一種愛滋病檢測質控血清的配製方法
2023-11-11 12:32:17
專利名稱：一種愛滋病檢測質控血清的配製方法
技術領域：
本發明屬於醫學檢驗領域。具體涉及一種愛滋病檢測質控血清的配製方法。
背景技術：
愛滋病是嚴重危害人類健康的超級瘟疫，它是由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的。 目前愛滋病的檢測使用最廣泛的方法是酶聯免疫吸附實驗(ELISA)。但是，ELISA法在實際 中受很多因素影響，易導致檢測結果出現偏差，為了提高每次實驗的準確性，在HIV檢測 過程中需要設立質控對照，通過對質控血清的檢測值的變化進行監測，從而判斷每次實驗 的可靠性和重複性。因此，質控血清的質量和準確性是保證愛滋病檢測可靠性的關鍵技術 環節。目前HIV檢測中使用的質控對照通常為臨界值質控血清，這種血清很難從臨床直 接獲得，因此，一般採用HIV強陽性血清進行稀釋配製。配製的方法一般為通過反覆稀釋， 並進行檢測其S/C0值(檢測吸光度S與檢測限cutoff的比值)，直到其S/C0值達到預定 值左右。由於ELISA方法在S/C0值達到預定值時具有極高的敏感性，因此這種方法的弊端 就是需要反覆進行摸索稀釋倍數和進行檢測，直到其檢測值恰巧可以落在想要的範圍內。 需要耗費很多的時間、人力和檢測費用。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種愛滋病檢測質控血清的配製方法。該方法 簡單易行，減少步驟和各種損耗，並且減少反覆摸索稀釋的盲目性和不可控性。為解決上述技術問題，本發明所採用的技術方案是
通過大量檢測實驗數據和數學模型分析，本發明人得出了以下結論(1)臨床獲得的 HIV強陽性血清的檢測信號值遠遠超出了現有常規ELISA定性檢測方法和儀器的上限， 需要進行千倍以上的稀釋才能進入檢測信號有效區間。(2)當取反應OD值(樣本檢測OD 值-陰性對照OD值)作為反應信號代替S/C0值時，在一定範圍內，反應OD值與血清待檢靶 物質的濃度具有良好的線性回歸關係，其回歸曲線是一條截距近似為0的直線，可以統一 表示為「Y=aX」其中Y代表反應OD值，X代表待檢物濃度。基於上述論理，本發明提供了一種愛滋病檢測質控血清的配製方法該方法包括 以下步驟
(1)選擇陽性血清
所選用HIV陽性血清樣本需經ELISA檢測為強陽性，並經蛋白質印跡(以後簡稱 Western Blot)確證；
(2)選擇和處理陰性血清
選用正常人血清，該血清為HIV抗體陰性、HBsAg陰性、HCV抗體陰性，並且無肉眼可見 的溶血、黃疸、乳糜顆粒、絮狀沉澱物； 將上述陰性血清滅活補體，除菌備用；(3)最終稀釋倍數的確定
a.第一步稀釋
用處理後的陰性血清對HIV陽性血清進行10，100，1000……IOX梯度稀釋，並對各稀 釋樣本進行ELISA檢測，測得各樣本的OD值，找出樣本OD值相對於原陽性血清出現明顯下 降的稀釋倍數，即該稀釋倍數為第一步稀釋倍數，該樣本作為下步稀釋的母液；
b.第二步稀釋
對上步獲得的母液再進行2，4，8……2X系列稀釋，並對各稀釋樣本進行ELISA檢 測，測得各樣本的OD值，計算出S/C0值和反應OD值，確定第二步稀釋倍數，具體方法為
當2X系列稀釋的樣本中某一稀釋倍數樣本獲得的S/C0值恰巧為所需配製的數值，直 接採用該稀釋倍數為第二步稀釋倍數；
當2X系列稀釋的樣本中沒有S/C0值沒有出現所需配製的數值，則進行以下計算 (i )選一個OD值在2.0以下，S/C0值最接近所需配製數值的稀釋倍數，上下均可； ( )計算所選稀釋倍數的反應OD值，所述反應OD值=該稀釋倍數對應的樣本OD 值-陰性對照OD值；
(iii )計算所需配製S/C0值的質控血清的反應OD值，所述反應OD值=所需配製的S/ CO值X cutoff值-陰性對照OD ；
(iv )根據以下公式計算第二步稀釋倍數 X2=X1*Y1/Y2
其中，Χ2:第二步稀釋倍數
Xl 步驟(i )中所選的S/C0值最接近所需配製值的稀釋倍數 Yl 步驟( )所得的反應OD值 Y2:步驟(iii)所得的反應OD值
c.最終稀釋倍數=第一步稀釋倍數X第二步稀釋倍數；
(4)稀釋分裝
將選定的陽性血清和陰性血清，按照步驟(3)確定的最終稀釋倍數在無菌條件下進行 稀釋，稀釋後攪拌過夜，充分混勻，分裝於凍存管中備用。上述方法中，所述陽性血清優選為Western Blot全條帶的樣本，並且是將幾份 HIV強陽性血清混合物。上述方法中，步驟(2 )中，所述滅活補體是將所述陰性血清在56 °C條件下，處理30 分鐘；所述除菌採用0. 45 μ m微孔濾膜過濾。上述方法中，所述步驟(4)中，確認最終稀釋倍數後，進行稀釋時採用逐步稀釋法， 一次稀釋倍數不超過10倍。本發明的有益效果本發明提出了 HIV臨界值質控血清配製方法與現有方法相 比具有以下顯著優勢(1)大大簡化了配製過程的核心環節，將確定稀釋倍數的這一需要 反覆摸索的流程簡化為只需要兩步稀釋(先10倍系列稀釋，再2倍系列稀釋)，然後根據特 定信號值的換算可以直接得出最終稀釋倍數，這樣節省了該過程所需時間和人力和檢測成 本。(2)配製過程目標性和可控性更強。由於ELISA方法的S/C0值具有極高的敏感性，現 有的一般方法只有經過反覆摸索，才能找到檢測值接近於目標的稀釋倍數。這樣就使配製 過程具有較大的盲目性和隨機性。本發明只有按照上述步驟進行稀釋，就能準確得出所需特定檢測值的質控血清，流程步驟完全可控。這樣就更適用於大規模產業化的配製生產。 (3)配製更準確。因為HIV強陽性血清需要上萬倍稀釋才能達到要求，而人工摸索稀釋倍 數在後期階段一般只能得出整數倍，這樣的稀釋倍數經過上百、上千倍以上的放大，其誤差 範圍也往往達到上百上千倍，這樣往往造成摸索出來的試驗結果和實際配製的結果差別很 大。而我們經過數學模型擬合的反應曲線具有非常好的回歸係數，根據已知的測量點進行 換算得出的稀釋倍數可以準確到小數點以後三位甚至更多，這樣就極大的縮小了預試和實 際配製兩者之間的誤差。具體實施例方式
實施例1以配製S/C0=2的質控血清為例
1材料HIV陽性血清北京出入境檢疫局從出入境人員中檢出的HIV陽性。HIV陰性 血清本實驗室從日常檢測樣品中或通過血液中心收集到的正常人血清，收集的血清要求 必須為HIV抗體陰性、HBsAg陰性、HCV抗體陰性。同時要求無肉眼可見的溶血、黃疸、乳糜 顆粒、絮狀沉澱物。上述血清經56°C 30分鐘滅活補體，並經0.45 μ m微孔濾膜過濾除菌備用。HIV ELISA試劑生物梅裡埃公司Vironostika第四代試劑批號A57BA)； 儀器SEAC Alisei全自動酶聯免疫檢測系統
2方法
第一步稀釋首先用陰性血清對HIV陽性血清進行10，100，1000……IOX梯度稀釋並 用生物梅裡埃第四代ELISA試劑檢測。檢測結果如下 表1陽性血清IOX系列稀釋ELISA檢測結果
權利要求
1.一種愛滋病檢測質控血清的配製方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(1)選擇陽性血清所選用Hiv陽性血清樣本需經ELISA檢測為強陽性，並經Wfestern Blot確證；(2)選擇和處理陰性血清選用正常人血清，該血清為HIV抗體陰性、HBsAg陰性、HCV抗體陰性，並且無肉眼可見 的溶血、黃疸、乳糜顆粒、絮狀沉澱物； 將上述陰性血清滅活補體，除菌備用；(3)最終稀釋倍數的確定a.第一步稀釋用處理後陰性血清對HIV陽性血清進行10，100，1000……IOX梯度稀釋，並對各稀釋 樣本進行ELISA檢測，測得各樣本的OD值，找出樣本OD值相對於原陽性血清出現明顯下降 的稀釋倍數，即該稀釋倍數為第一步稀釋倍數，該樣本作為下步稀釋的母液；b.第二步稀釋對上步獲得的母液再進行2，4，8……2X系列稀釋，並對各稀釋樣本進行ELISA檢 測，測得各樣本的OD值，計算出S/C0值和反應OD值，確定第二步稀釋倍數，具體方法為當2X系列稀釋的樣本中某一稀釋倍數樣本獲得的S/C0值恰巧為所需配製的數值，直 接採用該稀釋倍數為第二步稀釋倍數；當2X系列稀釋的樣本中S/C0值沒有出現所需配製的數值，則進行以下計算 (i )選一個OD值在2.0以下，S/C0值最接近所需配製數值的稀釋倍數，上下均可； ( )計算所選稀釋倍數的反應OD值，所述反應OD值=該稀釋倍數對應的樣本OD 值-陰性對照OD值；(iii )計算所需配製S/C0值的質控血清的反應OD值，所述反應OD值=所需配製的S/ CO值X cutoff值-陰性對照OD ；(iv )根據以下公式計算第二步稀釋倍數 X2=X1*Y1/Y2其中，Χ2:第二步稀釋倍數Xl 步驟(i )中所選的S/C0值最接近所需配製數值的稀釋倍數 Yl 步驟( )所得的反應OD值 Y2:步驟(iii)所得的反應OD值c.最終稀釋倍數=第一步稀釋倍數X第二步稀釋倍數；(4)稀釋分裝將選定的陽性血清和陰性血清，按照步驟(3)確定的最終稀釋倍數在無菌條件下進行 稀釋，稀釋後攪拌過夜，充分混勻，分裝於凍存管中備用。
2.根據權利要求1所述的愛滋病檢測質控血清的配製方法，其特徵在於，所述陽性血 清為Western Blot全條帶的樣本，並且是幾份HIV強陽性血清的混合物。
3.根據權利要求1所述的愛滋病檢測質控血清的配製方法，其特徵在於，步驟(2)中， 所述滅活補體是將所述陰性血清在56°C條件下，處理30分鐘；所述除菌採用0. 45 μ m微孔 濾膜過濾。
4.根據權利要求1所述的愛滋病檢測質控血清的配製方法，其特徵在於，所述步驟(4)中，確認最終稀釋倍數後，進行稀釋時採用逐步稀釋法，一次稀釋倍數不超過10倍。
全文摘要
本發明公開了一種愛滋病檢測質控血清的配製方法，該方法是一種通過兩步稀釋法確定稀釋倍數的臨界值質控血清的配製新方法，該方法簡單易行，減少步驟和各種損耗，並且減少反覆摸索稀釋的盲目性和不可控性。
文檔編號G01N33/571GK102128927SQ20101061131
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者劉建禮, 張紹福, 朱紅 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局