一種米糠抗氧化活性肽的分離製備方法與流程
2023-11-11 02:24:57
本發明涉及一種米糠抗氧化活性肽的分離製備方法。
背景技術：
米糠是大米生產工廠中產生較多的副產物，其蛋白質胺基酸組成與大米中蛋白質胺基酸組成相似，胺基酸組成合理，均為優質蛋白。我國每年工業生產都會產生大量的米糠，而其中大部分未得到有效利用，因此需要對米糠蛋白進行深加工以提高其附加值，實現資源充分利用。大米以及米糠中的蛋白溶解性差，嚴重影響其應用。而米糠中的分子量較小的肽段則具有較好的溶解性，且不同的肽段具有不同的功效，如抗氧化性、降血壓、免疫活性等。大米抗氧化活性肽具有良好的自由基清除能力，在預防自由基誘發的心腦血管疾病方面有很大的開發潛力。大米活性肽對氧化損傷誘導的自由基有很好的清除作用，可提高人體細胞抗氧化能力。
經過調研，未見我國學者利用中性蛋白酶提取米糠谷蛋白中抗氧化活性肽的相關文獻報導，因此中性蛋白酶提取米糠谷蛋白中抗氧化活性肽等研究領域尚處於空白階段。本研究發現利用中性蛋白酶提取米糠蛋白中的大米活性肽具有清除自由基、抑制細胞氧化的作用，有效提高米糠的附加價值，實現米糠的高值化利用。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種米糠抗氧化活性肽的分離製備方法，是以米糠為原料，利用中性蛋白酶製備具有抗氧化活性的肽產品，以實現米糠的高值化利用。
為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
所述米糠抗氧化活性肽的分離製備方法是通過鹼提酸沉法和Osborne分級提取脫脂米糠來獲得米糠谷蛋白，然後選用離子交換和凝膠層析技術對米糠谷蛋白進行分離純化，再將分離純化後的米糠谷蛋白用鹼性蛋白酶水解、離心、真空濃縮、冷凍乾燥，之後利用離子交換層析、凝膠層析、製備RP-HPLC及分析型RP-HPLC分離純化得到抗氧化活性肽，所述抗氧化活性肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
優選地，所述鹼性蛋白酶水解的條件為[E]/[S]1.5％—1.8％、pH值為10.0、溫度為50℃、反應時間為4.2h。
優選地，所述方法具體包括如下步驟：
(1)谷蛋白的提取：脫脂米糠→加水並調pH值為9.0，料液比為1:10，所述料液比的單位為mL/g，40℃水浴4h→離心→取上清液→pH值為4.0條件下酸沉→離心→取沉澱→水洗，調pH值為7.0→冷凍乾燥→鹼提米糠谷蛋白→Osborne分級提取，得到米糠谷蛋白；
(2)選用pH值為10.0，濃度為0.1mol/L的Na2CO3-NaHCO3作為緩衝液對大米谷蛋白進行初步的分離；以pH值12.0，濃度為0.05mol/L Na2HPO4-NaOH緩衝液溶解鹼提米糠谷蛋白，利用DEAE-52陰離子交換層析介質對鹼提米糠谷蛋白進行進一步分離純化；
(3)製備米糠蛋白懸浮液，按鹼性蛋白酶/谷蛋白質量比為1.5％-1.8％的比例添加鹼性蛋白酶→調pH值為10.0→50℃下超級恆溫水浴酶反應器中溶解30min→酶解4.2h→滅酶→離心→取上清液→真空濃縮→冷凍乾燥，得大米谷蛋白肽；
(4)對大米谷蛋白肽進行分離純化後得抗氧化活性肽。
下面對本發明作進一步說明：
本發明所述大米活性肽的製備方法包括以下步驟：
(1)谷蛋白的提取：通過鹼提酸沉法提取谷蛋白，選用離子交換和凝膠層析技術對大米谷蛋白進行分離純化；
(2)米糠谷蛋白的水解：5％(w/v，g/mL)米糠谷蛋白懸浮液→調pH值→一定溫度下超級恆溫水浴酶反應器中溶解30min→按一定的底物濃度、加酶量、pH值、溫度進行酶解(恆pH滴定儀使體系pH穩定)→85℃，10min滅酶→3500r/min離心15min→上清液→真空濃縮→冷凍乾燥→米糠谷蛋白肽；
(3)米糠谷蛋白肽的分離純化
①利用SP-Sephadex G-25作為離子交換層析介質，pH4.0，0.02mol/L HAc-Na Ac為起始緩衝液，流速2mL/min，用平衡緩衝液、含0.5mol/L NaCl的平衡緩衝液和含1mol/L NaCl的平衡緩衝液梯度洗脫，選取米糠谷蛋白水解產物多個肽組分中自由基清除能力最強的組分。
②利用Sephadex G-15凝膠層析將①所選組分分離成幾個組分，選取自由基清除能力最強的組分。
③利用製備RP-HPLC將上個步驟所選組分進一步分離，選取幾個主要組分，通過測定各主要組分的自由基清除能力篩選出抗氧化活性較強的組分，再經RP-HPLC分析是否為相對單一峰。
(4)採用MALDI-TOF/TOF MS質譜分析法測得提取出的大米活性肽的相對分子量。結合TOF-MS/MS串聯質譜得出其胺基酸組成和其排列順序。
與現有技術相比，本發明方法製備的米糠活性肽更有效的利用了米糠，提高了大米生產中副產物的利用，也節約了生產成本，對實現米糠蛋白的綜合利用和提高其附加值具有重要的意義。
附圖說明
圖1為TOF-MS/MS串聯質譜測定結果圖；
圖2為離子交換層析分離得到的組分PA-PG的ABTS·+自由基清除能力；**表示清除率最高的組分和其他組分之間存在顯著性差異；
圖3為凝膠層析分離得到的組分PF1-PF4的ABTS·+自由基清除能力；**表示清除率最高的組分和其他組分之間存在顯著性差異；
圖4為RP-HPLC分離得到的組分PF3-α到F3-γ的ABTS·+自由基清除能力；**表示清除率最高的組分和其他組分之間存在顯著性差異。
具體實施方式
實施例1
所述米糠抗氧化活性肽的分離製備方法包括如下步驟：
(1)鹼提酸沉法提取米糠谷蛋白的工藝流程為：脫脂米糠(過60目篩)→加水並調pH9.0(料液比1:10，所述料液比的單位為mL/g，水浴：40℃，4h)→離心(8000r/min，15min)→取上清液→酸沉(pH 4.0)→離心(8000r/min，15min)→取沉澱→水洗三次，調ph7.0→冷凍乾燥(48h)→鹼提米糠谷蛋白(4℃密封儲藏+矽膠)→Osborne分級提取，得到較純的谷蛋白；
(2)選用Na2CO3-NaHCO3(pH10.0，0.1mol/L)作為緩衝液對大米谷蛋白進行初步的分離。以0.05mol/L Na2HPO4-NaOH(pH12.0)緩衝液溶解鹼提米糠谷蛋白，利用DEAE-52陰離子交換層析介質對鹼提米糠谷蛋白進行了進一步分離純化，依次用0.15mol/L、0.25mol/L、0.35mol/L、0.45mol/L、0.55mol/L的含鹽緩衝液階段洗脫鹼提大米谷蛋白，分離得到五個洗脫峰R1、R2、R3、R4、R5，採用HPLC對R3組分進行純度分析，其純度為71.55％。收集R3採用Sephadex G-75凝膠過濾層析進一步純化，得到R3-α、R3-β、R3-γ三個洗脫峰，經HPLC檢測，其中R3-γ洗脫峰的分子量為37530.34，純度達93.45％；
(3)5％(w/v，g/mL)米糠谷蛋白懸浮液，按照鹼性蛋白酶/谷蛋白為1.5％-1.8％(g/g)的比例添加鹼性蛋白酶→調pH值為10.0→50℃下超級恆溫水浴酶反應器中溶解30min→酶解4.2h(用pH滴定儀使體系pH穩定)→85℃，10min滅酶→3,500r/min離心15min→上清液→真空濃縮→冷凍乾燥→大米谷蛋白肽；
(4)大米谷蛋白肽的分離純化
①利用SP-Sephadex C-25作為離子交換層析介質，pH4.0，0.02mol/L HAc-NaAc為起始緩衝液，流速2m L/min，用平衡緩衝液、含0.5mol/L NaCl的平衡緩衝液和含1mol/L NaCl的平衡緩衝液梯度洗脫，谷蛋白中性蛋白酶水解產物混合肽組分被分離出七個組分(PA-PG)，組分PF的ABTS·+自由基清除能力最強(71.09％，圖2)。
②利用Sephadex G-15凝膠層析以超純水為緩衝液，進樣濃度為15mg/mL又將組分PF分成了4個組分PF1、PF2、PF3和PF4。檢測發現，組分PF3的ABTS·+自由基清除能力最強，達到69.24％(圖3)。
③利用製備RP-HPLC將PF3進一步分成了5個主要組分，通過測定各組分的自由基清除能力篩選出抗氧化活性最強的組分為PF3-γ(圖4)，其ABTS·+自由基清除能力達到78.59％，經RP-HPLC分析為相對單一峰。
(5)採用MALDI-TOF MS質譜分析法測得抗氧化活性肽PF3-γ的相對分子量為1002.06(圖1)。
結合TOF-MS/MS串聯質譜得出；PF3-γ由8個胺基酸組成，其排列順序為Lys-His-Asn-Arg-Gly-Asp-Glu-Phe(KHNRGDEF)。經查新發現，本發明得到的活性肽為具有抗氧化活性的新的活性肽序列。
實施例2米谷蛋白活性肽體內抗氧化活性的檢測
選擇對數生長期的細胞，用無EDTA胰酶消化後製成細胞懸液，用計數板測定懸液中的細胞濃度，按照每孔5000個細胞接種於96孔板，每孔接種100μL，每組設6個復孔，在37℃5％CO2培養箱中培養6小時後分為正常組、H2O2處理組、H2O2+米谷蛋白活性肽保護組，將原有培養基吸出，所有組先加入80μL的培養基，正常組、H2O2處理組加入10μL的無血清培養基，H2O2+米谷蛋白活性肽保護組分別加入相應濃度等體積米谷蛋白活性肽，使藥物終濃度分別為100、150、200μmol/L，於37℃5％CO2培養箱預保護4h後，H2O2處理組和H2O2+米谷蛋白活性肽保護組每孔加入10μL H2O2，其終濃度為100μml/L，正常對照組加入10μL無血清培養基，於37℃5％CO2培養箱孵育24h後，MTS法檢測細胞活力(見表1)。與正常組比較，H2O2損傷組的細胞存活率顯著下降；而與H2O2處理組比較，米谷蛋白活性肽的高劑量組(200μmol/L)對H2O2誘導的細胞活力有明顯改善。
表1米谷蛋白活性肽對H2O2損傷的內皮祖細胞的細胞活力的影響