一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法及應用的製作方法
2023-11-30 02:44:41 1
一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，步驟如下：將金納米粒子與黃嘌呤氧化酶溶液混合反應，然後加入TCEP處理過的DNA，繼續反應可得納米信標；將處理好的金電極浸泡至含有肯普肽的磷酸緩衝溶液中反應，再用巰基已烷封閉空白位點，然後放置於含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS緩衝液中反應，隨後分別用鋯離子和納米信標進行處理，通過鋯離子與磷酸根的配位作用將納米信標組裝於磷酸化的肯普肽修飾電極上，得到雙信號放大電化學發光生物電極；將該電極作為工作電極，和參比電極、輔助電極正確連接在電化學工作站上以組成雙信號放大電化學發光生物傳感器。該傳感器可應用於蛋白激酶的活性檢測。
【專利說明】—種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種新型的電化學發光生物傳感器，具體地說是涉及一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法及應用。
【背景技術】
[0002]通過激酶調節的蛋白磷酸化是生物新陳代謝的一個重要的過程，它在信號傳導和管理細胞活動方面起到重要的作用。蛋白激酶調節異常會打亂蛋白磷酸化的體系，導致各種疾病的發生。因此，識別蛋白激酶活性及其抑制劑不僅有利於對生物代謝過程清晰的了解，而且也有利於疾病的早期發現和及時治療。
[0003]電化學發光(ECL)是電化學技術和發光技術的結合體。與傳統電化學和發光技術相比，電化學發光不僅具有可控性和寬的動力學濃度檢測範圍，同時還可實現檢測過程中電位和空間的可控性。因此運用該技術可實現對生物分子超靈敏的定性定量分析。隨著納米技術和信號放大技術的發展，具有生物相容性和大的比表面積的納米材料結合信號放大技術也被融入到電化學生物傳感器中，大大提高了傳感性能，為發展新型的電化學生物傳感器提供了很大的發展空間。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，以及該方法所製備的電化學發光生物傳感器的具體應用。
[0005]本發明所採用的技術解決方案是:
[0006]一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，包括以下步驟:
[0007](I)納米信標的製備
[0008]將金納米粒子與黃嘌呤氧化酶溶液混合反應，然後加入TCEP (三(2-氯乙基)磷酸酯)處理過的DNA，繼續反應可得納米信標；
[0009](2)磷酸化的肯普肽修飾電極的製備
[0010]先將金電極進行預處理，然後將處理好的金電極浸泡至含有肯普肽的磷酸緩衝溶液中反應，反應完成後衝洗乾燥；再用巰基已烷封閉空白位點，然後放置於含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-Hcl))緩衝液中，反應得到磷酸化的肯普肽修飾電極；
[0011](3)雙信號放大電化學發光生物電極的製備
[0012]將步驟⑵得到的磷酸化的肯普肽修飾電極清洗乾淨，隨後該電極用50 μ L0.5mmol/L錯離子處理Ih,得到錯離子修飾的電極,再用30 μ L步驟(I)製備的納米信標進行處理，作用時間為lO-lOOmin，通過鋯離子與磷酸根的配位作用將納米信標組裝於磷酸化的肯普肽修飾電極上，得到雙信號放大電化學發光生物電極；
[0013](4)雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備
[0014]將步驟(3)得到的雙信號放大電化學發光生物電極作為工作電極，和參比電極、輔助電極正確連接在電化學工作站上以組成雙信號放大電化學發光生物傳感器。
[0015]優選的，步驟(I)中，所述金納米粒子採用如下步驟製得:將IOOmL濃度為0.01%g/ml的HAuCl4水溶液加熱至回流，然後加入2.5mL濃度為1% g/ml的檸檬酸鈉水溶液，在保持溶液沸騰條件下反應15min，溶液由無色逐漸變成酒紅色為止，製得金納米粒子，將製備的金納米粒子置於冰箱中保存，備用。
[0016]優選的,步驟⑴中:所述黃嘌呤氧化酶溶液的濃度為lmg/ml,按ImL金納米粒子與20 μ L的黃嘌呤氧化酶溶液的比例混合，反應時間為2h ;所述TCEP處理過的DNA的加入量為12 μ L，添加後於室溫反應40min後，再在4°C過夜反應即可得金納米粒子混合液，然後向金納米粒子混合液中逐滴加入100 μ Llmol/L NaCl後，溶液顏色沒有明顯變化，離心分離多餘的DNA和黃嘌呤氧化酶，最終得到納米信標。
[0017]優選的，步驟(2)中，所述金電極的預處理步驟如下:先將金電極分別用0.3和0.05 μ m的a -Al2O3粉末在麂皮上拋光打磨，然後依次在乙醇和去離子水中超聲清洗，再在
0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電化學清洗和活化。
[0018]優選的，步驟⑵中:所述含有肯普肽的磷酸緩衝溶液的pH值為7.4，緩衝溶液中磷酸的含量為0.05mol/L，肯普肽的含量為500μπιΟ1/1 ;將處理好的金電極浸泡至含有肯普肽的磷酸緩衝溶液中，反應溫度為室溫，反應時間為12h ;所述巰基乙烷的濃度為lmmol/L ;所述含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS緩衝液的pH值為7.4，緩衝溶液中三羥甲基氨基甲烷的含量為50mmol/L，蛋白激酶的含量為0-100U/mL，腺嘌呤核苷三磷酸的含量為100 μ mol/L,電極置於含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS緩衝液中，反應溫度為37 °C，反應時間為Ih。
[0019]步驟(3)中:鋯離子的濃度為0.5mmol/L，納米信標的用量為30 μ L。
[0020]步驟(3)中:所述作用時間優選為60min。
[0021]優選的，步驟(4)中:將雙信號放大電化學發光生物電極置於磷酸緩衝溶液中，磷酸緩衝溶液中磷酸的濃度為0.lmol/L, pH值為6.5-9.0,緩衝液中包含有5mmol/L的次黃嘌呤和100 μ mol/L的魯米諾，黃嘌呤氧化酶催化次黃嘌呤產生雙氧水，雙氧水催化放大魯米諾的發光，採用三電極系統，飽和KCl的Ag/AgCl為參比電極，鉬絲為輔助電極。
[0022]更為優選的，所述磷酸緩衝溶液的pH值為7.8。
[0023]上述製備的雙信號放大電化學發光生物傳感器可應用於蛋白激酶的活性檢測。
[0024]本發明的有益技術效果是:
[0025](I)本發明構建了一種基於無機鋯離子對磷酸化的蛋白的識別作用以及結合金納米粒子和酶的催化的雙重信號放大的電化學發光生物傳感器，可實現蛋白激酶活性的靈敏、快速、簡單檢測。
[0026](2)本發明利用鋯離子做連接劑，將信號放大部分與磷酸化部分連接，具有以下優勢:1.價格實惠。鋯離子屬於無機金屬材料，比抗原抗體或親和素等生物類藥品要便宜很多。2.選擇性好，簡單可行。根據磷酸化前後有無磷酸根，通過鋯離子與磷酸根的強配位作用可選擇性識別磷酸化的蛋白。3.藥品易於保存，可多次使用。生物類的樣品很容易被汙染，而且一般存放條件嚴格，而無機金屬離子只要室溫保存即可。
【專利附圖】
【附圖說明】[0027]圖1是雙信號放大電化學生物傳感器的構建及其在蛋白激酶活性檢測的應用的示意圖；
[0028]圖2為納米信標的表徵圖；
[0029]圖3為電極層層組裝的電化學阻抗表徵圖；
[0030]圖4為納米信標溫育之前(a)和溫育之後(b)的ECL響應圖；
[0031]圖5為ECL響應與不同濃度的PKA的關係圖，濃度從a_g分別為:a-g: 0.01, 0.03, 0.1, I, 10, 50, 100U/mL。
【具體實施方式】
[0032]一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，包括以下步驟:
[0033](I)納米信標的製備
[0034]將IOOmL濃度為0.01 % g/ml的HAuCl4水溶液加入三頸燒瓶中，加熱至回流，然後向三頸燒瓶中迅速倒入2.5mL濃度為1% g/ml的檸檬酸鈉水溶液，在保持溶液沸騰條件下反應15min，溶液由無色逐漸變成酒紅色為止，製得金納米粒子，將製備的金納米粒子(AuNPs)置於冰箱中保存，備用。
[0035]取ImL金納米粒子(AuNPs)與20 μ L濃度為lmg/ml的黃嘌呤氧化酶(XOD)溶液混合反應2h，然後加入TCEP處理過的DNA，室溫反應40min後，在4°C過夜反應即可得DNA-XODiAuNPs混合液。然後向混合液中逐滴加入100 μ Llmol/L的NaCl後，溶液顏色沒有明顯變化，離心分離多餘的DNA和X0D，最終得到納米信標DNA-X0D@AuNPs。
[0036](2)磷酸化的肯普肽修飾電極的製備
[0037]先將金電極分別用0.3和0.05 μ m的a -Al2O3粉末在麂皮上拋光打磨，然後依次在乙醇和去離子水中超聲清洗，再在0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電化學清洗和活化。將處理好的金電極浸泡至含有500 μ M肯普肽的磷酸緩衝溶液(0.05mol/L，ρΗ7.4)中，並置於室溫下反應12個小時，電極經過大量的磷酸緩衝溶液(PBS)和二次水衝洗，乾燥。再用lmmol/L的巰基乙烷封閉空白位點，準備磷酸化實驗。然後將處理好的肯普肽和巰基己烷修飾的電極放置於含有一定量的蛋白激酶(PKA)和100 μ mol/L腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的TBS(50mM pH = 7.4)緩衝液中，在37°C反應一個小時，得到磷酸化的肯普肽修飾電極。
[0038](3)雙信號放大電化學發光生物電極的製備
[0039]將步驟⑵得到的磷酸化的肯普肽修飾電極清洗乾淨，隨後將該電極置於50 μ L0.5mmol/L鋯離子溶液中處理lh，得到鋯離子修飾的電極，再置於30 μ L步驟(I)製備的納米信標中，控制作用時間為60min，通過鋯離子與磷酸根的配位作用將納米信標組裝於磷酸化的肯普肽修飾電極上，得到雙信號放大電化學發光生物電極。最後，該修飾電極用大量的PBS潤洗。
[0040](4)雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備
[0041]將步驟(3)得到的雙信號放大電化學發光生物電極作為工作電極，置於磷酸緩衝溶液中，磷酸緩衝溶液中磷酸的濃度為0.lmol/L，pH值為7.8，緩衝液中包含有5mmol/L的次黃嘌呤和100 μ mol/L的魯米諾，黃嘌呤氧化酶催化次黃嘌呤產生雙氧水，雙氧水催化放大魯米諾的發光，採用三電極系統，飽和KCl的Ag/AgCl為參比電極，鉬絲為輔助電極，組成雙信號放大電化學發光生物傳感器。ECL測試米用循環伏安法,掃速為IOOmVs-1,掃描範圍為O?0.6V。
[0042]上述步驟製備的雙信號放大電化學發光生物傳感器可用於蛋白激酶活性分析檢測。
[0043]下面結合附圖對上述傳感器的構建機理、納米信標的表徵以及電化學表徵等進行相關說明。
[0044]1、傳感器構建的機理
[0045]圖1是雙信號放大電化學生物傳感器的構建及其在蛋白激酶活性檢測的應用的示意圖。首先通過Au-S鍵作用將半胱氨酸功能化的肯普肽直接固定到金電極表面形成一層緻密的組裝層，巰基己烷被用來封閉電極表面的空白位點，以消除非特異性結合。在以ATP為共反應劑PKA催化磷酸化反應之後，分別用Zr4+和已製備的納米信標處理該電極。通過Zr4+與磷酸根的配位作用將納米信標組裝於磷酸化的肯普肽修飾的電極上。因為AuNPs可催化放大魯米諾(Luminol)的ECL信號，並且納米粒子大的比表面積和良好的生物相容性又可作為好的載體負載豐富的酶，酶催化反應產生雙氧水，而雙氧水又可催化魯米諾Luminol產生ECL信號。所以，與未組裝納米信標的電極相比，組裝了納米信標之後的ECL信號會顯著提高。
[0046]2、納米信標的表徵
[0047]上述步驟合成的AuNPs直徑大約有18nm左右。而且，在合成納米信標的過程中，逐滴加入lmol/L的NaCl的過程中，溶液的顏色基本不變，也可說明合成了穩定的納米信標。
[0048]為了進一步驗證納米信標的合成，利用H2O2在辣根過氧化氫酶(HRP)存在下可使2，2-聯氮基-雙- (3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)氧化生成綠色的自由基的機理，通過XOD催化產生H2O2,用比色和Uv-vis光譜來表徵XOD及DNA是否修飾到AuNPs上。如圖2在HRP和H2O2同時存在下ABTS有明顯的藍綠色，並且分別在645nm、734nm和815nm處出現很強的特徵吸收峰(e)。當只有XOD加入HRP和ABTS的混合液中時(a)，溶液顏色沒有變化仍為無色。當AuNPs和酶的底物次嘌呤同時加入HRP和ABTS的混合液中時(b)，溶液由無色變成微紅，並只在520nm處出現AuNPs的特徵峰，但是仍舊沒有使ABTS變色及特徵峰的出現。而在HRP和ABTS的混合液中同時加入納米信標和酶的底物(C)，或是同時加入酶和酶的底物(d)，都能使溶液顏色變成藍綠色，且出現相應的特徵峰。說明該納米信標上負載了酶，驗證了納米信標的合成。
[0049]3、電化學表徵
[0050]生物傳感器的組裝過程可以通過電極界面修飾層對電子傳遞的阻礙或促進作用來表徵。圖3是用[Fe(CN)6]3_/4_#為電活性探針，用EIS來表徵傳感電極的組裝過程。圖3a為裸金電極的電極的電化學阻抗曲線圖，半圓形的直徑非常的小，說明了金電極的電子傳遞能力很強。隨著肯普肽和封閉劑修飾到電極上之後(3b)，半弧形逐漸變大，這是因為肯普肽和封閉劑屬於惰性物質，在某種程度上阻礙了電子的傳遞。隨著磷酸化過程的發生(3c)，由於帶負電的磷酸根的引入，對帶負電的電活性探針存在一定的排斥作用。納米信標結合到電極上後(3d)，半圓圈直徑繼續變大，這是因為DNA、酶和金納米粒子均帶負電，排斥電子的傳遞。
[0051]4、生物傳感器的電化學響應
[0052]圖4是在0.lmol/L PBS (pH7.8)緩衝液中包含有5mmol/L的次黃嘌呤和100 μ mol/L魯米諾。傳感電極在進行磷酸化反應之後，經過鋯離子的作用，與納米信標溫育前(a)和溫育之後(b)的信號對比，可以看出，兩者雖然都有ECL信號，但是前者的響應非常的小，主要是溶液的背景響應。曲線b的響應顯著增強，說明納米信標的引入，可以極大地放大ECL信號。由此可以看出，蛋白激酶的活性越高，結合到電極表面的納米信標就越豐富，進而對魯米諾的電催化活性越大，ECL響應信號越強。
[0053]5、檢測限與線性範圍
[0054]利用此傳感器檢測了不同濃度的PKA的活性。從圖5中可知，隨著PKA濃度的增加，ECL信號不斷增加最後達到穩定。而在PKA不存在的條件下，ECL信號響應較弱，這主要是由納米信標非特異性吸附引起的。該ECL的傳感器的檢測限達到0.0095U/mL。這樣的結果還比之前報導的一些電化學方法和螢光方法要低一到兩個數量級。內插圖顯示了 ECL的強度和PKA的濃度之間的線性關係。線性範圍是0.01-50U/mL，相關係數，R = 0.997 (η =
3)。該ECL傳感器高的靈敏度和寬的線性範圍主要歸功於以下方面的原因。第一，ECL結合了電化學和化學發光兩者的優勢，具有產生高靈敏度的強大潛質。第二，AuNPs負載酶製備納米信標極大的催化放大了 ECL信號(酶催化產生的雙氧水可催化Luminol的發光，金納米粒子在偏鹼性條件下也可很好的放大Luminol的發光信號)，因此可提高檢測靈敏性。第三，該酶的催化活性在PH為8左右時最大，也正好符合Luminol在鹼性條件下發強光的優勢。
[0055]6、實際樣品的檢測
[0056]用該生物傳感器檢測實際樣品胎牛血清中不同濃度PKA的活性。胎牛血清(0.1mL)和50mmol/L pH = 7.4TBS緩衝液以1:10的比例配置，取45 μ L胎牛血清的TBS緩衝液，加入5 μ L不同濃度的蛋白激酶得到蛋白激酶的最終濃度分別為lU/mL、10U/mL和50U/mL(50yL)，檢測其活性。每一個樣品平行測定三次，取平均值，結果如下表1。
[0057]表1
【權利要求】
1.一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)納米信標的製備 將金納米粒子與黃嘌呤氧化酶溶液混合反應，然後加入TCEP處理過的DNA，繼續反應可得納米信標； (2)磷酸化的肯普肽修飾電極的製備 先將金電極進行預處理，然後將處理好的金電極浸泡至含有肯普肽的磷酸緩衝溶液中反應，反應完成後衝洗乾燥；再用巰基已烷封閉空白位點，然後放置於含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS緩衝液中，反應得到磷酸化的肯普肽修飾電極； (3)雙信號放大電化學發光生物電極的製備 將步驟⑵得到的磷酸化的肯普肽修飾電極清洗乾淨，隨後將該電極置於50 μ L0.5mmol/L鋯離子溶液中處理lh，得到鋯離子修飾的電極，再置於30 μ L步驟(1)製備的納米信標中，控制作用時間為lO-lOOmin，通過鋯離子與磷酸根的配位作用將納米信標組裝於磷酸化的肯普肽修飾電極上，得到雙信號放大電化學發光生物電極； (4)雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備 將步驟(3)得到的雙信號放大電化學發光生物電極作為工作電極，和參比電極、輔助電極正確連接在電化學工作站上以組成雙信號放大電化學發光生物傳感器。
2.根據權利要求1所述的一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，其特徵在於，步驟(1)中，所述金納米粒子採用如下步驟製得:將IOOmL濃度為0.01% g/ml的HAuCl4水溶液加熱至回流，然後加入2.5mL濃度為I % g/ml的檸檬酸鈉水溶液，在保持溶液沸騰條件下反應15min，溶液由無色逐漸變成酒紅色為止，製得金納米粒子，將製備的金納米粒子置於冰箱中保存，備用。
3.根據權利要求1所述的一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，其特徵在於，步驟⑴中:所述黃嘌呤氧化酶溶液的濃度為lmg/ml，按ImL金納米粒子與20 μ L的黃嘌呤氧化酶溶液的比例混合，反應時間為2h ;所述TCEP處理過的DNA的加入量為12 μ L，添加後於室溫反應40min後，再在4°C過夜反應即可得金納米粒子混合液，然後向金納米粒子混合液中逐滴加入100μ Llmol/L NaCl後，溶液顏色沒有明顯變化，離心分離多餘的DNA和黃嘌呤氧化酶，最終得到納米信標。
4.根據權利要求1所述的一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述金電極的預處理步驟如下:先將金電極分別用0.3和0.05μπι的C1-Al2O3粉末在麂皮上拋光打磨，然後依次在乙醇和去離子水中超聲清洗，再在0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電化學清洗和活化。
5.根據權利要求1所述的一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，其特徵在於，步驟(2)中:所述含有肯普肽的磷酸緩衝溶液的pH值為7.4，緩衝溶液中磷酸的含量為0.05mol/L，肯普肽的含量為500ymol/L ;將處理好的金電極浸泡至含有肯普肽的磷酸緩衝溶液中，反應溫度為室溫，反應時間為12h ;所述巰基乙烷的濃度為lmmol/L ;所述含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS緩衝液的pH值為7.4，緩衝溶液中三羥甲基氨基甲烷的含量為50mmol/L，蛋白激酶的含量為0_100U/mL，腺嘌呤核苷三磷酸的含量為IOOymol/L,電極置於含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS緩衝液中，反應溫度為37°C，反應時間為Ih0
6.根據權利要求1所述的一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，其特徵在於，步驟(3)中:鋯離子的濃度為0.5mmol/L，納米信標的用量為30 μ L。
7.根據權利要求1所述的一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，其特徵在於，步驟(3)中:所述作用時間為60min。
8.根據權利要求1所述的一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，其特徵在於，步驟(4)中:將雙信號放大電化學發光生物電極置於磷酸緩衝溶液中，磷酸緩衝溶液中磷酸的濃度為0.lmol/L, pH值為6.5-9.0,緩衝液中包含有5mmol/L的次黃嘌呤和100 μ mo I/L的魯米諾，採用三電極系統，飽和KCl的Ag/AgCl為參比電極，鉬絲為輔助電極。
9.根據權利要求8所述的一種雙信號放大電化學發光生物傳感器的製備方法，其特徵於，所述磷酸緩衝溶液的PH值為7.8。
10.如權利要求1-9任一權利要求所製得的雙信號放大電化學發光生物傳感器應用於蛋白激酶的活 性檢測。
【文檔編號】G01N27/327GK103940808SQ201410181452
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月30日 優先權日:2014年4月30日
【發明者】趙凱, 張菲菲, 夏建飛, 王宗花, 孫娜, 遲德玲, 夏臨華, 李延輝, 夏延致 申請人:青島大學