D‑二聚體檢測試劑盒及其製備方法與流程
2023-12-05 22:55:01 1
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種D-二聚體檢測試劑盒及其製備方法。
背景技術：
纖維蛋白溶解系統是人體最重要的抗凝系統，它對保持血管壁的正常通透性及維持血液的流動狀態和組織修復起著重要作用，該系統主要由4部分組成：纖溶酶原、纖溶酶原激活劑、纖溶酶、纖溶酶抑制物。當纖維蛋白凝結塊形成時，在纖溶酶原激活劑的存在下，纖溶酶原激活轉化為纖溶酶，纖維蛋白開始溶解，纖溶酶降解纖維蛋白原和交聯纖維蛋白形成各種可溶性片段，統稱纖維蛋白原降解產物(FDP)。其中，D-二聚體是降解產物中最小片段，是交聯纖維蛋白的特異性降解產物。
在正常生理狀態下，人體正常D-二聚體的水平小於200μg/L，機體內維持著凝血與纖溶系統的動態平衡，以保證纖維蛋白的及時形成與清除。一旦這種動態平衡被破壞，血管內凝血傾向增強，纖維蛋白增多，纖維蛋白降解產物增加，D-二聚體含量增加。因此，D-二聚體含量的升高反映了體內凝血和纖溶系統的雙重激活，可作為體內高凝狀態和纖溶亢進的敏感標記物(參見《臨床血液學雜誌》，2011年，鄧家棟，臨床血液學[M])，因此D-二聚體的含量變化可以用來檢測具有凝血和纖溶過程的一類疾病，如深靜脈血栓、肺栓塞(PE)、彌散性血管內凝血(DIC)、重症肝炎等疾病的檢測。另外D-二聚體測定法還可作為PE的敏感、快速的初步篩選指標(參見《臨床肺科雜誌》，2011年11卷，陳曉燕；定量測定血漿D-二聚體在肺栓塞診斷中的意義)。
目前臨床常用的D-二聚體檢測方法主要包括：乳膠凝集法、酶聯免疫吸附法(ELISA)、膠乳增強免疫比濁法、免疫金標法等。其中乳膠凝集法操作簡單，快速，適用於急診檢測，但是只能用於定性或半定量的檢測，常作為篩查用；酶聯免疫吸附實驗法精確，定量，敏感性高，但操作要求嚴格，步驟繁瑣，不適用於急診和臨床病人的快速診斷和監測；免疫金標法具有乳膠凝集法的易於操作、快速，又具有ELISA法準確、定量的特點，但類風溼因子、肝素及血脂等對其檢測的結果具有一定的幹擾，不適於大規模推廣使用；膠乳免疫比濁法具有操作簡便、快速、定量準確、特異性強、敏感度高等優點，可滿足門診和急診的需要，在臨床應用中越來越廣泛。但現有的利用膠乳免疫比濁法製備的D-二聚體測定試劑盒大多使用聚乙二醇或葡聚糖作為促凝劑，這也導致了下述缺點，例如在試劑盒靈敏度提高時，就會造成了線性範圍窄、穩定性欠佳等缺點；而進口試劑盒價格昂貴、檢測成本高，不利於該檢測項目在臨床診斷中的推廣應用。
綜上所述，提供一種線性範圍廣、穩定性好、成本低廉的D-二聚體測定試劑盒是目前我們亟需解決的問題。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種D-二聚體檢測試劑盒及其製備方法，使得D-二聚體測定試劑盒線性範圍廣、穩定性好、成本低廉。
為解決上述技術問題，本發明的實施方式提供了一種D-二聚體檢測試劑盒，該試劑盒包含：緩衝液、D-二聚體、促凝劑、穩定劑以及防腐劑，其中，促凝劑為聚乙烯吡絡烷酮。
另外，本實施方式還提供了一種D-二聚體檢測試劑盒的製備方法，該方法包含以下步驟：聚苯乙烯微球的活化：用緩衝液將聚苯乙烯粒子稀釋後，加入N-羥基琥珀醯亞胺溶液，混合均勻、攪拌，在攪拌中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液，繼續攪拌反應30～60min之後離心、超聲洗滌溶解到緩衝液中，即得到聚苯乙烯微球溶液；抗體的偶聯：向聚苯乙烯微球溶液中加入抗體溶液，震蕩反應90～120min；微球的封閉：向震蕩反應過程中的混合液加入牛血清白蛋白；洗滌、溶解：將震蕩反應結束後的混合物經過離心、超聲洗滌後，溶解到緩衝液中，即得D-二聚體檢測試劑盒。
本發明實施方式相對於現有技術而言，通過在D-二聚體檢測試劑盒加入作為促凝劑的聚乙烯吡絡烷酮(PVP)，使得D-二聚體檢測試劑盒不僅可以促進抗原抗體的結合，使其快速形成複合物，又能抑制免疫複合物的解離，使沉澱出現快，提高了檢測的速度；而且還不會因此而擴大非特異性範圍，使得D-二聚體檢測試劑盒保持一個寬的線性範圍。另外，PVP可將D-二聚體單克隆抗體固定在乳膠微粒上，可特異性的增強濁度的變化，從而提高試劑盒的檢測靈敏度。
另外，要求R1和R2試劑中的緩衝液的可調節pH範圍在7.0～9.0之間，優選為以下之一：三羥甲基氨基甲烷緩衝液、磷酸鹽緩衝液，與其他緩衝液相比，這兩種緩衝液具有緩衝能力強、溶解度高、很好的生物想任性和反應惰性，且pH隨溫度和稀釋度的改變而改變很小的優點。
另外，D-二聚體為聚苯乙烯微球包被的D-二聚體。聚苯乙烯微球與D-二聚體的包被是通過化學偶聯完成反應，其結合力要比物理吸附更強，不容易被洗脫，試劑的穩定性更好。
另外，穩定劑為以下之一或其任意組合：離子穩定劑、懸浮穩定劑；防腐劑為以下之一或其任意組合：疊氮鈉、硫柳汞、苯酚、乙基汞硫代硫酸鈉，這些防腐劑防腐效果好，毒性低，為比較常用的防腐劑。
另外，離子穩定劑為以下之一或其組合：氯化鈉、氯化鉀，懸浮穩定劑為聚乙二醇，少量的聚乙二醇既可以起到穩定劑的作用，與離子穩定劑一起作用可以使試劑的穩定性提高。
另外，聚苯乙烯微球的活化步驟中的緩衝液為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩衝液，其中，緩衝液的濃度為25～50mM，pH為5.5～6.5。在此條件下聚苯乙烯微球上的羧基活化程度最大，有利於結合更多的抗體，提高偶聯率，從而增加試劑檢測的靈敏度。
另外，通過實驗探索的結果，最終優選N-羥基琥珀醯亞胺溶液以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液的濃度分別為80～100mg/mL和8～10mg/mL。
另外，聚苯乙烯微球的活化步驟中的聚苯乙烯粒子的粒徑為60～500nm。這一寬的粒徑範圍，有利於在製備過程中，改善試劑的靈敏度和提高線性範圍。
另外，通過實驗探索，在聚苯乙烯微球的活化以及洗滌、溶解步驟中，最佳的離心的速率為18000～20000rpm，離心的時間為1～30min；超聲的時間為1～5min，這樣可以保證抗體可以在粒子很快均勻分散，增加抗體與粒子的偶聯率。
附圖說明
圖1是根據本發明第一實施方式中的校準曲線；
圖2是根據本發明第一實施方式中的靈敏度檢測曲線；
圖3是根據本發明第一實施方式中的相關性檢測曲線。
具體實施方式
為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明的各實施方式進行詳細的闡述。然而，本領域的普通技術人員可以理解，在本發明各實施方式中，為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術細節。但是，即使沒有這些技術細節和基於以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現本申請所要求保護的技術方案。
本發明的第一實施方式涉及一種D-二聚體檢測試劑盒，該試劑盒包含：緩衝液、D-二聚體、促凝劑、穩定劑以及防腐劑，其中，促凝劑為聚乙烯吡絡烷酮(簡稱：PVP)。
值得注意的是，在本實施方式中，緩衝液可以是三羥甲基氨基甲烷緩衝液，緩衝液還可以是磷酸鹽緩衝液；或者緩衝液也可以是上述兩種緩衝液的組合。
值得注意的是，在本實施方式中，D-二聚體可以為聚苯乙烯微球包被的D-二聚體。
進一步地，在本實施方式中，穩定劑可以是離子穩定劑；穩定劑還可以是懸浮穩定劑；或者穩定劑還可以是上述兩種穩定劑的組合，另外，防腐劑可以是疊氮鈉；或者硫柳汞；或者苯酚；或者乙基汞硫代硫酸鈉；或者上述4種防腐劑的組合，本實施方式不應以此為限。
另外，在本實施方式中，離子穩定劑可以是氯化鈉；或者氯化鉀，懸浮穩定劑可以為聚乙二醇。
在實際使用D-二聚體檢測試劑盒過程中，通常將D-二聚體檢測試劑盒分成R1試劑、R2試劑以及校準品，其中，R1試劑成分中含有緩衝液、促凝劑、穩定劑、防腐劑；R2試劑成分中含有緩衝液、包被了抗D-二聚體抗體的聚苯乙烯粒子、防腐劑；校準品含有：纖維蛋白降解產物D-二聚體、緩衝液、穩定劑、防腐劑。
具體地，R1試劑的緩衝液優選HEPES緩衝液，pH在7.0-8.5之間；促凝劑選擇PVP-K90和PVP-K25混合，可以加快免疫反應的速度，縮短檢測時間，終濃度為1.6-5.0％之間；穩定劑可以為Nacl，濃度為0.2-0.5％之間；防腐劑疊氮鈉的濃度可以為0.1％；
R2試劑是由抗人D-二聚體單克隆抗體與羧基化的聚苯乙烯微球在MES緩衝液中通過化學交聯法致敏，之後經過離心，洗滌後，在含有穩定劑和防腐劑的Good’s緩衝液中分散而成。
下面通過實驗檢測本實施方式配置的D-二聚體檢測試劑盒的各項參數：1.D-二聚體檢測試劑盒R1試劑的製備
D-二聚體檢測試劑盒R1試劑的配方如表1：
2.D-二聚體檢測試劑盒R2試劑的配製
D-二聚體檢測試劑盒R2試劑稀釋液的配方如表2：
3.洗滌液配方如表3：
4.羧基化聚苯乙烯微球與抗體的偶聯過程
a.取20mg粒徑為160nm羧基化聚苯乙烯微球，用25mM pH6.0的MES緩衝液通過離心、超聲洗滌1-2次；
b.將沉澱用MES稀釋到10mg/mL混勻之後，加入0.5mL和0.75mL的EDC(10mg/mL)和NHS(100mg/mL)溶液活化聚苯乙烯微球上的羧基，室溫下震蕩反應30min；
c.活化結束之後，離心棄去上清，取2.0mL 25mM pH6.0的MES溶解，並用超聲混合均勻之後，加入18mg/mL的D-二聚體單克隆抗體，室溫震蕩下交聯90min，之後加入0.1％的BSA，室溫震蕩封閉30min；
d.用25mM pH6.0的MES緩衝液洗滌2次；再用50mM pH7.4的MOPSO洗滌一次；
e.加入4.0mL含有50mM pH7.4的HEPES，100mM，0.1％BSA溶液中，2-8℃保存。
5.校準品的配製
a.取適量的纖維蛋白溶解於HEPES緩衝液中，使其濃度為20mg/mL，加入適量的纖溶酶(終濃度為2.0u/mL)，在37℃下攪拌過夜反應，最後離心得到纖維蛋白的降解產物D-二聚體溶液；
b.以積水的D-二聚體校準品為標準，採用其D-二聚體檢測試劑盒進行測試，求出其平均值，得到D-二聚體溶液的初始濃度。
c.將d-二聚體用HEPES緩衝液稀釋幾個不同的濃度，再加入終濃度分別為50mg/mL、20mg/mL、0.9％、0.15％的BSA、甘露醇、氯化鈉、疊氮鈉混合均勻，以每瓶0.5mL分裝進行冷凍乾燥，每次使用時加入0.5mL純化水復溶30min左右。
6.檢測樣本的方法
(1)取出試劑盒中D-二聚體校準品，精準加入0.5mL的純化水復溶，並用生理鹽水配製成9個濃度梯度，分別為1.0mg/mL、5.0mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL；
(2)以東芝7100為例：測定主波長為570nm，副波長800nm；分別取不同濃度的校準品溶液8.0uL，加入d-二聚體稀釋液8.0μL，在37℃下反應30s後加入D-二聚體R1試劑240uL，反應60s後加入D-二聚體R2試劑60uL，在37℃下混合均勻，孵育約20s後讀取第一次吸光度(A1)，在孵育約5min，讀取第二次吸光度(A2)，計算吸光度變化△A＝A2-A1；
(3)6點非線性校準曲線定標法：以空白樣本定值為0.0mg/L，依次對校準品a、b、c、d、e測定相應的△A(A2-A1)值，以△A為Y軸，濃度為X軸；校準曲線y＝18.827x+14.031，相關係數R2＝0.998(見附圖1)。
使用上述反應所得的聚苯乙烯微球-D-二聚體單克隆抗體試劑，使用上述檢測方法進行靈敏度檢測。以5％人血清白蛋白為空白，平均測定15次，計算結果如表4所示，均值為0.6，標準差S為0.23。再以稀釋後的D-二聚體校準品溶液測定，在R1試劑中加入不同濃度的和不同類型的促凝劑。
從表4的結果可以看出，使用PVP和DT處理的R1試劑，與空白相比靈敏度都有了很大的提高，但是在同樣的濃度下，PVP處理過後的效果要比DT的更好，靈敏度提高了很多，這說明作為促凝劑PVP的效果更好。因此再以下實例中都用加入2.5％的PVP-K90/25的R1試劑測試。
將接近線性範圍上限的D-二聚體高值樣本(1000ug/L)，用生理鹽水按照1/640、1/320、1/160、1/80、1/40、1/20、1/10-1稀釋，共配製16個濃度梯度，用實施例1中的測試樣本的方法測試，將測定的平均值與理論濃度進行線性回歸分析最終得出結果為，相關係數R2＝0.9963，線性回歸方程為y＝1.0627x-0.4014(見附圖2)。
將濃度為0.05mg/mL的D-二聚體校準品溶液，分別加入相同體積的各幹擾物質溶液，加入後的濃度分別為游離型膽紅素(450mg/mL)、血紅蛋白(5g/L)、甘油三酯(15mM)、Vc(600mg/mL)、乳糜(福爾馬肼)濁度為(2940)。用本發明提供的試劑盒與市售對照試劑盒分別對每個樣本重複測定3次，求取平均值，與加入相同體積的純化水比較，觀察加入幹擾物質與加入純化水後D-二聚體測定結果的相對誤差。結果如表5所示：
從表中的結果可以看出本發明提供的試劑盒在對加入以上幹擾物與加入同體積純化水後測定值的相對誤差小於3％，即認為在中輕度溶血、黃疸、或乳糜時，本發明提供的試劑盒的檢測結果幾乎不受幹擾；二對照試劑盒的測試結果相對誤差較大，容易受膽紅素、血紅蛋白等物質的影響，不利於疾病的正確診斷。
取正常人血和患者的血液樣本共90份，加入肝素鈉抗凝混合均勻之後，離心獲得血漿。用本發明實施方式中的試劑盒和積水公司生產的D-二聚體檢測試劑盒分別對樣本檢測，分別計算檢測均值，得出兩者的相關係數，並進行線性回歸。最終得出結果為，兩種試劑盒的相關係數R2＝0.9903，線性回歸方程為y＝1.261x+0.026(見附圖3)。由此可見本發明提供的試劑盒在臨床上對於深靜脈血拴、瀰漫性血管內凝血及肺栓塞等疾病的診斷和病程檢測具有同樣的準確率，可在臨床上代替進口試劑盒的使用，減低檢測成本。
不難發現，與現有技術相比，本發明實施方式中的D-二聚體檢測試劑盒具有下述優點：
(1)本發明實施方式中的D-二聚體檢測試劑盒具有較高的檢測靈敏度，最低檢測限可達到0.1μg/mL；操作簡單，快速。
(2)本發明實施方式中的D-二聚體檢測試劑盒特異性強，在一定範圍內不受其他物質的幹擾；
(3)本發明實施方式中的D-二聚體檢測試劑盒線性範圍廣，在(0.5～40)mg/L範圍內線性相關係數r≥0.99，(0.5～10)mg/L範圍內，線性絕對偏差應不超過±1.0mg/L；
(4)本發明實施方式中的D-二聚體檢測試劑盒穩定性好，在2-8℃至少可保存24個月，試劑開瓶後可以保存45天；比現有市售的試劑盒開瓶後保存時間久；
(5)本發明實施方式中的D-二聚體檢測試劑盒與對照試劑相比，其檢測的結果準確可靠，且成本低，可在醫院中推廣使用。
本發明的第二實施方式涉及一種D-二聚體檢測試劑盒的製備方法，該方法包含以下步驟：
聚苯乙烯微球的活化：用緩衝液將聚苯乙烯粒子稀釋後，加入N-羥基琥珀醯亞胺溶液，混合均勻、攪拌，在攪拌中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液，繼續攪拌反應30～60min之後離心、超聲洗滌溶解到緩衝液中，即得到聚苯乙烯微球溶液；
抗體的偶聯：向聚苯乙烯微球溶液中加入抗體溶液，震蕩反應90～120min；
微球的封閉：向震蕩反應過程中的混合液加入牛血清白蛋白；
洗滌、溶解：將震蕩反應結束後的混合物經過離心、超聲洗滌後，溶解到緩衝液中。
進一步地，聚苯乙烯微球的活化步驟中的緩衝液可以為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩衝液，其中，緩衝液的濃度可以為25～50mM，pH為5.5～6.5。
具體地，N-羥基琥珀醯亞胺溶液以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液的濃度分別可以為80～100mg/mL和8～10mg/mL。
值得一提的是，聚苯乙烯微球的活化步驟中的聚苯乙烯粒子的粒徑可以為60～500nm。
另外，在聚苯乙烯微球的活化以及洗滌、溶解步驟中，離心的速率可以為18000～20000rpm，離心的時間可以為1～30min；超聲的時間可以為1～5min。
具體地，本實施方式詳細地反應步驟如下：
(1)聚苯乙烯微球的活化：取0.2mL粒徑為500nm的聚苯乙烯粒子用濃度為25mM，pH為5.5的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩衝液稀釋到質量體積比(即：溶質的質量與溶液的體積之比)為20mg/mL後，再加入200μL、濃度為100mg/mL的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)溶液，混合均勻，然後攪拌中加入80μL、濃度為10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液，室溫下攪拌反應30min之後離心洗滌超聲溶解到緩衝液中。
(2)抗體的偶聯：向第一步活化洗滌過的微球溶液中加入2mg的抗體溶液，在室溫下震蕩反應90min。
(3)微球的封閉：在偶聯完成時向步驟(2)中的混合液中加入6mg的牛血清白蛋白對微球表面沒有偶聯蛋白質的殘留位點進行封閉，室溫震蕩封閉30min。
(4)洗滌、溶解：將反應結束的混合物經過離心、超聲洗滌2-3次，其中，離心的速率可以為20000rpm，離心的時間可以為30min；超聲的時間可以為5min，最後溶解到Good’s緩衝液中，即完成D-二聚體檢測試劑盒的製備。
本發明的第三實施方式涉及一種D-二聚體檢測試劑盒的製備方法，該方法包含以下步驟：
(1)聚苯乙烯微球的活化：取0.2mL粒徑為500nm的聚苯乙烯粒子用濃度為50mM，pH為6.5的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩衝液稀釋到稀釋到質量體積比(即：溶質的質量與溶液的體積之比)為10mg/mL後，再加入200μL、濃度為80mg/mL的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)溶液，混合均勻，然後攪拌中加入80μL、濃度為8mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液，室溫下攪拌反應30min之後離心洗滌超聲溶解到緩衝液中。
(2)抗體的偶聯：向第一步活化洗滌過的微球溶液中加入2mg的抗體溶液，在室溫下震蕩反應90min。
(3)微球的封閉：在偶聯完成時向步驟(2)中的混合液中加入6mg的牛血清白蛋白對微球表面沒有偶聯蛋白質的殘留位點進行封閉，室溫震蕩封閉30min。
(4)洗滌、溶解：將反應結束的混合物經過離心、超聲洗滌2-3次，其中，離心的速率可以為18000rpm，離心的時間可以為1min；超聲的時間可以為1min，最後溶解到Good’s緩衝液中，即完成D-二聚體檢測試劑盒的製備。
本領域的普通技術人員可以理解，上述各實施方式是實現本發明的具體實施例，而在實際應用中，可以在形式上和細節上對其作各種改變，而不偏離本發明的精神和範圍。