一種神經組織工程管狀支架及其製備方法

2023-12-08 04:01:46 1

專利名稱：一種神經組織工程管狀支架及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種神經組織工程管狀支架及其製備方法，特別涉及一種具有軸向多通道特定微結構基質的神經導管、製備方法及其專用模具，屬於生物醫用材料及組織工程技術領域。
背景技術：
周圍神經損傷臨床非常多見，神經一旦缺損，相應部位的感覺、運動功能就會受到影響甚至喪失。目前臨床上有效的治療方法是自體神經移植。但自體神經來源有限，且伴隨著供區功能受損。人們嘗試應用骨骼肌、靜脈替代自體神經移植，收效甚微。隨著醫學、生物學和組織工程學的發展，人們考慮並嘗試用人工神經導管來代替自體神經移植。其中，生物來源可吸收神經再生導管的研究和應用是最有希望的。生物來源可吸收神經再生導管是指用生物來源可體內降解的材料預製成導管，再將損傷神經的遠近斷端放入管內，兩斷端神經外膜與管壁固定，隨後，神經軸突即可沿著管腔從近端長入遠端。神經導管在神經再生的過程中可以防止纖維疤痕組織的侵入，提高局部神經營養因子的濃度，營造有利於神經再生的微環境，引導軸突沿正確的方向生長，同時隨著神經再生的完成逐漸降解，避免二次手術取出。但是，以往研究所用的中空導管，如自體靜脈、矽膠管及用PLGA、膠原、殼聚糖等製作的人工神經導管，與正常神經結構差距甚遠，不利於軸突的附著延伸，也難以預置足夠的雪旺細胞，管內多餘的空間很快被滲出血腫所充填，阻礙軸突生長。鑑於此，人們開始考慮在導管中填充基質材料，增大軸突攀附生長的表面積，或承載細胞及營養因子。中國專利申請00810000.4提供一種聚酯類材料神經導管，管腔內填充膠原鹽酸溶液經冷凍乾燥得到具有微細纖維化的膠原體內容物，然而，該方法難以製得具有軸向貫通的多通道結構；中國專利申請02113103.1將殼聚糖纖維置入殼聚糖管制備純殼聚糖神經導管；中國專利申請02105864.4在聚酯類材料製得的中空管中放置摺疊捲曲的具有凹凸表面的多孔性聚酯類薄膜來增大腔內表面積，製作多通道型神經再生導管，然而上述導管內容物呈游離狀態，不能維持穩定的結構，並且難以預置細胞。美國專利US 5925053(1999)和US 6214021(2001)提供了製作多管腔(multi-lumen)神經導管的方法，該方法在模具內事先放置若干細纖維，再將含有有機溶劑的高分子溶液注入模具內，之後經冷凍方法予以固化，再經升華方式將此材料內的溶劑抽出，最後將細纖維抽出而形成多管腔的神經導管。但該方法所得神經導管無外壁，纖維組織易侵入，所用高分子材料如PLGA、PGA、PLA體內降解酸性產物不利於軸突生長，所用有機溶劑不利於負載營養因子。
理想的神經組織工程支架應該模擬正常神經結構，能夠提供軸突攀附生長的軸向微細管道及神經營養因子，並且可以承載利於神經修復和再生的細胞，防止纖維瘢痕組織的侵入，從而改善再生微環境；支架材料應具有良好的生物相容性和可生物降解性；支架應具有神經的形狀、穩定的結構、合適的孔徑、孔隙率和外壁的通透性；支架內部的基質結構應該具有密集的軸向通道和橫向滲透性微孔；這種具有穩定的仿生結構的多通道神經導管有利於細胞粘附、遷移和引導軸突再生。目前可以用來製作這種神經導管的技術有(1)顆粒瀝濾制孔技術(particulate-leaching techniques)；(2)熱擠壓技術(heat compression andextrusion techniques)(3)實體自由成形製造(solid free-form fabrication)，也叫快速成型技術。然而，用顆粒瀝濾制孔技術製作的無規結構導管引導軸突再生能力是不可靠的，熱擠壓技術不能在基質材料中加入治療性藥物或因子，因為機械加工和熱處理過程會使他們變性或降解，而且，目前的熱擠壓技術不適合製作適於神經修復的小孔徑導管。快速成型技術模擬噴墨印表機原理，進行三維器官列印，但受到材料的限制，一些生物材料(比如膠原和殼聚糖)就不能應用於此種方法，而且藥物因子同樣不能忍受這樣的加工過程而限制了它的應用。因此，如何優化製備一種更加適合神經修復與再生的組織工程支架是材料和神經科學工作者共同面臨的重要任務。

發明內容
本發明的目的是模擬正常神經結構，採用天然可降解的生物材料，製備具有軸向多通道特定微結構基質的神經組織工程管狀支架。使該支架不僅能夠提供軸突攀附生長的軸向微細管道及神經營養因子，並且可以承載利於神經修復和再生的細胞，防止纖維瘢痕組織的侵入；支架材料應具有良好的生物相容性和可生物降解性；且具有穩定的結構、合適的孔徑、孔隙率和外壁的通透性；支架內部的基質結構應該具有密集的軸向通道和橫向滲透性微孔；這種具有穩定的仿生結構的多通道神經導管有利於細胞粘附、遷移和引導軸突再生。
上述發明目的是通過如下技術方案實現的一種神經組織工程管狀支架，其特徵在於該支架由殼聚糖外管壁和具有軸向多通道的生物來源填充基質組成，且各通道間具有相互連通的微孔；所述的生物來源填充基質選自殼聚糖、膠原、明膠中的一種或它們的混合物；所述軸向通道數目為7～50，其通道內徑為200～500μm。所述殼聚糖外管壁厚度為0.4～1mm，內徑為1～5mm。
本發明還提供了一種製備神經組織工程管狀支架的方法，該方法按如下步驟進行1)將聚四氟乙烯包被的不鏽鋼棒芯模浸入2～4％(w/v)殼聚糖乙酸溶液中，拔出，冷凍，再浸入、拔出、冷凍，至少反覆3次，然後置於-20℃～-196℃冷凍12～48小時，再將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥；2)將乾燥後的帶有芯模的殼聚糖管置於濃度為2～10％(w/v)的氫氧化鈉溶液中浸泡10～30分鐘，取出，用去離子水漂洗至中性，再浸於pH＝7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中10～30分鐘，自然乾燥；3)取出不鏽鋼棒芯模，製得不同長度、壁厚0.4～1.0mm的殼聚糖圓管；4)利用專用模具將所製備的殼聚糖管置於模具的兩個帶有鋼針固定孔的鋼針固定片之間，根據所要製備的通道的數目及通道直徑的不同，將相應數目和直徑的不鏽鋼針平行貫穿雙側鋼針固定孔及殼聚糖管內；所述鋼針固定片上的固定孔數目為7～50，其孔徑為200～500μm。
5)將濃度為2～4％(w/v)殼聚糖乙酸溶液、濃度為1～3％(w/v)膠原鹽酸溶液、濃度為10～20％(w/v)的明膠水溶液或它們的混合液注入殼聚糖管中；6)使雙側鋼針固定片與殼聚糖管兩端緊密接觸，連同模具一起置於-20℃～-80℃冷凍12～48小時，然後將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥；7)再按步驟2)所述的方法脫酸，然後再逐一取出不鏽鋼針，最終得到所需要的具有軸向排列多通道的神經組織工程管狀支架。
本發明還提供了一種製作所述神經組織工程管狀支架的專用模具，其特徵在於該模具包括底座，設置在底座上的兩塊可移動板，不鏽鋼針以及固定在可移動板上的兩塊鋼針固定片；在所述的每塊鋼針固定片的上方設有7～50個與所述鋼針直徑相匹配的鋼針固定孔，其孔徑為200～500μm，並均勻分布在直徑為1～5mm的圓形區域內。
本發明提供了一系列具有特定微結構的圓柱形神經組織工程管狀支架，支架材料來源於殼聚糖、明膠及膠原，不需要交聯劑等具有毒副作用物質。支架的外管壁具有微孔半滲透結構，既能防止纖維結締組織的侵入，也利於管內外營養物質和代謝產物的交換。支架內部縱向規則排列著許多圓柱形微細通道，這些通道不僅可以定向引導軸突生長，還可在植入前預置各種活性細胞，促進神經再生；微細通道間的基質材料具有相互貫通的微孔結構，既為細胞的黏附和生長提供了較大的表面積，也能為各微細通道間物質交換提供適宜的環境；並且，基質材料還能承載治療性藥物或因子，隨著材料的降解，藥物或因子不斷釋放出來起到緩釋作用。該製備工藝克服了現有的製備神經修復導管方法的缺點和不足，提供了一種新的製備神經組織工程支架的思路和方法。


圖1為本發明所使用的模具的結構示意圖。
圖2為圖1的左視圖。
圖3為本發明所製得的神經組織工程管狀支架外觀圖。
圖4為本發明所製得的神經組織工程管狀支架橫斷面放大圖。
圖5為在本發明所製得的神經組織工程管狀支架上培養神經細胞的掃描電鏡照片。
具體實施例方式
本發明提供的製備方法如下(1)將聚四氟乙烯包被的不鏽鋼棒芯模(直徑1～5mm)浸入2～4％(w/v)殼聚糖溶液(以0.2mol/L乙酸溶液配製)中，拔出，冷凍，再浸入、拔出、冷凍，至少反覆3次，然後置於-20℃～-196℃冷凍12～48小時，再將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥。將乾燥後的帶有芯模的殼聚糖圓管，置於2％(w/v)的氫氧化鈉溶液中浸泡10～30分鐘，取出，用去離子水漂洗至中性，再浸於pH＝7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中10～30分鐘。用濾紙吸取殼聚糖管表面水分，自然乾燥。取出不鏽鋼棒芯模，最終得到壁厚0.4～1.0mm的半通透性殼聚糖圓管。
(2)製備多通道基質可採用如附圖1所示的模具，該模具包括底座4，設置在底座上的兩塊可移動板3，不鏽鋼針7以及固定在可移動板上的兩塊鋼針固定片1；在每塊鋼針固定片的上方設有7～50個與所述鋼針直徑相匹配的鋼針固定孔8，其孔徑為200～500μm；鋼針固定孔均勻分布在直徑為1～5mm的圓形區域內。
將長度為1～10cm的殼聚糖圓管6置於專用模具(圖1)上兩個鋼針固定片1之間，根據所要製備的通道的數目(7～50根)及通道直徑(200～500μm)的不同，將相應數目和直徑的不鏽鋼針7平行貫穿雙側鋼針固定孔8及殼聚糖管6內。然後將2～4％(w/v)殼聚糖乙酸溶液、1～3％(w/v)膠原鹽酸溶液、10～20％(w/v)的明膠水溶液單獨或它們的混合液注滿殼聚糖管，將模具兩側可移動板3向內相向移動，使雙側鋼針固定片與殼聚糖管兩端緊密接觸，旋緊可移動板固定螺釘5，迅速連同模具一起置於-20℃～-80℃冷凍12～48小時，然後將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥(主幹溫度約-40～-80℃，乾燥時間12～48小時)，再置於2～10％(w/v)的氫氧化鈉溶液中浸泡10～30分鐘，取出，用去離子水漂洗至中性，浸於pH＝7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中10～30分鐘，取出，自然乾燥。逐一慢慢取出不鏽鋼針，最終得到所需要的具有軸向排列多通道基質的神經導管。
實施例1(1)將直徑1mm聚四氟乙烯包被的不鏽鋼棒芯模浸入2％(w/v)殼聚糖溶液(以0.2mol/L乙酸溶液配製)中，拔出，冷凍，再浸入、拔出、冷凍，反覆3次，然後置於-20℃冷凍12小時，再將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥。將乾燥後的帶有芯模的殼聚糖圓管，置於2％(w/v)的氫氧化鈉溶液中浸泡10分鐘，取出，用去離子水漂洗至中性，再浸於pH＝7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中10分鐘。用濾紙吸取殼聚糖管表面水分，自然乾燥。取出不鏽鋼棒芯模，最終得到壁厚0.4mm的半通透性殼聚糖圓管。
(2)如附圖所示，將長度為1cm的殼聚糖管6置於專用模具(圖1)上兩個鋼針固定片1之間，將7根直徑200μm的不鏽鋼針平行貫穿雙側鋼針固定孔8及殼聚糖管6內。然後將2％(w/v)殼聚糖乙酸溶液注滿殼聚糖管，將模具兩側可移動板3向內相向移動，使雙側鋼針固定片與殼聚糖管兩端緊密接觸，旋緊可移動板固定螺釘5，迅速連同模具一起置於-20℃冷凍12小時，然後將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥(主幹溫度約-40℃，乾燥時間12小時)，再置於2％(w/v)的氫氧化鈉溶液中浸泡10分鐘，取出，用去離子水漂洗至中性，浸於pH＝7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中10分鐘，取出，自然乾燥。逐一慢慢取出不鏽鋼針，最終得到所需要的具有軸向排列多通道基質的神經導管。
實施例2(1)將直徑5mm聚四氟乙烯包被的不鏽鋼棒芯模浸入4％(w/v)殼聚糖溶液(以0.2mol/L乙酸溶液配製)中，拔出，冷凍，再浸入、拔出、冷凍，反覆5次，然後置於-196℃冷凍48小時，再將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥。將乾燥後的帶有芯模的殼聚糖圓管，置於2％(w/v)的氫氧化鈉溶液中浸泡30分鐘，取出，用去離子水漂洗至中性，再浸於pH＝7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中30分鐘。用濾紙吸取殼聚糖管表面水分，自然乾燥。取出不鏽鋼棒芯模，最終得到壁厚1.0mm的半通透性殼聚糖圓管。
(2)如附圖所示，將長度為10cm的殼聚糖管6置於專用模具(圖1)上兩個鋼針固定片1之間，將50根直徑200μm的不鏽鋼針7平行貫穿雙側鋼針固定孔8及殼聚糖管6內。然後將1％(w/v)膠原溶液(以1mol/L鹽酸配製)注滿殼聚糖管，將模具兩側可移動板3向內相向移動，使雙側鋼針固定片與殼聚糖管兩端緊密接觸，旋緊可移動板固定螺釘5，迅速連同模具一起置於-80℃冷凍48小時，然後將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥(主幹溫度約-80℃，乾燥時間48小時)，再置於10％(w/v)的氫氧化鈉溶液中浸泡30分鐘，取出，用去離子水漂洗至中性，浸於pH＝7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中30分鐘，取出，自然乾燥。逐一慢慢取出不鏽鋼針，最終得到所需要的具有軸向排列多通道基質的神經導管。
實施例3(1)將直徑3mm聚四氟乙烯包被的不鏽鋼棒芯模浸入3％(w/v)殼聚糖溶液(以0.2mol/L乙酸溶液配製)中，拔出，冷凍，再浸入、拔出、冷凍，反覆4次，然後置於-80℃冷凍24小時，再將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥。將乾燥後的帶有芯模的殼聚糖圓管，置於2％(w/v)的氫氧化鈉溶液中浸泡20分鐘，取出，用去離子水漂洗至中性，再浸於pH＝7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中20分鐘。用濾紙吸取殼聚糖管表面水分，自然乾燥。取出不鏽鋼棒芯模，最終得到壁厚0.6mm的半通透性殼聚糖圓管。
(2)如附圖所示，將長度為3cm的殼聚糖管6置於專用模具(圖1)上兩個鋼針固定片1之間，將21根直徑400μm的不鏽鋼針7平行貫穿雙側鋼針固定孔8及殼聚糖管6內。將2％(w/v)殼聚糖溶液(以0.2mol/L乙酸溶液配製)與10％(w/v)的明膠水溶液按等體積混合均勻，將混合溶液注滿殼聚糖管，將模具兩側可移動板3向內相向移動，使雙側鋼針固定片與殼聚糖管兩端緊密接觸，旋緊可移動板固定螺釘5，迅速連同模具一起置於-20℃冷凍24小時，然後將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥(主幹溫度約-40℃，乾燥時間24小時)，再置於4％(w/v)的氫氧化鈉溶液中浸泡20分鐘，取出，用去離子水漂洗至中性，浸於pH＝7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中20分鐘，取出，自然乾燥。逐一慢慢取出不鏽鋼針，最終得到所需要的具有軸向排列多通道基質的神經導管。
實施例4(1)將直徑2mm聚四氟乙烯包被的不鏽鋼棒芯模浸入2％(w/v)殼聚糖溶液(以0.2mol/L乙酸溶液配製)中，拔出，冷凍，再浸入、拔出、冷凍，反覆4次，然後置於-20℃冷凍24小時，再將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥。將乾燥後的帶有芯模的殼聚糖圓管，置於2％(w/v)的氫氧化鈉溶液中浸泡20分鐘，取出，用去離子水漂洗至中性，再浸於pH＝7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中20分鐘。用濾紙吸取殼聚糖管表面水分，自然乾燥。取出不鏽鋼棒芯模，最終得到壁厚0.5mm的半通透性殼聚糖圓管。
(2)如附圖所示，將長度為2cm的殼聚糖管6置於專用模具(圖1)上兩個鋼針固定片1之間，將9根直徑400μm的不鏽鋼針7平行貫穿雙側鋼針固定孔8及殼聚糖管6內。將2％(w/v)殼聚糖溶液(以0.2mol/L乙酸溶液配製)與1％(w/v)的膠原溶液(以1mol/L鹽酸配製)按等體積混合均勻，將混合溶液注滿殼聚糖管，將模具兩側可移動板3向內相向移動，使雙側鋼針固定片與殼聚糖管兩端緊密接觸，旋緊可移動板固定螺釘5，迅速連同模具一起置於-20℃冷凍24小時，然後將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥(主幹溫度約-40℃，乾燥時間24小時)，再置於2％(w/v)的氫氧化鈉溶液中浸泡30分鐘，取出，用去離子水漂洗至中性，浸於pH＝7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中20分鐘，取出，自然乾燥。逐一慢慢取出不鏽鋼針，最終得到所需要的具有軸向排列多通道基質的神經導管。
權利要求
1.一種神經組織工程管狀支架，其特徵在於該支架由殼聚糖外管壁和具有軸向多通道的生物來源填充基質組成，且各通道間具有相互連通的微孔；所述的生物來源填充基質選自殼聚糖、膠原、明膠中的一種或它們的混合物；所述軸向通道數目為7～50，其通道內徑為200～500μm。
2.按照權利要求1所述神經組織工程管狀支架，其特徵在於所述殼聚糖外管壁厚度為0.4～1mm，內徑為1～5mm。
3.一種製備如權利要求1所述的神經組織工程管狀支架的方法，其特徵在於該方法按如下步驟進行1)將聚四氟乙烯包被的不鏽鋼棒芯模浸入2～4％(w/v)殼聚糖乙酸溶液中，拔出，冷凍，再浸入、拔出、冷凍，至少反覆3次，然後置於-20℃～-196℃冷凍12～48小時，再將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥；2)將乾燥後的帶有芯模的殼聚糖管置於濃度為2～10％(w/v)的氫氧化鈉溶液中浸泡10～30分鐘，取出，用去離子水漂洗至中性，再浸於pH＝7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中10～30分鐘，自然乾燥；2)取出不鏽鋼棒芯模，製得不同長度、壁厚0.4～1.0mm的殼聚糖圓管；4)將所製備的殼聚糖管置於兩個帶有鋼針固定孔的鋼針固定片之間，根據所要製備的通道的數目及通道直徑的不同，將相應數目和直徑的不鏽鋼針平行貫穿雙側鋼針固定孔及殼聚糖管內；5)將濃度為2～4％(w/v)殼聚糖乙酸溶液、濃度為1～3％(w/v)膠原鹽酸溶液、濃度為10～20％(w/v)的明膠水溶液或它們的混合液注滿殼聚糖管；6)使雙側鋼針固定片與殼聚糖管兩端緊密接觸，置於-20℃～-80℃冷凍12～48小時，然後將其置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥；7)再按步驟2)所述的方法脫酸，然後再逐一取出不鏽鋼針，最終得到所需要的具有軸向排列多通道的神經組織工程管狀支架。
4.一種製作如權利要求1所述神經組織工程管狀支架的專用模具，其特徵在於該模具包括底座(4)，設置在底座上的兩塊可移動板(3)，不鏽鋼針(7)以及固定在可移動板上的兩塊鋼針固定片(1)；在所述的每塊鋼針固定片的上方設有7～50個與所述鋼針直徑相匹配的鋼針固定孔(8)，其孔徑為200～500μm，並均勻分布在直徑為1～5mm的圓形區域內。
全文摘要
一種神經組織工程管狀支架及其製備方法，該神經組織工程管狀支架由殼聚糖管壁和具有軸向多通道的生物來源填充基質組成，且各通道間具有相互連通的微孔，既能防止纖維結締組織的侵入，也利於管內外營養物質和代謝產物的交換。該方法首先製備內徑為1～5mm半滲透性殼聚糖中空管，然後在管中灌入殼聚糖、膠原或明膠等生物大分子溶液，利用專用模具及冷凍乾燥技術，製備具有7～50個軸向通道的可用於神經損傷修復的管狀支架。所得具有仿生結構的多通道神經導管有利於細胞粘附、遷移和引導軸突定向生長，適用於神經損傷的修復與再生。該製備工藝操作簡便，提供了一種新的製備神經組織工程支架的思路和方法。
文檔編號A61L27/00GK1593354SQ200410009259
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月25日 優先權日2004年6月25日
發明者敖強, 王愛軍, 張秀芳, 公衍道, 趙南明 申請人:清華大學