外傷性腦損傷和神經退行性生物標記物、方法和系統與流程
2023-12-02 19:36:23
本申請要求2014年4月7日提交的美國臨時專利申請No.61/976,380的權益。
技術領域
本發明涉及用於診斷和在其他情況下評估外傷性腦損傷和神經退行性疾病的指標的生物標記物、方法和系統。
背景技術：
近年來基因組的進展已經顯著地提高了我們對於分子變化的理解，這促進了病理學的成果。蛋白質組的技術革新已經將該知識轉化為快速發現不同病症的早期檢測和預後的潛在生物標記物的步伐。
外傷性腦損傷是一種複雜的病症，其由輕微的到劇烈的頭部受傷引起，今年大約1400000美國公民將遭受腦損傷，每年有一到四百萬與運動有關的腦震蕩。外傷性腦損傷(TBI)和爆炸相關的腦震蕩在軍隊中也是顯著的問題，從2000年以來在美國軍隊中有確診超過300,000例TBI。早期幹預和改善患者結局需要客觀的分析以確定腦損傷的嚴重程度和預後。
輕微的外傷性腦損傷(mTBI)目前被限定為頭部創傷，其導致以下中的一種：高達24小時的精神狀態改變(暈眩，混亂，辨不清方向)，失去意識小於30分鐘，或在外傷之前或之後立即失去對事件的記憶。臨床醫生的初步評估和診斷是基于格拉斯哥昏迷等級(GCS)，其將TBI識別為輕微，中等或嚴重。雖然嚴重的頭部創傷可以被臨床醫生容易地識別，但mTBI是病因複雜的，其經常被誤診，並且目前不存在用於輕微TBI也通稱為腦震蕩的客觀的基於生物標記物的標準。
在醫院通常使用計算機化軸向斷層掃描(CAT或CT)識別腦損傷，雖然它們對於檢測mTBI來說經常是沒用的，在mTBI中大腦沒有明顯的損傷。CT正常的輕微TBI區別於在TBI中出血並且CT掃描正常的中度TBI。成像(CT或MRI)是腦損傷的客觀檢查並且不夠敏感或特異，或作為識別腦損傷的程度的臨床工具成本過高，以及作為篩查工具不易獲得。
儘管有所進步，但對於用於識別成年人和兒童人群二者的mTBI的生物標記物仍然具有很大的需要，以在方法和系統中使用這樣的生物標記物以提高mTBI的快速診斷、評估(例如對治療的反應)、和患有mTBI的患者的預後指標。對於不同神經退行性病症的蛋白質標記物也存在需要。
技術實現要素：
本公開一方面涉及腦損傷的生物標記物，特別是與外傷性腦損傷的識別、評估和預後指標相關的生物標記物。
在一些實施方式中，提供了用於確定受試者(成人或兒童)的腦損傷的方法。一種方法包括從受試者收集樣品，檢測樣品中指示外傷性腦損傷的一個或多個生物標記物的存在或含量，並且將這些標記物的水平和患有或未患有腦損傷的患者的相同生物標記物的預定水平進行比較，其中與預定水平中的一個的關聯提供了診斷。
在一個優選實施方式中，生物標記物是以下中的一個或多個：泛素C-末端水解酶L1(UCH-L1)，膠質標記物例如膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，醛脫氫酶1家族成員L1(ALDH1L1)和其他膠質蛋白，磷酸化神經絲重鏈(pNFH)，神經絲中鏈或神經絲輕鏈(NFM和輕鏈(NFL))，α-突觸核蛋白，視椎蛋白樣蛋白1(VILIP-1)和S100B。樣品通常為血液或腦脊液(CSF)。生物標記物的水平或濃度可以被用於確定腦損傷的開始，診斷決策和臨床管理，腦損傷進程的監測或腦損傷的處置進程的監測。這些生物標記物對於mTBI以及TBI的更嚴重形式是有用的。
其他實施方式涉及變化的蛋白質水平或異常和變化的基因表達或剪接的檢測或評估，其與額顳葉退化症、血管性痴呆、皮克氏病、神經肌障礙、和其他神經退行性病症有關。
本發明的其他方面和益處將通過以下具體實施方式和附圖、以及權利要求變得清楚。
附圖說明
圖1描繪了血液中的生物標記物UCH-L1將TBI患者與健康對照區分開。歐洲前瞻性單中心研究於ED(67例TBI，60例對照(包括創傷對照))，醫療標準(GCS，CT)。
圖2描繪了15例mTBI患者的血液樣品中的生物標記物水平。許多呈現3個標記物中的2個，表明生物標記物的結合/組可以提供理想的試驗結果。
圖3描繪了與對照相比，嚴重TBI患者超過7天的UCH-L1的血清和CSF中的水平。顯示的數據是平均+/-SEM濃度。對於對照，僅顯示單時間點作為最左邊一欄。
圖4描繪了在全部臨床隊列並且損傷後4小時內，血液中生物標記物UCH-L1和磷酸化神經絲重鏈區分開了CT正常與異常受試者，這支持了它們作為TBI的診斷生物標記物的用途。67例TBI患者中的UCHL1和pNFH的血中水平(頂部)。兩種生物標記物區分開了CT正常(mTBI)與CT異常患者(中度TBI)(底部)。該區分可以在受傷後4小時內進行。
圖5描繪了UCH-L1和pNHF可以基於CT區分TBI的亞型，同時血液中磷酸化神經絲重鏈水平區分正常CT、蛛網膜下出血(SAH)、和硬腦膜下血腫(SDH)的受試者。
具體實施方式
在腦損傷期間，由於快速的加速和減速、與爆炸相關的超壓衝擊波、或外來物體的穿透而對大腦造成損傷。血-腦屏障和脈管系統可以由於這些傷害被破壞或破裂，造成血液直接到達大腦組織以及在大腦和血液循環內的蛋白質成分的交換。從中樞神經系統釋放到血液中的蛋白質可以代表腦損傷以及多種神經退行性病症的生物標記物。
本文中所用的術語「樣品」指的是從人體和或動物體分離的生物材料。樣品可以包括任何適合的生物材料，特定組織或生物液體。樣品可以從任何適合的組織或生物液體中分離。在這方面，樣品可以是血液、血清、血漿、尿液、CSF或脊髓組織。因為TBI影響中樞神經系統，樣品優選地被從中樞神經系統(CNS)(即大腦和脊髓)的組織或生理液體中分離。在優選實施方式中，所述樣品從血液中分離。
樣品能夠以本領域已知的任何適合的方式獲得，例如通過活檢、血液取樣、尿液取樣、腰椎穿刺(即脊椎穿刺)、腦室穿刺、和小腦延髓池穿刺。在優選實施方式中，樣品通過腰椎穿刺獲得，其也指的是脊椎穿刺或CSF收集。腰椎穿刺包括通常在第三和第四節腰椎之間將脊椎穿刺針插入蛛網膜下隙中，在那裡收集CSF。在腰椎畸形或感染而將導致腰椎穿刺不能進行或者不可靠的情況下，所述樣品可以通過腦室穿刺或小腦延髓池穿刺收集。腦室穿刺通常對可能即將發生腦疝的人體受試者實施。腦室穿刺包括在顱骨上鑽孔，並且將針直接插入大腦的側腦室以收集CSF。小腦延髓池穿刺包括將針插入枕骨下方(顱骨的背面)，並且由於針靠近腦幹可能發生危險。
許多神經退行性疾病，例如阿爾茲海默病、帕金森病、亨廷頓病和ALS，其特徵在於異常蛋白質的積累或存在，其促成了疾病表徵。除了蛋白質，樣品中的代謝異常可以用作疾病階段的指示劑。因此，本文涉及對蛋白質水平變化或異常和基因表達或剪接的變化的檢測和評估的實施方式，包括但不限於額顳葉退化症、血管性痴呆、皮克氏病、神經肌紊亂。
術語「個人的」、「宿主」、「受試者」、和「患者」在本文中可交換地使用，並且指的是哺乳動物，包括但是不限於人類、齧齒目動物例如小鼠和大鼠、和其他實驗室用動物。
術語「生物標記物」指的是由有機體產生的有機分子，其對於疾病階段或病症有指示作用或與其相關。生物標記物包括但不限於蛋白質、代謝物、翻譯後修飾蛋白質等。
我們已經製備了抗體並開發出了對UCH-L1特異性和高靈敏度的分析方法。ELISA具有從10ng/mL下至20pg/mL的檢測範圍。所述分析方法使用EnCorTM單克隆抗體MCA-BH7用於俘獲以及兔多克隆RPCA-UCHL1用於檢測。
用於VSNL1/Vilip1的原型ELISA型分析具有從100ng/mL到1ng/mL的檢測範圍，並且具有足夠的靈敏度以基於公布的數據而檢測預期出現在CSF、血漿和血清中的該蛋白質的升高的水平。這使用了單克隆MCA-3A9來俘獲以及兔多克隆RPCA-VSNL1用於檢測。我們先前公開了SNCA/α-突觸核蛋白的抗體和ELISA的廣泛的表徵，其可以可靠地檢測從100ng/mL到1ng/mL範圍的該蛋白質。這使用了單克隆MCA-2A7來俘獲以及兔多克隆RPCA-aSyn用於檢測。
所述實施方式將通過以下實施例進一步描述，其沒有限定由權利要求限定的本發明的範圍。
實施例
診斷mTBI的方法。一個實施方式包括檢測從受試者獲得的樣品中的生物標記物水平和將這些生物標記物的水平與已知患有mTBI、中等或嚴重TBI的患者或沒有腦損傷的患者的生物標記物的預定水平進行關聯。生物標記物包括以下的一種或多種：泛素C-末端水解酶L1(UCH-L1)，膠質標記物例如膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，醛脫氫酶1家族成員L1(ALDH1L1)和其他膠質蛋白，磷酸化神經絲重鏈(pNFH)，磷酸化神經絲中鏈或磷酸化神經絲輕鏈(pNFM和輕鏈(pNFL))，α-突觸核蛋白，視椎蛋白樣蛋白1(VILIP-1)和S100B。
圖1描繪了在急診科進行臨床評估和CT掃描的67例受試者的組的血清中的UCH-L1和pNFH的不同水平。在抵達急診科時獲取血液樣品並且對蛋白質進行免疫測定。正常的CT掃描代表mTBI，且異常CT掃描代表中等或嚴重TBI。頂部圖顯示了UCH-L1和pNHF蛋白質水平，顯示了在異常CT掃描的患者相對於正常CT掃描的患者中，UCH-L1和pNFH兩者均呈現水平的增加。
那些具有正常CT掃描的患者相對於健康對照來說在血液中的UCH-L1和pNFH仍然呈現較高的水平。較低的圖描繪了在傷後4小時內抵達急診科的受試者血清中的UCH-L1和pNFH水平的比較。在輕微(CT正常)相對於中等(CT異常)TBI組中UCH-L1和pNFH水平均存在顯著差別。單獨地或組合地限定這些生物標記物的臨界值產生了mTBI的診斷和輕微與中等TBI之間的區分，其將能夠進行不同的臨床管理。
本文所述的檢測生物標記物濃度的方法的實施方式包括免疫分析或採用質譜法的系統。已經發展了對於不同的生物標記物的特異性的免疫分析(ELISA)，使用中尺度探索(Meso-Scale Discovery)平臺和已知的免疫分析條件。這些是基於使用生物標記物特異性小鼠單克隆俘獲抗體和使用與釕紅耦連的多克隆檢測抗體以通過電化學發光進行檢測。免疫分析的校準物從牛脊髓(對於pNFH)中純化和/或表達為重組蛋白(對於UCH-L1)。
對於神經絲蛋白的血液檢測，用尿素處理血液樣品以減少蛋白質聚集，其加強了某些樣品中的免疫分析檢測並且因此改善了整體結果。
質譜方法可以包括胰蛋白酶消化(或用其他已知酶消化)和然後液相色譜串聯質譜法以對肽進行識別和測序，以識別每個生物標記物。定量質譜法可以被用於對生理液體中的每種肽進行準確定量。
監測TBI治療處理的方法。一個實施方式包括檢測樣品中的生物標記物水平，樣品是隨時間在治療前和治療後從TBI受試者獲得的，並且將這些生物標記物水平隨時間的變化進行關聯。生物標記物包括以下的一種或多種：泛素C-末端水解酶L1(UCH-L1)，膠質標記物例如膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，醛脫氫酶1家族成員L1(ALDH1L1)和其他膠質蛋白，磷酸化神經絲重鏈(pNFH)，磷酸化神經絲中鏈或磷酸化神經絲輕鏈(pNFM和輕鏈(pNFL))，α-突觸核蛋白，視椎蛋白樣蛋白1(VILIP-1)和S100B。
檢測血-腦屏障完整性或血-腦脊液完整性的方法。優選方法包括檢測從受試者的血液或CSF獲得的樣品的生物標記物水平。生物標記物包括以下的一種或多種：泛素C-末端水解酶L1(UCH-L1)，膠質標記物例如膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，醛脫氫酶1家族成員L1(ALDH1L1)和其他膠質蛋白，磷酸化神經絲重鏈(pNFH)，磷酸化神經絲中鏈或磷酸化神經絲輕鏈(pNFM和輕鏈(pNFL))，α-突觸核蛋白，視椎蛋白樣蛋白1(VILIP-1)和S100B。
檢測損傷機制、損傷區域、腦損傷造成的異質性和結果的方法。我們的優選方法包括檢測從受試者的血液或CSF獲得的樣品的生物標記物水平。生物標記物包括以下的一種或多種：泛素C-末端水解酶L1(UCH-L1)，膠質標記物例如膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，醛脫氫酶1家族成員L1(ALDH1L1)和其他膠質蛋白，磷酸化神經絲重鏈(pNFH)，磷酸化神經絲中鏈或磷酸化神經絲輕鏈(pNFM和輕鏈(pNFL))，α-突觸核蛋白，視椎蛋白樣蛋白1(VILIP-1)和S100B。
TBI異質性由TBI患者血液中存在或不存在不同蛋白而產生，並且可以被用於區分患者和幫助臨床管理。TBI的預後指標通過將生物標記物水平與具有已知臨床結果的患者的生物標記物的預定水平進行關聯，對預後指標使用生物標記物臨界值。
應該指出的是本文的實施方式可以進一步包括監測一種或多種生物標記物的時間動力學和加工(processing)，作為治療功效和結果的度量。
因此應該理解雖然本發明已經結合它的具體實施方式進行了描述，前述實施方式旨在進行展示而不是限定本發明的範圍，本發明的範圍由所附權利要求限定。其他方面、益處和修飾在權利要求的範圍內。