. 02-0. 05M Tris 和 O. 01-0.1M 甲硫氨酸。
6.如權利要求1所述的純化方法，其特徵是，所述親和層析中所用平衡緩衝液含有O. 02-0. 05M Tris, pH為7. 0-7. 5 ;洗脫重組人FSH的緩衝液含有O. 02-0. 05M Tris和1.5-2. OM MgCl2, pH 為 7. 0-7. 5。
7.如權利要求1所述的純化方法，其特徵是所述凝膠層析柱的介質為分離範圍在 3_600kD、適於重組人 FSH 純化的凝膠，優選 Superdex75、Superdex200> Sephadex G-50、 Sephadex G-75 或 Sephadex G-1OO0
8.如權利要求7所述的純化方法，其特徵是凝膠層析所用平衡緩衝液含有O.02-0.1M 枸櫞酸鈉和O. 01-0.1M甲硫氨酸，pH為7. 0-7. 5。
9.如權利要求1所述的純化方法，其特徵是，所述步驟I和/或步驟3中上樣前，將樣品在超濾系統中進行濃縮和緩衝液置換。
10.如權利要求9所述的純化方法，其特徵是置換所用的緩衝液含O.02-0. 05MTris、 O. 1-0. 2M NaCl 和 O. ·01-0.1M 甲硫氨酸，pH 為 7. 0-7. 5。
全文摘要
本發明涉及一種重組人促卵泡激素的純化方法，包括陰離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析。本發明成本低，步驟少，簡便易行，質量穩定，不存在複雜的變復性過程，避免了使用對蛋白活性影響較大的反相層析、金屬螯合層析或疏水層析；先利用流穿模式的陰離子交換，除去大量雜蛋白、色素以及部分殘留DNA、內毒素及宿主蛋白，既保護了後續的親和填料，又實現了粗純與濃縮富集；親和介質偶聯了駱駝源的抗體，載量高，只特異性地結合FSH的完整分子，而不結合單個亞基，更好地去除了降解的單體亞基；凝膠過濾可進一步除去殘留DNA、內毒素及宿主蛋白，還可起到去除蛋白聚體以及糖基化不足的FSH蛋白。
文檔編號C07K14/59GK103059125SQ20121057937
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者海崗, 王海彬, 應躍斌, 江海燕, 郭婷婷, 繆世偉, 白驊 申請人:浙江海正藥業股份有限公司