免疫球蛋白結合結構域與螢光蛋白融合蛋白質及其應用的製作方法
2023-11-01 08:48:27
專利名稱：免疫球蛋白結合結構域與螢光蛋白融合蛋白質及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域。
背景技術：
應用抗體進行免疫學檢測是目前生物學、醫學研究以及臨床檢測和診斷廣為使用的常規方法。目前，常規的免疫學檢測都是先用抗體識別抗原，然後再用第二級抗體(二抗)，即針對前一個抗體(一抗)的抗體進行反應。通常，在二抗上用化學的方法偶聯了能夠通過化學反應顯色或者發光的蛋白質(如辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酯酶)，或者偶聯了可以產生螢光的化合物(如FITC)，然後通過檢測圖象或者光密度改變達到檢測的目的。其中，使用的二抗抗體，主要從動物中製備得到，而且針對不同來源的一抗，必須使用專門製備的、針對不同動物來源一抗抗體的二抗。獲得的二抗必需進行分離純化，然後再進行化學偶聯，交聯上能夠發光或者能夠通過化學反應發光、顯色的化合物或者蛋白質。這種傳統的方法不僅耗費時間長，成本也比較高，而且，越來越多的動物保護主義者對此提出反對。
Z結構域由58個胺基酸組成，是一個根據金黃色葡萄球菌蛋白A的B結構域人工合成的一個IgG抗體Fc片段結合蛋白。它缺失了天冬氨酸-甘氨酸二肽序列以及蛋氨酸殘基，因此與天然金黃色葡萄球菌蛋白A相比，它可以抵抗羥胺和溴化氰的處理(Nilsson B等，Protein Eng.1107-113，1987)。含有兩個Z結構域的ZZ蛋白目前已經發展成了一種較常用的融合蛋自表達系統。ZZ蛋白能夠保護目的蛋白在大腸桿菌細胞質中不被降解( FJM等J.Biotechnology 10931-43，2004)，並且利用ZZ的IgG結合特性可以通過一步IgG-瓊脂糖親和層析法很容易純化融合蛋白。
發明內容
本發明的目的是建立一種由金黃色葡萄球菌蛋白A衍生的ZZ和螢光蛋白組成的蛋白質，該融合蛋白質可以通過重組DNA技術方便、簡易、廉價地大量生產獲得；該融合蛋白質製備操作非常簡單、不需要進行化學偶聯，需要的時間短，消耗的成本低；並且該融合蛋白質很容易進行檢測，不需要加入任何其它的輔助因子或者試劑。該融合蛋白質可以用於免疫檢測，例如用於檢測各種動物來源的免疫球蛋白、酶聯免疫反應(ELISA)、免疫印跡分析、免疫螢光顯微鏡分析、流式細胞分析、免疫晶片分析等，因此具有廣泛的生物學、醫學研究以及臨床檢測和診斷應用前景。
本發明的目的可以通過以下措施來達到由於重組DNA技術目前已經是一個相當成熟的技術，能夠構建任何已知序列的基因、將其進行克隆在常用的表達質粒中，在目前常用的基因工程表達體系中進行表達和分離純化。因此，本發明可以通過目前已經極為成熟的、常規的重組DNA技術，人工合成、或者經PCR獲得ZZ基因和螢光蛋白基因，將這兩個基因克隆在常用的表達質粒中，構成融合蛋白基因，然後在常用的基因工程表達體系中(例如細菌、酵母、昆蟲細胞、昆蟲、哺乳動物細胞等)進行基因工程重組表達，經過分離純化獲得ZZ-螢光蛋白融合蛋白質。ZZ-螢光蛋白融合蛋白質的分離純化可以利用ZZ能夠和免疫球蛋白IgG結合的性質、利用IgG親和介質進行純化；也可以在基因克隆時，在融合蛋白質的一端或者兩端加上目前常用的親和純化標籤(例如大腸桿菌硫氧還蛋白、穀胱甘肽-S-轉移酶、大腸桿菌麥芽糖結合蛋白、組氨酸短肽標籤、或者Flag標籤等)進行分離純化。該融合蛋白質可以直接應用於檢測各種動物來源的免疫球蛋白IgG、用於酶聯免疫反應(ELISA)、免疫印跡分析、免疫螢光顯微鏡分析、流式細胞分析、免疫晶片檢測等。
由免疫球蛋白結合結構域ZZ與螢光蛋白構成的融合蛋白質的構成如下a.ZZ-螢光蛋白b.螢光蛋白-ZZc.A-ZZ-螢光蛋白d.A-ZZ-螢光蛋白-ZZe.ZZ-螢光蛋白-Bf.螢光蛋白-ZZ-Bg.A-ZZ-螢光蛋白-Bh.A-螢光蛋白-ZZ-B
其中A肽、B肽分別為目前常用的融合蛋白或短肽標籤，如大腸桿菌硫氧還蛋白、穀胱甘肽-S-轉移酶、大腸桿菌麥芽糖結合蛋白、組氨酸短肽標籤、Flag標籤等。螢光蛋白是指能夠產生螢光的蛋白質，如綠色螢光蛋白(EGFP)、紅色螢光蛋白(DsRed-Express)等。
同已有的、天然來源的、經過化學修飾的檢測用抗體相比，本發明的特色和創新之處在於(1)與傳統的、在動物來源的天然抗體上偶聯發光基團或者通過化學反應顯色或者發光的蛋白質(如辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酯酶)的方法相比，該ZZ-螢光蛋白融合蛋白質生產過程簡便、成本低、易於大量生產，而且一個蛋白質就能夠識別不同動物來源的抗體，勿需製備針對不同動物來源的一抗的抗體，也勿須加入任何其它的輔助因子或者試劑進行反應而產生顯色，能夠直接利用螢光分光光度計、X-光片、螢光顯微鏡或流式細胞儀或者免疫晶片進行檢測。
(2)本發明建立了利用重組DNA技術生產ZZ-螢光蛋白融合蛋白質的生產及純化方法。
以上所用方法都是分子生物學中最常用的、成熟的分離純化方法，方法簡便、價廉，具有很好的適用性，推廣方便，適於生產。。
四
圖1 ZZ-EGFP和ZZ-DsRed的表達和純化aZZ-EGFP表達菌的非誘導對照(1)，IPTG誘導表達(2)，表達菌超聲破碎上清(3)，超聲沉澱(4)，Ni親和層析穿過峰(5)，純化的ZZ-EGFP(6)；bZZ-DsRed表達菌的非誘導對照(1)，IPTG誘導表達(2)，表達菌超聲破碎上清(3)，超聲沉澱(4)，Ni親和層析穿過峰(5)，純化的ZZ-DsRed(6)。
圖2 用HRP標記驢二抗IgG檢測ZZ-EGFP和ZZ-DsRed與抗體的結合能力a.酶聯免疫吸附分析(ELISA)；b.免疫印跡分析(Western Blot)。
圖3 在斑點雜交法中用ZZ-EGFP和ZZ-DsRed檢測兩種抗體1，3兔抗GST抗體；2，4鼠抗TNFα抗體。
圖4 ZZ-EGFP，ZZ-DsRed和常規HRP/ECL法在檢測兩種蛋白中的比較
a純化的TNFα蛋白；b純化的GST蛋白。
圖5 ZZ-EGFP和ZZ-DsRed在免疫螢光顯微鏡分析中的應用a用ZZ-EGFP作為二抗檢測293T細胞中帶有Flag標記的IRF3蛋白；b用ZZ-DsRed作為二抗檢測HeLa細胞中帶有Flag標記的IRF3蛋白。
兩種蛋白的標記效果與商品化FITC標記二抗相同。
圖6 在流式細胞分析技術中用ZZ-EGFP檢測293T細胞表面整合素β3亞基a用商品化FITC標記的二抗進行流式細胞檢測分析；b用ZZ-EGFP作為二抗進行流式細胞檢測分析。
五具體實施例方式實施例1ZZ蛋白和綠色螢光蛋白(EGFP)的融合及其在免疫分析中的應用1.ZZ基因的克隆和表達質粒pET28a-ZZ的構建根據ZZ基因的序列、化學合成ZZ-5』(5』CATGAATTCGCGCAACACGATGAAGCC 3』)和ZZ-3』(5』CCCAAGCTTCTACCGAGCTCGAATTCGC 3』)兩條引物，用ZZ-5』和ZZ-3』兩條引物從pEZZ318質粒(安瑪西亞公司)中PCR擴增得到ZZ基因編碼序列，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳回收後用於酶切和連接。PCR條件為94℃ 5分鐘；94℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，共30個循環；72℃ 10分鐘；4℃保存。
回收的ZZ PCR產物進行EcoR I和Hind III雙酶切，質粒pET28a(Novagen)也進行EcoR I和Hind III雙酶切。酶切並且經過回收純化的ZZ片段和pET28a質粒片段，使用T4 DNA連接酶進行連接，連接產物轉化大腸桿菌Top10菌株感受態細胞，用限制性內切酶酶切及PCR法篩選陽性克隆，得到重組質粒pET28-ZZ，並經過DNA序列測序分析，測序引物為常規T7終止子引物。在pET28a-ZZ質粒中，在ZZ結構域的N端插入了6個組氨酸，該6個組氨酸原來就存在於pET28a質粒中。
2.ZZ-EGFP基因的克隆及其表達載體的構建通過Sal I和EcoR I雙酶切從pEGFP(Clontech)中得到EGFP的編碼序列，用T4 DNA聚合酶補平之後、將其插入到依次經過Xho I酶切、鹼性磷酸酶處理的、以及T4 DNA聚合酶補平的pET28a-ZZ中。連接產物轉化到Top10感受態細胞之後，用針對EGFP編碼序列的引物通過PCR篩選陽性克隆，並通過BamHI限制性酶切的方法檢驗EGFP基因插入的方向。DNA測序驗證編碼序列以及閱讀框的正確性。
3.ZZ-EGFP在大腸桿菌中的表達和純化將pZZ-EGFP表達質粒轉化表達菌株BL21(DE3)，生長於含有卡那黴素的LB瓊脂平板上，37℃生長16小時之後，將平板上所有克隆刮下接種於2升含有50μg/ml卡那黴素的LB液體培養基。劇烈振蕩培養2-3個小時直到培養液的OD600達到0.8，用1mM IPTG誘導目的蛋白的表達。4個小時之後，5000轉/分鐘，離心5分鐘收集菌體，用冷的磷酸鹽溶液洗滌沉澱並將其重新懸浮於40ml的結合緩衝液中(50mM磷酸鈉，pH7.8，300mM氯化鈉，40mM咪唑)。在冰浴保護下用超聲波破碎菌體。在4℃，13000轉/分鐘，離心15分鐘之後將超聲破碎的細胞上清加載到一個2ml Ni-瓊脂糖凝膠親和層析柱上，上樣前用結合緩衝液預平衡層析柱。用洗脫緩衝液(50mM磷酸鈉，pH7.8，300mM氯化鈉，250mM咪唑)洗脫ZZ-EGFP蛋白，將其對磷酸鹽溶液透析後，採用Bradford法進行蛋白質定量分析。
4.酶聯免疫吸附分析(ELISA)將100μl連續梯度稀釋的ZZ-EGFP包被於96孔酶標板，置4℃過夜。用PBST洗滌4次，每次振蕩洗滌15分鐘。用5％脫脂牛奶於室溫包被1小時之後用PBST洗滌4次。然後用100μl 1∶4000稀釋的HRP標記的驢抗羊IgG抗體(Santa Cruz)在室溫孵育1小時。PBST洗滌4次之後用TMB底物系統對HRP顯色10分鐘，終止反應後，以620nm為參照讀取450nm的光吸收值。
5.Western Blotting分析ZZ-EGFP連續梯度稀釋的ZZ-EGFP在通過SDS-PAGE分離之後轉移到PVDF膜上，5％脫脂奶粉包被1小時後，用1∶2000稀釋的HRP標記驢抗羊IgG抗體(SantaCruz)與膜一起溫育1小時。經PBST洗滌4次之後、用ECL系統(Cell Signaling)對HRP進行顯色，並對X光片曝光。
6.用ZZ-EGFP進行點雜交檢測根據文獻報導的方法(Oprandy J.J.等，Am.J.Trop.Med.Hyg.，38181-186，1988)進行點雜交免疫分析。將2μl連續梯度稀釋的GST，TNFα以及兩種不同的抗體，即兔多克隆抗GST IgG(Oncogene)、鼠多克隆抗TNFα IgG(Santa Cruz)點樣於甲醇處理的PVDF膜上。GST和TNFα各點樣兩張膜，點樣時PVDF膜保持溼潤並置於一層用緩衝液預溼的濾紙上，下面依次是一層幹濾紙，6層吸水紙，點樣過程中最下層吸水紙務必保持乾燥狀態。點樣後用5％脫脂奶粉包被PVDF膜1小時，PBST洗膜4次。對於GST和TNFα，分別用1∶500稀釋的兔多克隆抗GST抗體和鼠多克隆抗TNFα抗體與膜一起溫育1小時，PBST洗滌4次之後一份用1∶200稀釋的ZZ-EGFP溫育1小時，另一份分別用1∶2000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG抗體和羊抗鼠IgG抗體溫育1小時，PBST洗滌4次。對於2種不同的抗體，在5％脫脂牛奶包被之後直接用1∶200稀釋的ZZ-EGFP與膜溫育1小時，PBST洗滌4次。ZZ-EGFP使用Typhoon 9410(安瑪西亞)進行檢測，激發波長488nm，檢測波長520nm。HRP用ECL系統進行發光(Cell Signaling)並對X光片曝光。
7.ZZ-EGFP用於細胞免疫組化分析293T細胞培養於含10％胎牛血清(Hyclone)，青黴素和鏈黴素的DMEM培養基中(Invitrogen)。接種於玻璃載玻片培養室培養24小時之後，通過標準磷酸鈣轉染的方法用pRK5-Flag-IRF3轉染細胞。轉染48小時之後用4％多聚甲醛固定細胞，於0.2％Triton X-100中處理5分鐘以增加細胞的通透性。細胞在經過3％BSA/TBS包被後，與1∶100稀釋的鼠單克隆抗體anti-Flag抗體(Sigma)共孵育1小時，TBS洗滌4次之後，用1∶500稀釋的ZZ-EGFP或1∶500稀釋的FITC標記兔抗鼠IgG(Sigma)孵育1小時。對照細胞不經過Flag抗體處理而直接用1∶500稀釋的ZZ-EGFP進行孵育。細胞核用DAPI復染。細胞圖像通過CarlZeiss顯微鏡Axioplan 2觀察，用AxioVision3.1軟體獲取及分析。
8.ZZ-EGFP用於流式細胞技術檢測將ZZ-EGFP用於流式細胞分析技術檢測細胞表面的整合素3亞基表達情況。使用儀器為Becton-Dickinson FACScan，以488nm雷射器採集數據，通過軟體CELLQUEST(Becton-Dickinson)分析數據。收穫293T細胞，並用1mL預冷的PBS洗滌、2％BSA/PBS溶液封閉30分鐘之後，用1∶100稀釋的多克隆兔抗人整合素3亞基抗體繼續孵育30分鐘，用PBS洗滌三次之後，將細胞與1∶100稀釋的FITC標記羊抗兔IgG抗體或者1∶100稀釋的ZZ-EGFP繼續孵育30分鐘，用PBS溶液洗滌細胞三次，將細胞重懸於200μl PBS溶液，加入200μl 12％甲醛後，進行流式細胞儀分析。
實施例2ZZ蛋白和紅色螢光蛋白(DsRed-Express)的融合及其在免疫分析中的應用1.ZZ-DsRed基因的克隆及其表達載體的構建通過Sal I和EcoR I雙酶切從pDsRed-Express(Clontech)中得到DsRed-Express的編碼序列，用T4 DNA聚合酶補平之後將其插入到依次經過XhoI酶切、鹼性磷酸酶處理的、以及T4 DNA聚合酶補平的pET28a-ZZ中。連接產物轉化到Top10感受態細胞之後，用針對DsRed-Express編碼序列的引物通過PCR篩選陽性克隆，並通過BamH I限制性酶切的方法檢驗DsRed-Express基因插入的方向。DNA測序驗證編碼序列以及閱讀框的正確性。
2.ZZ-DsRed在大腸桿菌中的表達和純化將pZZ-DsRed表達質粒轉化表達菌株BL21(DE3)，生長於含有卡那黴素的LB瓊脂平板上，37℃生長16小時之後，將平板上所有克隆刮下接種於2升含有50μg/ml卡那黴素的LB液體培養基。劇烈振蕩培養2-3個小時直到培養液的OD600達到0.8，用1mM IPTG誘導目的蛋白的表達。4個小時之後，5000轉/分鐘，離心5分鐘收集菌體，用冷的磷酸鹽溶液洗滌沉澱並將其重新懸浮於40ml的結合緩衝液中(50mM磷酸鈉，pH7.8，300mM氯化鈉，40mM咪唑)。在冰浴保護下用超聲波破碎菌體。在4℃，13000轉/分鐘，離心15分鐘之後將超聲破碎的細胞上清加載到一個2ml Ni-瓊脂糖凝膠親和層析柱上，上樣前用結合緩衝液預平衡層析柱。用洗脫緩衝液(50mM磷酸鈉，pH7.8，300mM氯化鈉，250mM咪唑)洗脫ZZ-DsRed蛋白，將其對磷酸鹽溶液透析後，採用Bradford法進行蛋白質定量分析。
3.酶聯免疫吸附分析(ELISA)將100μl連續梯度稀釋的ZZ-DsRed包被於96孔酶標板，置4℃過夜。用PBST洗滌4次，每次振蕩洗滌15分鐘。用5％脫脂牛奶於室溫包被1小時之後用PBST洗滌4次。然後用100μl 1∶4000稀釋的HRP標記的驢抗羊IgG抗體(Santa Cruz)在室溫孵育1小時。PBST洗滌4次之後用TMB底物系統對HRP顯色10分鐘，終止反應後，以620nm為參照讀取450nm的光吸收值。
4.Western Blotting分析ZZ-DsRed連續梯度稀釋的ZZ-DsRed在通過SDS-PAGE分離之後轉移到PVDF膜上，5％脫脂奶粉包被1小時後，用1∶2000稀釋的HRP標記驢抗羊IgG抗體(SantaCruz)與膜一起溫育1小時。經PBST洗滌4次之後、用ECL系統(Cell Signaling)對HRP進行顯色，並對X光片曝光。
5.用ZZ-DsRed進行點雜交檢測根據文獻報導的方法(Oprandy J.J.等，Am.J.Trop.Med.Hyg.，38181-186，1988)進行點雜交免疫分析。將2μl連續梯度稀釋的GST，TNFα以及兩種不同的抗體，即兔多克隆抗GST IgG(Oncogene)、鼠多克隆抗TNFα IgG(SantaCruz)點樣於甲醇處理的PVDF膜上。GST和TNFα各點樣兩張膜，點樣時PVDF膜保持溼潤並置於一層用緩衝液預溼的濾紙上，下面依次是一層幹濾紙，6層吸水紙，點樣過程中最下層吸水紙務必保持乾燥狀態。點樣後用5％脫脂奶粉包被PVDF膜1小時，PBST洗膜4次。對於GST和TNFα，分別用1∶500稀釋的兔多克隆抗GST抗體和鼠多克隆抗TNFα抗體與膜一起溫育1小時，PBST洗滌4次之後，一份用1∶200稀釋的ZZ-DsRed溫育1小時，另一份分別用1∶2000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG抗體和羊抗鼠IgG抗體溫育1小時，PBST洗滌4次。對於點樣的2種不同的抗體，在5％脫脂牛奶包被之後直接用1∶200稀釋的ZZ-DsRed與膜溫育1小時，PBST洗滌4次。ZZ-DsRed使用Typhoon 9410(安瑪西亞公司)進行檢測，激發波長488nm，檢測波長520nm。HRP用ECL系統進行發光(Cell Signaling)並對X光片曝光。
6.ZZ-DsRed用於細胞免疫組化分析293T細胞培養於含10％胎牛血清(Hyclone)，青黴素和鏈黴素的DMEM培養基中(Invitrogen)。接種於玻璃載玻片培養室培養24小時之後通過標準磷酸鈣轉染的方法用pRK5-Flag-IRF3轉染細胞。轉染48小時之後用4％多聚甲醛固定細胞，於0.2％Triton X-100中處理5分鐘以增加細胞的通透性。細胞在經過3％BSA/TBS包被後，與1∶100稀釋的鼠單克隆抗體anti-Flag抗體(Sigma)共孵育1小時，TBS洗滌4次之後，用1∶500稀釋的ZZ-DsRed或1∶500稀釋的FITC標記兔抗鼠IgG(Sigma)孵育1小時。對照細胞不經過Flag抗體處理而直接用1∶500稀釋的ZZ-DsRed進行孵育。細胞核用DAPI復染。細胞圖像通過Carl Zeiss顯微鏡Axioplan 2觀察，用AxioVision3.1軟體獲取及分析。
在實施例1中，我們成功構建了質粒pZZ-EGFP，並在大腸桿菌中表達了螢光融合蛋白ZZ-EGFP。為了簡化並提高融合蛋白的純化效率，利用pET28a載體本身的特點、在ZZ-EGFP的N端引入了含有6個組氨酸的表達標籤，這樣ZZ-EGFP可以很容易通過一步Ni2+螯合親和層析進行純化。融合蛋白的表達受T7啟動子控制並受IPTG誘導調控。含有表達質粒pZZ-EGFP的BL21(DE3)在經過1mMIPTG誘導4個小時之後，菌體呈現鮮豔的綠色。根據SDS-PAGE分析，如圖1a所示，在IPTG的誘導下，ZZ-EGFP得到成功表達，其表觀分子量為42.7kDa，ZZ-EGFP大約佔細胞總蛋白的29％，並且細胞在經過超聲波破碎之後，大部分的ZZ-EGFP保持可溶性狀態。在40mM咪唑存在下融合蛋白能夠較好的結合於Ni-瓊脂糖層析柱，並能被250mM咪唑完全洗脫下來。從1升LB培養基中，我們純化得到了35mg ZZ-EGFP，純度約為83％。根據分析，融合蛋白的螢光特性與EGFP相近，最大激發波長為490nm，最大發射波長為512nm。
為了檢驗融合蛋白的抗體結合活性，我們首先觀察了ZZ-EGFP在IgG-瓊脂糖親和介質(安瑪西亞公司)上的結合行為。將300μg純化的ZZ-EGFP與50μl IgG親和介質共同溫育之後，幾乎所有的綠色ZZ-EGFP都結合到介質上。這表明，在將其融合到EGFP之後，ZZ結構域仍然保留了結合IgG的活性，同時也說明可以利用IgG親和層析對ZZ-EGFP進行純化。隨後我們通過ELISA的方法進一步觀察了ZZ-EGFP對IgG的結合行為。將連續梯度稀釋的ZZ-EGFP吸附於96孔酶標板，用HRP標記的抗IgG抗體進行檢測。如圖2a所示，用HRP標記的驢抗羊IgG可以檢測到少至4ng/ml的ZZ-EGFP。並且作為陰性對照，多達66000ng/ml的大腸桿菌總蛋白沒有給出檢測信號。結果表明，ZZ-EGFP能夠特異性地結合IgG抗體，在進一步用Western blotting分析時，我們得到了類似的結果，經過系列梯度稀釋的ZZ-EGFP經過SDS-PAGE電泳並轉移到PVDF膜上之後也可以被HRP標記的抗IgG抗體檢測到，如圖2b所示。對於驢抗羊IgG抗體，其檢測ZZ-EGFP的極限為60ng。
設計ZZ-EGFP融合蛋白的目的是要將其應用於基於螢光的免疫分析，為了驗證ZZ-EGFP融合蛋白既可以與抗體結合、又能夠比較容易地進行檢測，我們進行了點雜交免疫分析。兩種不同的抗體，鼠多克隆抗TNFαIgG，兔多克隆抗GST IgG在經過系列梯度稀釋之後點樣於甲醇處理的PVDF膜上，並直接用ZZEGFP進行檢測。如圖3所示，鼠多克隆抗TNFαIgG顯示了較強的結合活性，少至0.4ng的該抗體就可以被ZZ-EGFP檢測到。其次是兔多克隆抗GST IgG。這表明，作為一個具有雙功能的分子ZZ-EGFP不僅能夠和IgG專一性結合，並且還能夠很容易地進行檢測，不需要加入任何其它的輔助因子或者試劑。因此ZZ-EGFP顯示了較好的在免疫分析中應用的潛力。
為了驗證ZZ-EGFP在Western blotting中的應用，我們使用了在大腸桿菌中表達並純化的GST和TNFα蛋白，在經過系列梯度稀釋之後點樣於PVDF膜上，各兩份，分別用兔抗GST抗體和鼠抗TNFα抗體進行孵育，然後一份用ZZ-EGFP處理，另一份分別用HRP標記的羊抗兔IgG抗體和羊抗鼠IgG抗體溫育。如圖4所示，使用ZZ-EGFP能夠檢測到少至9.4ng的TNFα和125ng的GST蛋白。這表明，鼠抗TNFαIgG，ZZ-EGFP擁有和傳統HRP標記二抗相當的檢測效果。
ZZ-EGFP潛在的最大的應用領域是免疫螢光顯微鏡分析。為了觀察其應用的可行性，我們用pRK5-Flag-IRF3轉化293T細胞。該質粒編碼一種帶有Flag標籤的幹擾素調控因子(IRF3)，該蛋白組成型表達於各種組織和細胞中，在沒有被病毒感染時IRF3蛋白主要停留在細胞質中，一旦發生病毒感染並誘導產生C末端Ser的磷酸化，IRF3將會轉運到細胞核中並與其它一些蛋白質形成複合物，結合到IFNα和IFNβ基因的啟動子上。細胞在經過抗Flag抗體孵育之後用ZZ-EGFP檢測，陰性對照為不經過Flag抗體處理而直接用ZZ-EGFP孵育的細胞，陽性對照為用FITC標記的抗IgG抗體代替ZZ-EGFP。如圖5所示，根據ZZ-EGFP顯示的結果，IRF3蛋白在細胞中定位於細胞質。這和陽性對照的結果一致。並且，未經Flag抗體溫育的陰性對照在經過ZZ-EGFP溫育後沒有顯示出非特異性的背景信號。這表明，ZZ-EGFP在應用於免疫螢光顯微鏡分析時，能夠特異性的顯示目標蛋白的表達和定位，給出令人滿意的結果。
此外，ZZ-EGFP還可以很好地用於流式細胞分析技術中對細胞進行免疫分析檢測，圖6顯示出ZZ-EGFP能和FITC標記的商業化二抗一樣，有效地用於檢測293T細胞表面整合素β3亞基。
同樣我們在實例2中，也同樣成功構建了質粒pZZ-DsRed，並成功地大腸桿菌中表達了螢光融合蛋白ZZ-DsRed，表達了ZZ-DsRed的菌體呈現鮮亮的紅色。根據SDS-PAGE分析，如圖1b所示，在IPTG的誘導下，ZZ-DsRed的表觀分子量為42.7kDa。IPTG誘導後，ZZ-DsRed大約佔細胞總蛋白的29％，在細胞超聲破碎之後，大部分的ZZ-DsRed保持可溶性狀態。在40mM咪唑存在下融合蛋白能夠較好的結合於Ni-瓊脂糖層析柱，並能被250mM咪唑完全洗脫下來。從1升LB培養基中我們純化得到了35mgZZ-DsRed，純度約為75％。融合蛋白的螢光特性與DsRed-Express相近，最大激發波長為457nm，最大發射波長為586nm。
ZZ結構域融合到DsRed之後，仍然保留了結合IgG的活性。將300μg純化的ZZ-DsRed與50μl IgG親和介質共同溫育之後，幾乎所有的紅色ZZ-DsRed都結合到介質上。ELISA檢測也進一步顯示出ZZ-DsRed對不同IgG的結合行為如圖2a所示，用HRP標記的驢抗羊IgG可以檢測到少至4ng/ml的ZZ-DsRed，作為陰性對照，多達66000ng/ml的大腸桿菌總蛋白沒有給出檢測信號。ZZ-DsRed能夠特異性地結合IgG抗體。進一步的Western blotting分析也表現出了類似的結果，如圖2b所示，驢抗羊IgG抗體能夠檢測到ZZ-DsRed的極限為60ng。
斑點雜交免疫分析結果顯示，如圖3所示，少至0.4ng的鼠多克隆抗TNFαIgG該抗體就可以被ZZ-DsRed檢測到，對於兔多克隆抗GST IgG，ZZ-DsRed檢測到的極限為4ng。ZZ-DsRed不僅能夠和IgG結合，並且還能夠很容易地進行檢測，不需要加入任何其它的輔助因子或者試劑。
圖4顯示，當應用ZZ-DsRed進行Western blotting分析時，ZZ-DsRed能夠檢測到少至2.8ng的TNFα和250ng的GST蛋白；相應地，使用傳統的HRP能夠檢測到的TNF和GST蛋白分別為少於2.8ng和31.25ng。這表明，ZZ-DsRed擁有和傳統HRP標記二抗相當的檢測效果。
與圖5a的結果相似，圖5b顯示ZZ-DsRed在應用於免疫螢光顯微鏡分析時，能夠特異性地顯示目標蛋白的表達和定位，給出令人滿意的結果。
因此我們有理由相信，ZZ-EGFP和ZZ-DsRed可以在免疫分析領域得到廣泛的應用，這將大大降低實驗研究和臨床檢測的成本。
權利要求
1.一種由免疫球蛋白結合結構域與螢光蛋白構成的融合蛋白質，其特徵是在該類融合蛋白質分子中，具有免疫球蛋白結合能力的結構域和能夠產生螢光的螢光蛋白融合，其N端或C端還可以分別融合具有幫助蛋白質純化作用的融合蛋白或短肽標籤、或者N端和C端同時融合有具有幫助蛋白質純化作用的融合蛋白或短肽標籤，其結構組成為a.ZZ-螢光蛋白b.螢光蛋白-ZZc.A-ZZ-螢光蛋白d.A-ZZ-螢光蛋白-ZZe.ZZ-螢光蛋白-Bf.螢光蛋白-ZZ-Bg.A-ZZ-螢光蛋白-Bh.A-螢光蛋白-ZZ-B其中A肽、B肽分別為目前常用的融合蛋白或短肽標籤，如大腸桿菌硫氧還蛋白、穀胱甘肽-S-轉移酶、大腸桿菌麥芽糖結合蛋白、組氨酸短肽標籤、Flag標籤；螢光蛋白是指能夠產生螢光的蛋白質，如綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白。
2.根據權利要求1所述的一種由免疫球蛋白結合結構域與螢光蛋白構成的融合蛋白質的生產方法，其特徵是合成或者克隆融合蛋白質基因、構建融合蛋白質表達質粒，在常見的基因工程表達體系中進行表達。
3.根據權利要求1所述的一種由免疫球蛋白結合結構域與螢光蛋白構成的融合蛋白質的純化方法，其特徵是利用融合蛋白質上融合表達的、常用的融合蛋白或短肽標籤進行親和層析或者利用免疫球蛋白親和層析進行分離純化。
4.根據權利要求1所述的一種由免疫球蛋白結合結構域與螢光蛋白構成的融合蛋白質在諸如酶聯免疫吸附分析、Western Blotting分析、斑點雜交檢測、免疫組化分析、流式細胞分析檢測、免疫晶片檢測中的應用。
5.一種螢光蛋白質，其特徵是由組氨酸標籤His-tag、免疫球蛋白結合結構域ZZ與綠色螢光蛋白構成。
6.根據權利要求5所述的螢光蛋白質的生產方法，其特徵是利用重組DNA技術在大腸桿菌中進行表達生產。
7.根據權利要求5所述的螢光蛋白質的純化方法，其特徵是利用Ni-親和層析或者免疫球蛋白IgG親和層析進行分離純化，獲得重組螢光蛋白質。
8.根據權利要求5所述的螢光蛋白質在各種免疫檢測分析中的應用。
9.一種螢光蛋白質，其特徵是由組氨酸標籤His-tag、免疫球蛋白結合結構域ZZ與紅色螢光蛋白構成。
10.權利要求9所述的螢光蛋白質的生產方法，其特徵是利用重組DNA技術在大腸桿菌中進行表達生產。
11.權利要求9所述的螢光蛋白質的純化方法，其特徵是利用Ni-親和層析或者免疫球蛋白IgG親和層析進行分離純化，獲得重組螢光蛋白質。
12.權利要求9所述的螢光蛋白質在各種免疫檢測分析中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物工程技術領域。本發明提供了一種由免疫球蛋白結合結構域與螢光蛋白構成的融合蛋白質，及其基因工程表達和分離純化方法。利用本發明表達和純化的免疫球蛋白結合結構域與螢光蛋白構成的融合蛋白質可以用來在生物學、醫學等領域進行諸如酶聯免疫吸附分析、Western Blotting分析、斑點雜交檢測、免疫組化分析、流式細胞檢測等各種免疫檢測和分析。本發明還提供了免疫球蛋白結合結構域－綠色螢光蛋白(ZZ－EGF)、免疫球蛋白結合結構域－紅色螢光蛋白(ZZ－DsRed)兩種融合螢光蛋白的實例。
文檔編號G01N33/533GK1807457SQ20051009545
公開日2006年7月26日 申請日期2005年11月17日 優先權日2005年11月17日
發明者華子春, 黃啟來 申請人:南京大學