表達增強型綠色螢光蛋白基因的鴨瘟病毒重組疫苗株及其構建方法和應用的製作方法

2023-12-02 20:11:41 3

表達增強型綠色螢光蛋白基因的鴨瘟病毒重組疫苗株及其構建方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種表達增強型綠色螢光蛋白(EGFP)基因的鴨瘟病毒重組疫苗株及其構建方法和應用。具體地，本發明利用重組克隆技術，將包含增強型綠色螢光蛋白(EGFP)和CMV啟動子序列的基因片段CMV-EGFP替換鴨瘟病毒的US10基因，構建獲得缺失US10基因並在其相應位置插入CMV-EGFP表達盒的重組EGFP鴨瘟病毒，該重組病毒能夠穩定表達EGFP基因。本發明的一種鴨瘟病毒重組疫苗株，命名為rDEVUS10-EGFP，微生物保藏號是：CGMCC?No.8660。本發明還涉及構建穩定表達其他禽類病原外源基因的重組鴨瘟病毒疫苗株的方法，以及重組鴨瘟病毒疫苗株在製備預防鴨瘟和其他禽類傳染病的疫苗中的應用。
【專利說明】表達增強型綠色螢光蛋白基因的鴨瘟病毒重組疫苗株及其 構建方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及重組病毒疫苗株及其構建方法和應用，尤其涉及一種能夠穩定表達外 源基因的重組鴨瘟病毒株rDEVUS10-EGFP及其構建方法和應用，本發明屬於生物醫藥技術 領域。

【背景技術】
[0002] 鴨瘟又稱鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis，DVE)，是由鴨瘟病毒（又稱鴨腸 炎病毒（Duck enteritis virus，DEV))引起的鴨、鵝等多種雁形目禽類感染的一種急性、熱 性、接觸性傳染病。其主要特點是流行廣泛，傳播迅速，發病率及死亡率高，且不同日齡的鴨 均易感，給養鴨業造成巨大經濟損失，是危害養鴨業的重要疫病之一。
[0003] 鴨瘟病毒的自然感染僅限於雁形目的鴨科成員（鴨、鵝、天鵝等）。傳染源主要是 病鴨、病鵝、帶毒的家禽及野生水禽。水是本病的自然傳播媒介，吸血昆蟲可能是本病潛在 的傳播媒介。感染該病的康復禽有可能成為帶毒者，並周期性排毒。鴨瘟病毒與其它皰疹病 毒一樣，DEV的潛伏和激活都可以引起該病在家養和遷徙水禽中爆發。病毒的感染與品種、 年齡和性別無關，成年鴨感染率較幼鴨高。但近年來發現DEV的感染朝低齡化方向發展，且 鵝的感染率不斷增高，發病率和死亡率多在80%以上。鴨瘟病毒只有一個血清型，免疫接種 是防治該病的最有效手段。目前國內外預防鴨瘟使用較廣泛的是弱毒疫苗，此類疫苗具有 免疫效果好、免疫保護力產生快的特點，在高發季節來臨前給鴨群進行免疫注射能有效預 防該病。當疫情發生時，在開始初期應當立即對於鴨群中未出現症狀的鴨進行緊急免疫接 種，可以防止疫病的進一步擴散，對於控制疫情、降低經濟損失具有顯著效果。然而，隨著畜 禽集約化養殖業的發展，單價疫苗已顯示出其一定的弊端，多次免疫的防控措施費時費力， 多價聯合疫苗便成為養殖業最受歡迎的疫病防控產品，因而開展禽病多價聯合疫苗成為必 然選擇。
[0004] DEV為皰疹病毒，其基因組為雙股線性DNA，大小約為168Kb，由共價結合的兩個區 域組成，包括長獨特區（UL)和短獨特區（US)。2009年Li等首次報導DEV VAC株的全基因 組序列，同年，Liu等報導了由DEV VAC株致弱株DEV Clone-03大多數0RF序列（Liu et al.，2009)。序列分析表明DEV VAC基因組的構型為D型基因組（Li et al.，2009)，基因 組結構為：UL-IRS-US-TRS。共包括78個開放讀碼框（ORF)，其中有65個0RF位於UL區， 11個0RF位於US區，另外2個ORF (ICP4和IE180)則分別位於IRS區和TRS區（Wu et al. , 2012) 〇
[0005] 皰疹病毒基因組包含大量的複製非必需基因，包括TK、gC、gG、gK、USl、US2、US10、 UL41、UL42、US7和US8等。在相關研究中將外源基因插入或替代皰疹病毒的非必須基因， 構建重組病毒疫苗，這被認為是一種良好的重組活疫苗病毒載體，目前有關皰疹病毒作為 載體的報導包括偽狂犬病載體、傳染性喉氣管炎病毒載體、馬力克氏病毒載體以及火雞皰 疹病毒載體等。隨著對鴨瘟病毒研究的不斷加深，以DEV為病毒活載體受到更加廣泛的關 注，DEV作為載體的優勢在於該病毒宿主範圍較窄，對雞、火雞、鴿和哺乳動物均無致病性， 因此可在這些非自然宿主呼吸道瞬時增殖而不會對人和其他動物的健康安全造成影響，這 對開發DEV病毒活載體疫苗具有重要意義。目前，針對DEV病毒載體研究進展順利，Wang 利用BAC技術將H5N1亞型禽流感病毒HA基因插入至鴨瘟病毒gC基因中，成功構建表達表 達H5N1亞型禽流感病毒HA基因的重組鴨瘟病毒（Wang et al.，2011)。Liu等將H5N1亞 型禽流感病毒HA基因插入鴨瘟病毒UL41基因中以及US7與US8基因之間，構建兩株表達 H5N1亞型禽流感病毒HA基因的重組鴨瘟病毒，免疫鴨群後均可以對DEV和H5N1亞型禽流 感病毒產生免疫保護（Liu et al.，2011)。但是，目前利用DEV非必須基因 US10位點開展 外源基因的重組病毒構建和應用均未見報導。


【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題之一是提供一種構建表達增強型綠色螢光蛋白 (EGFP)基因的鴨瘟病毒重組疫苗株的方法；
[0007] 本發明所要解決的技術問題之二是提供一種有所述方法製備得到的表達增強型 綠色螢光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟病毒重組疫苗株；
[0008] 本發明所要解決的技術問題之三是提供所述鴨瘟病毒重組疫苗株在製備預防鴨 瘟的重組鴨瘟疫苗中的應用。以及所述的鴨瘟重組病毒株在製備預防鴨瘟以及其它禽類傳 染病的重組疫苗中的應用。
[0009] 本發明所要解決的技術問題是通過以下技術途徑來實現的：
[0010] 本發明的一種構建表達增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的方 法，其特徵在於用包含增強型綠色螢光蛋白（EGFP)和CMV啟動子序列的基因片段CMV-EGFP 替換鴨瘟病毒的US10基因，構建獲得缺失US10基因並在其相應位置插入CMV-EGFP表達盒 的鴨瘟重組病毒株。
[0011] 在本發明所述的方法中，優選的，所述的包含增強型綠色螢光蛋白（EGFP)和CMV 啟動子序列的基因片段CMV-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0012] 在本發明所述的方法中，優選的，缺失的US10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。
[0013] 在本發明所述的方法中，優選的，所述的CMV啟動子來源於含有CMV啟動子的質 粒，更優選pEGPF-ΝΙ質粒。
[0014] 在本發明所述的方法中，優選的，包括以下步驟：
[0015] (1)構建包含增強型綠色螢光蛋白（EGFP)和CMV啟動子序列的基因片段 CMV-EGFP的重組轉移載體，其中在所述基因片段CMV-EGFP上下遊分別連有擴增得到的位 於鴨瘟病毒US10基因兩側的側翼序列，所述的包含增強型綠色螢光蛋白（EGFP)和CMV啟 動子序列的基因片段CMV-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；
[0016] (2)提取鴨瘟病毒的完整基因組DNA ;
[0017] (3)利用步驟（1)中獲得的重組轉移載體與步驟（2)中獲得的鴨瘟病毒的完整基 因組DNA共轉染次代雞胚成纖維細胞，通過螢光顯微鏡篩選表達綠色螢光蛋白的病毒，再 經過病毒蝕斑純化，獲得單一的穩定表達EGFP的鴨瘟重組病毒株。
[0018] 在本發明所述的方法中，優選的，步驟（1)中用於擴增位於鴨瘟病毒US10基因兩 側的側翼序列的引物如下所示：
[0019] VL1 上遊：5 ' -ATCGATTGACGATGAGCGATCGGAAT-3 '
[0020] VL2 下'遊：5，-CCTAGGGTTGCGCGTTGTGTATAAGT-3，
[0021] VR1 上遊：5 ' -ACGCGTGACTCTGACTGATACTCTAC-3 '
[0022] VR2 下'遊：5 ' -ATGCATCTAATCGGTTATTTGCTGCT-3 '。
[0023] 進一步的，本發明還提出了按照以上任一項所述的方法製備得到的表達增強型綠 色螢光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株。
[0024] 其中，在本發明的一個優選的實施方案中獲得了一種穩定表達增強型綠色螢光 蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株，命名為rDEVUS10-EGFP株，分類命名是Duck Anatid Herpesvirus,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽 區北辰西路1號院中科院微生物研究所，保藏日期為2013年12月27日，其微生物保藏號 是：CGMCC No. 8660。
[0025] 在所述的鴨瘟重組病毒株rDEVUS10-EGFP株中，重組轉移載體EGFP基因兩端加入 了 Xho I和Not I限制性內切酶位點，可通過該位點將EGFP替換為其他外源基因，如雞傳 染性支氣管炎病毒N基因或新城疫病毒HN基因等，與鴨瘟病毒共轉染雞胚成纖維細胞CEF， 以獲得穩定表達其他外源基因（如雞傳染性支氣管炎病毒N基因或新城疫病毒HN基因等） 的鴨瘟重組病毒株。
[0026] 因此，更進一步的，本發明還提出了所述的鴨瘟重組病毒株在製備預防鴨瘟的重 組鴨瘟疫苗中的應用。以及所述的鴨瘟重組病毒株在製備預防其它禽類傳染病（如傳染性 支氣管炎、新城疫等）的重組多價疫苗中的應用，包括將增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因 的表達盒替換為導致其他禽類傳染病的病毒的基因，其中，所述的其它禽類傳染病包括雁 形目禽類以及雞的病毒性傳染病，所述雁形目禽類包括鴨以及鵝，優選的，所述的導致其他 禽類傳染病的病毒的基因包括鴨肝炎病毒VP1基因、雞傳染性支氣管炎N和S基因以及新 城疫病毒F基因。
[0027] 本發明弱毒株應用範圍較寬，例如，可應用於製備成預防鴨瘟或其鴨瘟與他禽類 病原的多價聯合疫苗（活苗或滅活疫苗）等。
[0028] 在本發明的一個具體實施例中，涉及一種用於預防鴨瘟以及鴨病毒性肝炎的二價 疫苗，含有穩定表達鴨肝炎病毒VP1基因的鴨瘟重組病毒株，所述的含有穩定表達鴨肝炎 病毒VP1基因的鴨瘟重組病毒株通過以下方法構建得到：將權利要求5或6所述的表達增 強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因替換 為鴨肝炎病毒VP1基因，即得。
[0029] 在本發明的一個具體實施例中，涉及一種用於預防鴨瘟以及雞傳染性支氣管炎的 二價疫苗，含有穩定表達雞傳染性支氣管炎N或S基因的鴨瘟重組病毒株，所述的含有穩定 表達雞傳染性支氣管炎N或S基因的鴨瘟重組病毒株通過以下方法構建得到：將權利要求 5或6所述的表達增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的增強型綠色螢光蛋 白（EGFP)基因替換為雞傳染性支氣管炎N或S基因，即得。
[0030] 在本發明的一個具體實施例中，涉及一種用於預防鴨瘟以及新城疫的二價疫苗， 含有穩定表達新城疫病毒F基因的鴨瘟重組病毒株，所述的含有穩定表達新城疫病毒F基 因的鴨瘟重組病毒株通過以下方法構建得到：將權利要求5或6所述的表達增強型綠色熒 光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因替換為新城疫病 毒F基因，即得。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為本發明重組鴨瘟病毒株基因組US10缺失區域插入的CMV啟動子和增強型 綠色螢光蛋白（EGFP)基因序列（SEQ ID N0:2所示）示意圖，其中，陰影部分為EGFP序列， 下劃線部分為CMV啟動子序列；
[0032] 圖2為轉移載體pUS10-EGFP的載體圖譜。

【具體實施方式】
[0033] 為了進一步闡述本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。
[0034] 實施例1轉移載體的構建
[0035] 根據DEV病毒基因組US10基因序列側翼序列（GenBank登陸號為EF524095)，應用 01ig 〇6. 0軟體設計2對引物，引物序列如下：
[0036] VL1 (上遊）：5，-ATCGATTGACGATGAGCGATCGGAAT-3，
[0037] VL2 (下遊）：5，-CCTAGGGTTGCGCGTTGTGTATAAGT-3，
[0038] VR1 (上遊）：5 ' -ACGCGTGACTCTGACTGATACTCTAC-3 '
[0039] VR2 (下遊）：5，-ATGCATCTAATCGGTTATTTGCTGCT-3，
[0040] 首先應用引物VL1(上遊）和VL2(下遊）擴增左同源臂，用引物VR1(上遊）和 VR2(下遊）擴增右同源臂，將左同源臂（Cla I+Bln I)和右同源臂（Mlu I+Ava III)分別 插入由本研究室構建的帶有CMV啟動子的EGFP表達盒（CMV-EGFP)的pT-EGFP載體中，構 建轉移載體PUS10-EGFP (載體圖譜如圖2所示），包含增強型綠色螢光蛋白（EGFP)和CMV 啟動子序列的基因片段（CMV-EGFP)的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0041] 實施例2鴨瘟病毒基因組的提取
[0042] 將DEV Clone-03細胞毒以0. 001個Μ0Ι接種於鋪滿CEF單層的5mL細胞瓶中（雞 胚成纖維細胞的製備參照《體外培養的原理與技術》操作（薛慶善，2001) )，37°C吸附2h，棄 掉病毒液，換DMEM細胞維持液（含2 % FBS)，待細胞病變達到80 %?90 %後，棄掉細胞維持 液，加入細胞消化液（1860yL STE ;100yL10% SDS ;40yL蛋白酶K20mg/mL)，37°C消化過 夜，加入等體積酚抽提一次，等體積酚氯仿（1:1)抽提一次，加入等體積氯仿抽提一次；力口 入1/10體積NaAC(3M，pH5. 2)，2. 5倍體積無水乙醇，置於-20°C沉澱過夜，4°C離心15min， 風乾後加入適量去離子水溶解病毒基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組的完整性，儲存 於-20°C備用。
[0043] 實施例3轉染
[0044] Day 1 :準備細胞
[0045] 預先將CEF細胞傳代並鋪於5mL細胞瓶中，37°C2(%恆溫培養箱培養。
[0046] Day2 :轉染
[0047] (1)於轉染前3_4h更換細胞培養液。
[0048] (2)轉染體系：A液：18yL2M CaC12，10yg DNA(轉移載體與病毒基因組比例為 3:1)，加去離子水補足體積至 150 μ L。B 液：150 μ L2XHepes Buffered Saline (HBS)。
[0049] (3)用移液器將A液逐滴加入B液，在加 A液的同時利用另一個移液器向B液中緩 慢吹入空氣，此過程應在l_2min之內完成。
[0050] (4)將A B混合液置於室溫孵育30min。
[0051] (5)將混合液加入細胞培養液中。
[0052] (6)將細胞置於37°C 2%恆溫培養箱培養中繼續培養。
[0053] Day3 :更換細胞培養液並對細胞進行休克
[0054] (1)更換細胞培養液。
[0055] (2)用1 X PBS輕洗細胞2次。
[0056] (3)利用DMS0對細胞進行休克。
[0057] 1)用 1 X PBS 配製 15 % DMS0。
[0058] 2)將2mL DMS0休克液加入輕洗後的細胞中。
[0059] 3)室溫孵育 2. 5min。
[0060] 4)棄掉DMS0加入新鮮的細胞培養液。
[0061] (4)將細胞置於37°C 5% C02恆溫培養箱培養中繼續培養。
[0062] 1)用 1XPBS 配製 15% DMS0 休克液。
[0063] 2)將2mL DMS0休克液加入輕洗後的細胞中。
[0064] 3)室溫孵育 2· δπ?η。
[0065] 4)棄掉DMS0休克液加入新鮮的細胞培養液。
[0066] 細胞置於37°C，5% C02恆溫培養箱培養中繼續培養。每天觀察至出現細胞病變 (CPE)，螢光顯微鏡下觀察是否有表達綠色螢光蛋白的CPE，待CPE達到80 %?90 %後收穫 病毒，反覆凍融3次，作為蝕斑純化的種毒，儲存於-70°C備用。
[0067] 實施例4重組病毒的篩選及鑑定
[0068] 將收穫的含有重組病毒的病毒液用無血清DMEM做ΚΓ1?ΚΓ4倍稀釋，將生長良好 的CEF細胞單層用PBS輕洗3次，加入病毒稀釋液，37°C孵育a後，吸棄病毒液，加入DMEM 培養基（含1 %低熔點瓊脂糖，10% FBS)，室溫放置30min培養基凝固後，移入37°C 5% C02 恆溫箱中繼續培養。待蝕斑出現後，在螢光顯微鏡下觀察綠色螢光蛋白的表達進行重組病 毒蝕斑的篩選，待蝕斑增長至合適大小，挑取表達螢光蛋白的蝕斑於無血清DMEM中，反覆 凍融三次後，再次接種於CEF細胞繼續進行蝕斑純化。重複以上步驟，經過3輪蝕斑純化， 獲得純淨的重組病毒。將純化的重組病毒反覆凍融三次，取200 μ L病毒液提取重組病毒基 因組，方法如下：取200yL病毒液，加入5yL蛋白酶K(20mg/mL)和20yL10% SDS，置於 56°C水浴消化2h;等體積酚氯仿（1:1)抽提一次，加入等體積氯仿抽提一次；加入1/10體 積NaAC(3M，pH5. 2)和2. 5倍體積無水乙醇，置於-20°C 15min後，4°C，離心15min收集病 毒基因組，加入適量去離子水溶解後，以該重組病毒基因組為模板，利用引物VL1+VR2對重 組病毒進行PCR初步鑑定，PCR產物經0. 9 %瓊脂糖凝膠電泳鑑定後，切膠回收目的片段，將 其克隆至PMD18-T載體，經篩選鑑定後陽性質粒進行測序，結果與SEQ ID N0:2所示序列一 致，說明含有CMV啟動子序列的EGFP表達盒已插入病毒基因組中，重組病毒構建成功。
[0069] 實施例5重組病毒穩定性的測定
[0070] 1、生長穩定性（複製動力學/ 一步生長曲線）
[0071] 將預先製備好的CEF細胞傳代並鋪於12孔細胞培養板中，計算細胞數量。24h後 將重組病毒以0. 001個Μ0Ι接種於生長良好的CEF單層，37°C孵育2h，棄掉病毒液，加入 DMEM細胞維持液（含2% FBS)置於37°C 5% C02恆溫培養箱培養。分別於12h、24h、36h、 48h、60h、72h、84h、96h後收穫病毒，每個時間點做3個平行重複，反覆凍融三次，-20°C貯存 備用。
[0072] 將不同時間點收穫的病毒液做ΚΓ1?10_7倍稀釋。將病毒原液與無血清DMEM細胞 培養液以1 :10的比例充分混勻。吸取100 μ L病毒稀釋液加入至裝有900 μ L無血清DMEM細 胞培養液的ΕΡ管中，重複以上步驟直至病毒稀釋至ΚΓ7倍，將病毒稀釋液接種於預先鋪滿 CEF單層的96孔細胞培養板中，每個稀釋度8個重複，37°C孵育2h，棄掉病毒液，每孔加入 lOOyL的DMEM細胞維持液（含2%FBS)。每個時間點收穫的3個不同孔的病毒液按照以上 方法進行平行測定。12h後開始觀察細胞病變情況，連續觀察，7d後判定結果。按照Karber 法計算病毒的TCID5(I。統計所有時間點病毒液的TCID50,同時對親本病毒DEV的生長規律 進行平行測定，以〇. 001個Μ0Ι接種於生長良好的CEF單層，分別於接種後12h、24h、36h、 48h、60h、72h、84h、96h後收穫病毒，每個時間點做三個平行重複。經測定，rDEVUS10-EGFP 在72h收穫的重組病毒滴度最高，為1061TCID5(l/mL，隨著感染時間的增加，病毒的複製對細 胞的損傷越來越大，活細胞數目逐漸減少，導致病毒的複製由於宿主細胞的死亡而受到抑 制，病毒滴度在72h達到最高后逐漸下降。親本病毒DEV在72h收穫的滴度達到最高，為 10 7 9TCID5(l/mL，隨著感染時間的增加，其滴度逐漸下降。可見rDEVUS10-EGFP重組病毒增殖 滴度較親本野毒稍有下降，但其滴度仍可達到1〇 6_ ICID^/mL。
[0073] 2、重組病毒遺傳穩定性測定
[0074] 將重組病毒接種於CEF細胞連續傳代。將重組毒以0. 001M0I接種CEF細胞，37°C， 5 % C02孵育2h，棄掉病毒液，加入DMEM細胞生長維持液（含2 % FBS)。螢光顯微鏡下觀察 綠色螢光蛋白的表達，當CPE達到80 %?90 %時收穫病毒。連續傳代至25代，每5代進行 鑑定。螢光顯微鏡下觀察綠色螢光蛋白的表達，並提取病毒基因組DNA進行PCR鑑定和序 列測定，結果表明，重組病毒經連續傳代均能保持遺傳穩定性。
[0075] 本發明用包含增強型綠色螢光蛋白（EGFP)和CMV啟動子序列的基因片段 CMV-EGFP替換鴨瘟病毒的US10基因，以EGFP基因為報告基因，在報告基因插入的同時造成 US10基因的完全缺失，構建獲得穩定表達增強型綠色螢光蛋白的US10缺失鴨瘟重組病毒。
[0076] 本發明的一種穩定表達增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株，命 名為rDEVUSl〇-EGFP株，分類命名是Duck Anatid herpesvirus,保藏在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究 所，保藏日期為2013年12月27日，其微生物保藏號是：CGMCC No. 8660。
[0077] 為了驗證本發明作為重組模式病毒在US10相應缺失位置插入其他外源基因的可 能性與表達蛋白的有效性，通過本發明構建重組病毒的方法相繼構建了穩定表達禽多種疫 病病原免疫原基因如鴨肝炎病毒VP1基因、傳染性支氣管炎病毒N基因和S基因、新城疫病 毒F基因，並將不同重組病毒作為抗原免疫上述病原宿主動物均激發產生相應病原免疫原 蛋白的抗體，說明利用本發明獲得的穩定表達其他外源基因的重組鴨瘟病毒株和構建穩定 表達其他禽類病原外源基因的重組鴨瘟病毒疫苗株的方法，能夠製備獲得預防鴨瘟和其他 禽類傳染病的重組疫苗，具有廣泛應用價值。為印證本發明獲得的重組病毒株和構建方法 在製備預防鴨瘟和其它禽類傳染病的重組鴨瘟疫苗中的應用，通過以下實施例和實驗例來 進一步闡述本發明的應用，但應該理解的是，以下實施例和實驗例只是舉例說明的目的，並 不意味著限制本發明的範圍和精神。
[0078] 實施例6穩定表達鴨肝炎病毒VP1基因的鴨瘟重組病毒的構建及免疫效力評價
[0079] 1、穩定表達鴨肝炎病毒VP1基因的重組病毒的構建
[0080] 攜帶鴨肝炎病毒Du/CH/LBJ/090809株（Genbank登錄號，JF828997)VP1基因的質 粒由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究構建並保存，應用01ig〇6. 0軟體設計VP1基因引物， 上遊引物引入Xho I位點，下遊引物插入Not I位點。利用限制性內切酶Xho I和Not I 處理pUSlO-EGFP轉移載體，敲除EGFP基因，質粒骨架仍帶有US10側翼序列和可供病毒識 別的真核啟動子CMV啟動子，將預先處理的帶有Xho I和Not I粘性末端的鴨肝炎病毒VP1 基因插入PUS10骨架中，構建含有VP1表達盒的轉移載體pUS10-VPl。具體地，利用Xho I 和Not I對pUS10-EGFP質粒和VP1片段進行酶切處理，反應體系（30 μ L) :dH20 :17 μ L， 10ΧΗ Buffer :3yL，Xho I 和 Not I :各 lyL，質粒 8yL，37°C 水浴 2h 後，經 0.9% 瓊脂糖 凝膠電泳鑑定酶切結果。酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳後，採用DNA凝膠回收試劑盒（Omega) 純化回收目的DNA片段。將酶切後的載體和VP1片段連結，反應體系為：10XT 4DNA Ligase 811冊^:14 1^，1'40嫩連接酶：14 1^，載體1.5 4 1^目的片段6.5 4 1^，161：連接過夜。連結產 物轉化大腸桿菌TG1，鑑定並篩選陽性克隆，提取陽性質粒並經克隆測序，保證序列無誤。
[0081] 將rDEVUS10-EGFP重組病毒以0. 001個Μ0Ι接種於鋪滿CEF單層的5mL細胞瓶中， 37°C孵育2h，棄掉病毒液，換DMEM細胞維持液（含2 % FBS)，待細胞病變達到80 %?90 % 後，棄掉細胞維持液，加入細胞消化液（I860 μ L STE ;100 μ L10% SDS ;40 μ L蛋白酶K20mg/ mL)，37°C消化過夜，加入等體積酚抽提一次，等體積酚氯仿（1:1)抽提一次，加入等體積氯 仿抽提一次；加入1/10體積NaAC(3M，pH5. 2)，2. 5倍體積無水乙醇，置於-20°C沉澱過夜， 4°C離心15min，風乾後加入適量去離子水溶解rDEVUS10-EGFP基因組DNA。
[0082] 採用轉染試劑，將轉移載體pUS10-VPl與rDEVUS10-EGFP基因組DNA共轉染至CEF 細胞，方法同實施例3,獲得穩定表達鴨肝炎病毒VP1基因的鴨瘟重組病毒rDEVUS10-VPl， 重組病毒的篩選和純化方法同實施例4，對重組病毒的鑑定則利用引物DV1 -U+DV1-L、 VL1+DV1-U、DV1-L+VR2三對引物分別對進行鑑定。同時將重組病毒接種生長良好的CEF單 層，在感染後6h、12h、24h、48h、72h分別收穫細胞，棄掉上清，PBS輕洗三次，加入RIPA，置 於冰上裂解20min後，用細胞刮將細胞刮下，加入1/4體積5 X SDS上樣緩衝液，沸水浴煮沸 10min，冰上放置5min，進行蛋白質的SDS-PAGE電泳，完畢後按照常規Western blot方法將 轉膜濾紙和硝酸纖維膜（NC膜）剪成與凝膠同樣大小，在膜轉移緩衝液中浸泡5min，按照濾 紙、NC膜、凝膠、濾紙的順序依次疊放在一起，排淨氣泡，置於半乾電轉儀中（NC膜側位於陽 極、凝膠側位於陰極），40mA、300V轉印90min，取出NC膜，經麗春紅染色確定轉印效果，將 轉印成功的NC膜置於含5%脫脂乳的PBS中，37°C封閉lh，PBST洗滌3次，每次10min ;以 兔抗鴨肝炎VP1抗體（1:100)為一抗，37°C孵育2h後，PBST洗滌3次，每次10min ;以羊抗 兔鴨IgG-HRP (1:5000)為二抗，37°C孵育2h後，PBST洗滌3次，每次10min，DAB顯色，待檢 測的目的片段顯色後，終止反應。結果顯示，在重組病毒rDEVUS10-VPl感染CEF細胞48h 後可檢測到鴨肝炎病毒VP1基因的表達，72h後VP1基因的表達量更多，而接種親本毒株的 CEF細胞和CEF細胞未檢測到相應的蛋白。
[0083] 實施例還依照實施例5的方法對重組病毒rDEVUS10-VPl進行了生長穩定性和遺 傳穩定性的測定，發現重組病毒rDEVUS10-VPl經連續傳代能保持遺傳穩定性，並持續表達 鴨肝炎病毒VP1蛋白。
[0084] 2、重組病毒rDEVUS10-VPl接種鴨後的免疫效力評價
[0085] 2. 1試驗材料
[0086] 2. 1. lrDEVUS10-VPl株重組病毒由本研究團隊構建並在CEF細胞增殖，野生鴨瘟 強毒由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所保存鑑定。
[0087] 2. 1. 2SPF試驗鴨：來自中國農科院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心。
[0088] 2. 2試驗方法
[0089] 將rDEVUS10-VPl株重組病毒以0. 1ml肌肉注射接種15隻30日齡SPF鴨，另外15 只作為對照，接種後7天其中10隻免疫鴨和10隻對照鴨分別肌肉注射途徑攻擊致死劑量 的DEV強毒株；剩餘的5隻免疫鴨和5隻對照鴨分別採集血清測定鴨肝炎病毒的中和抗體。
[0090] 2. 3、試驗結果
[0091] 2. 3. lrDEVUS10-VPl株重組病毒對DEV強毒的免疫保護
[0092] 用重組病毒rDEVUS10-VPl免疫鴨後7天，所有免疫組鴨均對強毒攻擊產生完全保 護，而10隻對照組鴨在攻毒後6天之內均死亡（詳見表1)。
[0093] 表1 rDEVUS10-VPl株重組病毒免疫鴨對DEV的免疫保護試驗結果
[0094]

【權利要求】
1. 一種構建表達增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的方法，其特徵 在於用包含增強型綠色螢光蛋白（EGFP)和CMV啟動子序列的基因片段CMV-EGFP替換鴨瘟 病毒的US10基因，構建獲得缺失US10基因並在其相應位置插入CMV-EGFP表達盒的鴨瘟重 組病毒株。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的包含增強型綠色螢光蛋白（EGFP)和 CMV啟動子序列的基因片段CMV-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，缺失的US10基因 的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於包括以下步驟： (1) 構建包含增強型綠色螢光蛋白（EGFP)和CMV啟動子序列的基因片段CMV-EGFP的 重組轉移載體，其中在所述基因片段CMV-EGFP上下遊分別連有擴增得到的位於鴨瘟病毒 US10基因兩側的側翼序列，所述的包含增強型綠色螢光蛋白（EGFP)和CMV啟動子序列的基 因片段CMV-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示； (2) 提取鴨瘟病毒的完整基因組DNA ; (3) 利用步驟（1)中獲得的重組轉移載體與步驟（2)中獲得的鴨瘟病毒的完整基因組 DNA共轉染次代雞胚成纖維細胞，通過螢光顯微鏡篩選表達綠色螢光蛋白的病毒，再經過病 毒蝕斑純化，獲得單一的穩定表達EGFP的鴨瘟重組病毒株。
4. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於步驟（1)中用於擴增位於鴨瘟病毒US10基因 兩側的側翼序列的引物如下所示： VL1 上遊：5' -ATCGATTGACGATGAGCGATCGGAAT-3' VL2 下# :5 ' -CCTAGGGTTGCGCGTTGTGTATAAGT-3 ' VR1 上遊：5' -ACGCGTGACTCTGACTGATACTCTAC-3' VR2下.遊：5' -ATGCATCTAATCGGTTATTTGCTGCT-3'。
5. 按照權利要求1-4任一項所述的方法製備得到的表達增強型綠色螢光蛋白（EGFP) 基因的鴨瘟重組病毒株。
6. -種穩定表達增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株，其特徵在於所 述的鴨瘟重組病毒株，命名為rDEVUS10-EGFP株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，其微生物保藏號是：CGMCC No. 8660。
7. 權利要求5或6所述的鴨瘟重組病毒株在製備預防鴨瘟的重組鴨瘟疫苗中的應用； 以及在製備預防鴨瘟以及其它禽類傳染病的重組多價疫苗中的應用，包括將權利要求5或 6所述的表達增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的增強型綠色螢光蛋白 (EGFP)基因的表達盒替換為導致其他禽類傳染病的病毒的基因，所述的其它禽類傳染病包 括雁形目禽類以及雞的病毒性傳染病，所述雁形目禽類包括鴨以及鵝，優選的，所述的導致 其他禽類傳染病的病毒的基因包括鴨肝炎病毒VP1基因、雞傳染性支氣管炎N和S基因以 及新城疫病毒F基因。
8. -種用於預防鴨瘟以及鴨病毒性肝炎的二價疫苗，其特徵在於含有穩定表達鴨肝炎 病毒VP1基因的鴨瘟重組病毒株，所述的含有穩定表達鴨肝炎病毒VP1基因的鴨瘟重組病 毒株通過以下方法構建得到：將權利要求5或6所述的表達增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基 因的鴨瘟重組病毒株的增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因替換為鴨肝炎病毒VP1基因，即 得。
9. 一種用於預防鴨瘟以及雞傳染性支氣管炎的二價疫苗，其特徵在於含有穩定表達雞 傳染性支氣管炎N或S基因的鴨瘟重組病毒株，所述的含有穩定表達雞傳染性支氣管炎N 或S基因的鴨瘟重組病毒株通過以下方法構建得到：將權利要求5或6所述的表達增強型 綠色螢光蛋白（EGFP)基因的鴨瘟重組病毒株的增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因替換為雞 傳染性支氣管炎N或S基因，即得。
10. -種用於預防鴨瘟以及雞新城疫的二價疫苗，其特徵在於含有穩定表達新城疫病 毒F基因的鴨瘟重組病毒株，所述的含有穩定表達新城疫病毒F基因的鴨瘟重組病毒株通 過以下方法構建得到：將權利要求5或6所述的表達增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因的鴨 瘟重組病毒株的增強型綠色螢光蛋白（EGFP)基因替換為新城疫病毒F基因，即得。
【文檔編號】C12R1/93GK104120110SQ201410330828
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月11日 優先權日:2014年7月11日
【發明者】劉勝旺, 李慧昕, 韓宗璽, 孔憲剛 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所