受農藥侵害菸葉的超氧化物歧化酶活性的測定方法與流程
2023-11-30 09:31:36
本發明涉及化學檢測分析領域，特別是指受農藥侵害菸葉的超氧化物歧化酶活性的測定方法。
背景技術：
二氯喹啉酸是防除稻田稗草的特效選擇性除草劑，屬激素型喹啉羧酸類除草劑，雜草中毒症狀與生長素類作用相似，主要用於防治稗草且適用期很長，1-7葉期均有效。水稻安全性好。
有關研究表明二氯喹啉酸作為激素類除草劑，能夠刺激乙烯在植物體內積累。二氯喹啉酸的靶標位點位於細胞壁的生物合成中，在禾本科植物中起到細胞壁合成抑制劑的作用，不同禾本科植物作用位點對二氯喹啉酸的敏感性。乙烯可抑制細胞壁合成酶的活性從而減少細胞壁的合成，乙烯含量的提高引起了ABA的積累，ABA在調節植物生長、葉片衰老、氣孔開放起重要的作用。
二氯喹啉酸在土壤中有積累作用，對菸草生產會產生明顯的藥害。我國部分煙田曾因氯喹啉酸出現大面積菸草畸形生長現象，症狀為新葉先出現不正常生長,葉緣下卷，葉片向背皺縮,致使葉片狹長，嚴重者呈線狀，嚴重影響菸草的產量和質量。
由於菸草這一作物的特殊性，對於其受到氯喹啉酸的影響將直接影響菸農的收成，以及菸葉的質量，因此，對於氯喹啉酸對菸草的影響，需要進行多方面的，準確的，可靠的分析，目前，對於農藥侵害植物的分析雖然有報導以及一般性的分析方法，但針對氯喹啉酸對菸草侵害的研究分析還相對較少，超氧化物歧化酶(SOD)作為重要的還原劑，在細胞中具有極其重要的作用，但目前對於受農藥(氯喹啉酸)侵害的菸葉中，SOD受到的影響與變化，缺少細緻深入的研究，造成在氯喹啉酸對菸草的侵害的程度，影響等少有深入的了解，並的分析的結果上還存在較大的準確度差異。
技術實現要素：
本發明提出一種受農藥侵害菸葉的超氧化物歧化酶活性的測定方法，解決了現有技術中對受農藥(氯喹啉酸)侵害的菸葉中，SOD受到的影響與變化了解較少，測定不夠精準的問題。
本發明的技術方案是這樣實現的：受農藥侵害菸葉的超氧化物歧化酶活性的測定方法，包括以下步驟：
(1)試劑配製，包括配製：磷酸緩衝液、提取介質、甲硫氨酸溶液、NBT、EDTA-Na2、核黃素溶液；
(2)從菸葉中製備酶液
(3)測定樣品超氧化物歧化酶的活性：
以遮光的對照管作為空白，分別在560nm波長下測定步驟(2)中製備的酶液的吸光度，按下式計算超氧化物歧化酶活性。
式中：SOD總活性以每克鮮重酶單位表示：
A0——照光對照管的光吸收值；
As——樣品管的光吸收值；
V1——樣液總體積(mL)；
VT——測定時樣品用量(mL)；
W——樣品鮮重(g)。
(4)在菸草5～6片真葉期移入二氯喹啉酸添加濃度為1.04×10-3mg/kg、2.08×10-3mg/kg、4.17×10-3mg/kg、8.33×10-3mg/kg、1.67×10-2mg/kg藥土中，分別在7d、14d、21d、28d、35d採用步驟(1)～(3)測量菸葉超氧化物歧化酶活性。
進一步，步驟(1)中，試劑的配製採用以下配比和參數：
0.05mol·L-1磷酸緩衝液；
提取介質：50mmol·L-1pH7.8磷酸緩衝液，內含1％聚乙烯吡咯烷酮；
130mmol·L-1甲硫氨酸溶液：稱1.399gMet，用磷酸緩衝液溶解並定容至100mL；
750μmol·L-1NBT：稱取0.06133gNBT，用磷酸緩衝液溶解並定容至100mL，避光保存；
100μmol·L-1EDTA-Na2：稱取0.037224gEDTA-Na2，定容1000mL；
20μmol·L-1核黃素溶液：稱取0.0075g核黃素，定容至100mL，避光保存。
進一步，步驟(2)中，包括以下步驟：取第四片展開菸草葉片，去中脈，準確稱取0.3g於預冷的研缽中，加入預冷的提取介質1.5mL，在冰浴中研磨成勻漿，轉移至1.5mL離心管中，-4℃13000rpm下冷凍離心20min，上清夜即為SOD粗提液；
顯色反應：取透明度好、質地相同的試管，樣品測定管和對照；
混勻後，給1支對照管罩上比試管稍長的雙層黑色硬紙套遮光，與其他各管同時置於4000lx紫外燈下反應5min。
本發明的所述受農藥侵害菸葉的超氧化物歧化酶活性的測定方法，針對菸草的特性，結合對氯喹啉酸的侵害機理研究，對農藥侵害過程中SOD活性的變化，試劑的選配，操作環境、參數等進行了較為嚴格的調整與控制，使得到的氯喹啉酸侵害菸葉的SOD的活性的測量更加準確，可靠，為合理使用氯喹啉酸以及消除影響，提供科學的依據。
附圖說明
圖1為二氯喹啉酸對菸草葉片SOD活性的動態分析。
具體實施方式
下面將結合本發明的實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
實施例
菸草種子採用品種為K326。溫室播種，育苗，於五至六片真葉期移栽，進行農藥侵害菸葉的SOD活性的測定
(1)試劑配製
0.05mol·L-1磷酸緩衝液(pH7.8)；
提取介質：50mmol·L-1pH7.8磷酸緩衝液(內含1％聚乙烯吡咯烷酮)；
130mmol·L-1甲硫氨酸(Met)溶液：稱1.399gMet，用磷酸緩衝液溶解並定容至100mL；
750μmol·L-1NBT：稱取0.06133gNBT，用磷酸緩衝液溶解並定容至100mL，避光保存；
100μmol·L-1EDTA-Na2：稱取0.037224gEDTA-Na2，定容1000mL；
20μmol·L-1核黃素溶液：稱取0.0075g核黃素，定容至100mL，避光保存
(2)酶液的製備
取第四片展開菸草葉片，去中脈，準確稱取0.3g(共三份)於預冷的研缽中，加入預冷的提取介質1.5mL(分三次加入，一次研磨，兩次衝洗)，在冰浴中研磨成勻漿，轉移至1.5mL離心管中，-4℃13000rpm下冷凍離心20min，上清夜即為SOD粗提液。
表1顯色反應試劑配置
顯色反應：取透明度好、質地相同的試管，樣品測定管和對照(一支遮光，2支照光)，按表1加入試劑。
混勻後，給1支對照管罩上比試管稍長的雙層黑色硬紙套遮光，與其他各管同時置於4000lx紫外燈下反應5min(要求各管照光情況一致，反應溫度控制在25～35℃之間，視酶活性高低適當調整反應時間)。
(3)樣品超氧化物歧化酶活性的測定
至反應結束後，用黑布罩蓋上試管，終止反應。以遮光的對照管作為空白，分別在560nm波長下測定各管的吸光度，按下式計算超氧化物歧化酶(SOD)活性。
式中：SOD總活性以每克鮮重酶單位表示：
A0——照光對照管的光吸收值；
As——樣品管的光吸收值；
V1——樣液總體積(mL)；
VT——測定時樣品用量(mL)；
W——樣品鮮重(g)。
(4)在菸草5～6片真葉期移入二氯喹啉酸添加濃度為1.04×10-3mg/kg、2.08×10-3mg/kg、4.17×10-3mg/kg、8.33×10-3mg/kg、1.67×10-2mg/kg藥土中，分別在7d、14d、21d、28d、35d採用步驟(1)～(3)測量菸葉超氧化物歧化酶活性。
測定結果如圖1所示，可以看出，二氯喹啉酸對菸草POD酶活力的影響是隨施用量增加而增強。移植後28d，不同施藥量處理較對照酶活力增強。對照菸草葉片中過氧化物酶活力為17.47OD·g-1·min-1，二氯喹啉酸濃度為1.04×10-3mg/kg、2.08×10-3mg/kg、4.17×10-3mg/kg、8.33×10-3mg/kg、1.67×10-2mg/kg處理菸草葉片中過氧化物酶活力分別為29.61OD·g-1·min-1、23.73OD·g-1·min-1、30.33OD·g-1·min-1、41.00OD·g-1·min-1、57.73OD·g-1·min-1較，處理較對照分別提高69.47％、35.80％、73.61％、134.69％、230.45％。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。