識別流中的微粒的系統、存儲介質和方法

2023-05-01 11:00:21

專利名稱：識別流中的微粒的系統、存儲介質和方法
技術領域：
本發明一般涉及流式細胞儀系統、存儲介質和方法，進一步涉及詢問和識別流過 流式細胞儀的微粒的系統、存儲介質和方法。2.相關技術描述一般地，流式細胞儀提供對直線地通過流通室的被照明微珠或微粒的螢光強度的 測量。對螢光的兩次或多次測量可以用於將微粒歸類為特定的微粒子集。另外，其它被稱為 「指示器(reporter) 」的螢光測量可用於量化感興趣的化學反應，以確定試樣中是否存在分 析物。每個螢光測量在不同的波長下進行。在有些情況下，流式細胞儀能進一步用於測量 微粒的一個或多個其他性質，諸如但不限於被微粒和/或微粒的電阻抗散射的光的水平。許多常規的流式細胞儀測量系統詢問兩個物理地址中的微粒，這兩個物理地址 在流體流動方向上約相隔30 μ m-100 μ m。在第一詢問點處，微粒被照亮，且在通常被稱為 「DD」、「CL1」和「CL2」的三個通道上同時檢測到其散射和螢光。同一微粒接著在第二點處 被詢問，在第二點處照明激勵被束縛至該微球體的指示器標籤。該指示器螢光在通常被稱 為「RP1」的通道上被探測，但也可使用其他參照物。在這種常規流式細胞儀中，流通池內部 的微粒間距估算約為400 μ m-1000 μ m。在微粒間距是詢問點之間距離的很多倍的情況下， 兩個微粒在兩個點處被同時詢問的機會很小。因此，在兩個詢問點處連續採集的測量通常 指定同一個微粒。儘管如此，由於採用了在不同詢問點同時詢問多個微粒的可能性增長的 系統和/或技術，準確關聯流式細胞儀內的不同詢問點處產生的脈衝帶來了挑戰。
發明概要以下對用於將從流式細胞儀中的多個詢問區域產生的脈衝與流過流式細胞儀的 特定微粒相關聯的方法、存儲介質和系統的不同實施例進行的描述不會以任何方式限制所 附權利要求的主題。方法、存儲介質和系統的實施例包括校準流式細胞儀的裝置，該裝置採用具有獨 特信號的校準微粒以確定微粒流過流式細胞儀的飛行時間。基於所計算的飛行時間和與流 式細胞儀的採集器相對應的詢問點的相關位置，所述方法、存儲介質和系統可進一步包括 將其他信號脈衝關聯到一個或更多不同微粒集的微粒的裝置。附圖簡述在閱讀下面的細節描述和參考附圖後，本發明的其他目的和優點將變得明顯

圖1是流式細胞儀的示意圖；圖2是圖1中描述的流式細胞儀的示例性的檢查系統的示意圖；圖3是流式細胞儀的詢問區的一部分內的部件的示意圖；圖4是流式細胞儀的詢問區的一部分內的部件的替代配置的示意圖；圖5是繪製從流式細胞儀的檢測系統的DD、CL1和CL2通道產生的波形的曲線圖；圖6是與圖5相似的、疊有飛行時間校準微粒的閾值的波形曲線圖7是與圖5相似的、標記有DD通道高和低信號閾值的波形曲線圖；圖8是一個與圖5相似的、各個通道上的脈衝分配給共同微粒的波形圖；圖9是將從流式細胞儀的多個詢問區域產生的信號脈衝與試樣中的不同微粒子 集的微粒相關聯的過程的流程圖；圖10是校準流式細胞儀以確定流過流式細胞儀的微粒的飛行時間的過程的流程 圖；以及圖11是關聯在流式細胞儀的不同詢問點處產生的脈衝的過程的流程圖。雖然本發明允許各種修改和變形，但本發明的特定實施例通過附圖中的示例示出 並在此詳細描述。然而，應該理解的是，這裡的附圖和細節描述不旨在將發明限定為所公開 的特定形式，相反，本發明旨在覆蓋所附權利要求所限定的落在本發明精神和範圍內的所 有修改、等價方案和替代方案。優選實施例的詳細描述轉到附圖，提供了將從流式細胞儀的多個詢問區域產生的脈衝與流過流式細胞儀 的特定微粒相關聯的示例性的方法、存儲介質和系統。特別地，圖1說明了一個示例的流式 細胞儀的示意圖。特別地，圖1描述了流式細胞儀10，其包括流動系統12、照明系統14、檢 測系統16以及控制器18。流動系統12 —般包括配置成輸送具有大量微粒的流體、並進一 步配置成集中樣本以使至少部分微粒能夠被單獨詢問的系統。更特別地，流動系統12可配 置成經由鞘液(sheathfluid)流體動力學地集中試樣，該鞘液形成允許大部分微粒連續通 過的微粒流動通道。一般地，部分或全部這種微粒流動通道可作為詢問區，在該詢問區內設 置了多個詢問區域以詢問微粒。這裡所描述的方法、存儲介質和系統能夠適用於連續詢問 微粒的任何流動系統，且術語「流式細胞儀」旨在包含所有這樣的系統。另外，這裡描述的 方法、存儲介質和系統可適用於分析任何類型的試樣的流式細胞儀，這些試樣具體而言是 期望確定其中是否存在一種或多種感興趣的分析物的任何生物、化學或環境的試樣。此處使用的術語「微粒」 一般指微球體、聚苯乙烯珠、量子點、納米點、納米微粒、 納米殼、珠、微珠、微粒子、膠乳顆粒、膠乳珠、螢光珠、螢光微粒、有色微粒、有色珠、組織、細 胞、微生物、有機物、無機物或者本領域已知的其他任何不連續的酶或者物質。在此，此類術 語都可以交替使用。在某些情況下，微粒可包括輔助識別的材料，例如螢光、磁性、電磁共 振和放射性材料。可用於所述方法和系統的示例性微粒包括可從德克薩斯州奧斯汀市的 Luminex公司購買到的xMAP 微球體。一般地，此處涉及的微粒可作為分子反應的媒介。一般地，照明系統14配置成將光導向由流動系統12形成的微粒流動通道的多個 不同的詢問點。多個詢問點可以是大於1的任意多個詢問區域。如以下將詳細描述的那樣， 在一些情況下，具有至少3個詢問點是有利的，但是此處描述的系統和方法並不限於此。在 某些實施例中，不同的詢問點可用於微粒的各個不同參數，如以下參照圖4所描述的那樣。 然而，在其他實施例中，如參照圖3所示例子中所述的那樣，在一個詢問點處可以測量多個 參數。無論如何，詢問點之間的距離通過確定已知的值或通過推斷他們的間距(即與檢測 器之間的間距相等或成比例)而已知。這樣，可確定校準微粒的飛行時間，並接著應用於將 從多個詢問區域產生的脈衝關聯到其他微粒子集的特定微粒。一般地，照明系統14可包括任意多個光源，包括單個光源或者多個相同類型或者 不同類型的光源。在某些實施例中，照明系統14可包括針對各個詢問點的不同光源，如圖3和4所示以及在下面將進行更詳細描述的的示例系統中所示。在這些情況下，光源可設置 成直接向流式細胞儀的微粒流動通道投射光，從而照明系統14可不必包括將光導向流動 通道的分束器和反射鏡。這種設置有利於最小化流式細胞儀的大小和/或簡化流式細胞儀 的設計。在其它實施例中，分束器和反射鏡可包括在對每個詢問點具有不同光源的照明系 統中。在；另外的其他情況下，照明系統14可包括數量少於光源直接照射的多個詢問點的 數量的多個光源。在這些實施例中，照明系統14可包括分束器，並且在某些情況下還包括 將單個光源的光導向多個詢問點的反射鏡。這樣，儘管圖1所示的流式細胞儀10以及圖3 和圖4所示的示例配置顯示出以基本垂直的入射角分別把光導向流動系統12和微粒流動 通道40，但需要理解的是照明系統14可配置成以任何合適的入射角引導光。無論如何，照明系統14的光源可包括本領域已知的任何適合的光源，諸如但不限 於發光二極體(LEDs)、雷射器、弧光燈、光纖導光燈、光熱燈泡和白熾燈。另外，在某些實施 例中，照明系統14包括光學元件而不是光源，諸如但不限於，分束器、反射鏡、準直透鏡、濾 光器、中性密度濾光片、起偏元件、漫射器和/或均化器。在某些情況下，照明系統14可配 置成使用不同波長或波長帶的光(例如藍光和綠光)來連續照明微粒，以使被導向微粒的 光為單色、接近單色、多色或寬帶。此外，注意流式細胞儀10內是否包括照明系統14是可 選擇的，並且通常取決於流式細胞儀10是否用於檢測螢光發射。特別的，在某些實施例中， 流式細胞儀10被應用於產生化學發光反應並測量發光發射結果，並且在某些情況下可不 用於產生和測量螢光發射。在這些情況下，照明系統14可關掉或者從流式細胞儀10中省 去。如圖1所示，流式細胞儀10可包括檢測系統16。一般地，檢測系統16可設置成 採集從通過流動系統12詢問區的詢問區域的微粒發射和/或散射的光。更特別地，檢測系 統16可包括多個採集器，這些採集器設置成從詢問區採集光，且進一步設置成產生表示所 採集的光強度的信號。特別地，採集器的輸出電流正比於入射在其上的光，並導致一個電流 脈衝。這個電流脈衝可轉換成電壓脈衝、經低通濾波、然後經過模/數轉換器進行數位化轉 換而產生一數據信號。根據所採集的光，該數據信號可以是散射信號、通信標記信號、螢光 信號、磁信號和/或電磁諧振信號。注意到檢測系統16的採集器的功能參照從詢問區而不 是詢問點所採集的光進行描述。此處使用的術語「詢問點，，指的是沿著光源被弓I導和照明 的微粒流動通道的點。此處使用的術語「詢問區」指的是環繞從中採集光線的詢問點的區 域。一般地，詢問區域的面積通常取決於所使用的採集器的配置。一般地，檢測系統16可包括針對要測量微粒的各個不同參數的不同採集器。這些 採集器可包括任意類型的光電檢測器，包括但是不限於雪崩光電二極體(APD)、光電倍增管 (PMT)、電荷耦合器件(CCD)。此外，這些採集器可以是相同類型或不同類型，這取決於所收 集的光的類型。在某些情況下，檢測系統16可包括濾光片、反射鏡和/或透鏡。在某些實 施例中，檢測系統16的採集器可設置成從詢問區的不同詢問區域採集光，如圖4的示例系 統中以及隨後的更詳細描述中所示。在這些情況下，採集器可設置成直接從詢問區域採集 光，並且因此檢測系統16可不必包括分束器和反射鏡來為不同的採集器採集光。這種配置 有利於最小化流式細胞儀的尺寸和/或簡化流式細胞儀的設計。在其他實施例中，分束器 和反射鏡可包括在檢測系統中，該檢測系統在每個不同的詢問區域都配置一個採集器。在其他情況下，檢測系統16的一些採集器可設置成從相同的採集區域採集光，如圖3的示例系統所示且將隨後更詳細描述。在這些實施例中，檢測系統16可包括分束器， 並且在某些情況下還包括反射鏡，以將光從詢問區域引導向多個採集器。為簡化附圖，此類 附加元件沒有在圖3中示出，因此不應理解為省去。同樣，儘管圖1所示的流式細胞儀10 以及圖3和圖4所示的示例配置分別表明是在常規的入射角收集光，但應該理解的是，檢測 系統16可設置成以任何合適的角度收集光。如圖1進一步所示，流式細胞儀10可包括與檢測系統16可操作地連接的檢查系 統18。一般地，檢查系統18可設置成接收、監控以及評價從檢測系統的採集器產生的信號， 從而確定試樣中的分析物的類型和/或量。在某些實施例中，檢查系統18是被設置成使流 式細胞儀10的操作自動化的控制系統的一部分。在這些情況下，檢查系統18可進一步可 操作地耦合至流動系統12和照明系統14。在其他實施例中，檢查系統18可從這樣的一個 控制系統中分離。在任一種情況下，檢查系統18可包括處理器和可由該處理器執行的程序 指令，這些程序指令用於執行圖9-11中概述的流程圖中以及圖5-8中描繪的圖像中描述的 任何過程。圖2所示為檢查系統18的示例性配置的示意圖。需要注意，這樣一個配置僅僅 是示例性的，因而也可以考慮其他設置。如圖2所示，檢查系統18包括存儲介質20和處理器24。檢查系統18可採用多種 形式，包括個人計算機系統、大型計算機系統、工作站、網絡設備、網際網路設備、個人數字助 理(PDA)、數位訊號處理器(DSP)、現場可編程門陣列(FPGA)或其他設備。無論如何，存儲 介質20包括可使用處理器24執行而產生和傳送輸出28的程序指令2224。如下文所詳細 描述的一樣，檢查系統18被配置成接收輸入28 (即從檢測系統16的採集器產生的信號) 以通過處理器24激活程序指令22和/或向程序指令22貢獻數據以運行。儘管沒有在圖2 中示出，存儲介質20可包括可由程序指令22訪問以執行下文概述的過程的資料庫和/或 查找表。示例性的資料庫和/或查找表可包括例如預定信號範圍和/或閾值，從檢測系統 16接收的信號與上述預定信號範圍和/或閾值進行比較。在其他實施例中，這樣的預定信 號範圍和/或閾值可包括在程序指令22中，因此，可從存儲介質20中省去資料庫和/或查 找表。一般地，這裡使用的術語「存儲介質」可表示配置成保存一個或多個程序指令集的 任何電子介質，諸如但不限於只讀存儲器、隨機存取存儲器、磁碟或光碟、或磁帶。術語「程 序指令」一般指的是被設置成執行特定功能的指令，例如下文將詳細描述的將從流式細胞 儀的多個詢問區域產生的脈衝與流過流式細胞儀的特定微粒相關聯。程序指令可以按照多 種方式實施，包括基於程序的技術、基於元件的技術和/或面向對象的技術。例如，程序指 令可利用Active X控制項、C++對象、JavaBeans、微軟基礎類(「MFC」)或其他需要的技術 或方法來實施。如上所述，程序指令24—般設置成執行在圖9-11中描述的流程圖中所概 述的過程。同樣，圖9-11所示的流程圖一般描述通過使用軟體模塊來執行的方法。更特別 地，參照圖9-11中所描述的方法包括通過使用一個或多個算法分析和計算相對大量的數 據，因此通過計算機能最佳實現。因此，參照圖9-11所描述的方法可稱為「計算機實現的方 法」。圖3和圖4示出了可考慮用於在此描述的方法和系統的流式細胞儀示例性詢問區 的一部分。具體而言，圖3和圖4表明了流式細胞儀的示例性部分的示意圖，其中照明系統 的光源和檢測系統的採集裝置的位置相對於流式細胞儀的微粒流動通道示出。可以注意到
8圖3和圖4的示圖是示例性的，而不應理解為用於限制可考慮用於本文所述方法和系統的 流式細胞儀的設置。相反，圖3和圖4僅用來描述流式細胞儀部件的一些可能設置，並進一 步幫助描述參照圖5-12所描述的過程步驟。如圖3所示，在某些實施例中，照明系統14包括兩個光源，即光源30和32，它們 被弓I導至微粒流動通道40中的詢問區域41和42的兩個不同的詢問點。在詢問區域41和 42的接收終點處分別是採集器集50和採集器52。如圖3所示，採集器集50包括三個採集 器，每一個用於不同的通道DD、CL1和CL2。這樣，從例如圖3中所示的微粒60之類的單個 通過微粒發出的散射和螢光可同時被檢測。在某些情況下，這些通道可用來將微粒60歸類 至特定微粒集。此後，微粒60將通過詢問區域42，從而光可被包括一報告標籤信道(如圖 3指示的「RP1」)的採集器52採集。這個報告標籤信道一般可用於檢測和/或量化通過微 粒上的分析物的量。如上所述，詢問區域41和42的詢問點取決於來自光源30和32的入射光，因此， 如圖3所示，詢問區域的詢問點之間的間距就由間距X表示。一般地，圖3所示的間距X的 距離和微粒的間距使在不同詢問點同時詢問是不太可能的。特別地，詢問點彼此間間距太 近(例如，約30 μ m-100 μ m)以致於在流通流體中的微粒間距(例如約400 μ m-1000 μ m的 微粒間距)比間距X大很多，使得在多個詢問點處的同時微粒詢問不可能。如前所述，這樣 的詢問區配置在常規的流式細胞儀中常見。然而，要注意的是，由於對試樣內的微粒濃度更 大的需求持續，此類裝配最後服從於流過的流體中的微粒間距等於或小於間距X的情形， 使得在不同的詢問點同時詢問微粒成為可能。特別地，在不遠的將來，在某些點處，流過的 流體中的微粒間距可減少到小於約100 μ m。同樣，可以預期，此處描述的方法和系統可應用 於圖3所示的流式細胞儀的配置以及流式細胞儀的任何其他配置。圖4示出了流式細胞儀的詢問區的替代實施例。特別的，圖4描述包括光源34、 36,38以及32的照明系統14，這些光源被引導至微粒流動通道44的詢問區域45-48中不 同的詢問點。詢問區域45-48的接收終點上分別是採集器54、56、58以及52。更具體地， 詢問區域45與光源34和包括信道DD的採集器54相關聯。詢問區域46與光源36和包括 信道CLl的採集器56相關聯，且詢問區域47與光源38和包括信道CL2的採集器58相關 聯。類似地，詢問區域48與光源32和包括信道RPl的採集器52相關聯。與圖3相對照， 圖4示出了流式細胞儀的詢問區的一部分，其中微粒間距等於或小於詢問點的間距(如圖 4中間距Y指出的)，使得在不同的詢問點同時詢問微粒成為可能。在圖4所示的說明性實 施例中，同時詢問在區域45、46和47處發生。相對於詢問點間距而言密集的微粒間距可能 由例如密集珠子、大量珠子、或者詢問區的寬距之類的多種情況引起。如前所述，在不背離 此處描述的方法和系統的範圍的情況下，詢問點的數量、間距和激發源可不同。圖5示出在DD、CLl和CL2信道上與圖4中的三個詢問窗口 45_47相關聯的假設 波形。如圖5所示，在三個信道之間存在多個同步波形脈衝。為分離流過詢問區的微粒，必 須知道哪些脈衝屬於給定的微粒。此處描述的方法和系統利用下面的過程將微粒與脈衝關 聯，該過程使用1)已知詢問點位置；2)用於飛行時間計算的唯一可標識的微粒；以及3) 檢測算法。採用此類過程的示例在下文參照圖4-8進行描述。此後，圖9-11中所示的流程 圖說明了該過程的全部範圍。一般的，此處描述的方法和系統通過識別與在至少兩個信道中的與「校準」微粒相關聯的獨特信號來起作用。這些獨特信號包括但不限於，由於尺寸產生的獨特的散射信號、 獨特的報告標籤信號、由於染色產生的一個或多個獨特信號、獨特的磁異常特徵、獨特的電 磁諧振、或者放射性。以下參照圖4-7給出的示例利用兩個連續信道，但是具有已知間距的 任意個信道都將起作用。在某些實施例中，採用具有相對大間距的信道是有利的。特別地， 較大的間距為計算微粒飛行時間提供了較大的容許誤差。因此，在某些實施例中，需要在詢 問區的兩端都採用信道以識別校準微粒。一般地，校準微粒子集會具有與試樣中的其他微粒子集不同的獨特信號值範圍。 在某些實施例中，校準微粒子集可具有高於試樣中的其他微粒子集的信號的獨特信號。圖 6示出了這樣的實施例。特別地，圖6示出了來自圖5的波形，其中分別示出了信道CLl和 CL2的校準微粒識別閾值60和62。需要注意的是，一個或多個可選擇的或附加的信道可用 於檢測校準微粒，因此，此處描述的方法和系統不限於參照圖6所述的示例。特別的，應當 理解的是，此處描述的實施例可以使用微粒的任何可測量參數來區分微粒的不同種類。如圖6所示，跨越CLl和CL2上的識別閾值的脈衝峰在時間軸上的位置分別標為 T1和T2。此類脈衝的時間差標為dt，可由下式得到dt = T2-T1由於微粒聚集，閥值有可能跨越CLl和CL2上的信號。同樣，在某些實施例中，驗 證單個校準微粒實際已被識別是有利的。為了回答這個問題，可查看DD信道以尋找落在可 接受界限內的信號。DD信道檢查微粒的散射以確定是否發現單個微粒或者多個微粒的聚 集。在圖4-7描述的實施例中，DD信道被放置在上遊並毗鄰CLl信道。在這種情況下，對 應於該微粒的DD信道信號的位置Ttl可以通過下式得出T0 = T1-Clt但是，需要注意的是，這個計算可根據相對於用於檢測校準微粒的信道(例如CLl 和CL2)的DD信道的位置而變化。圖7是來自圖5的波形圖，其中分別示出了 DD信號電平界限64和66以及在DD、 CLl和CL2信道上的脈衝峰TpT1和T2的識別。如圖7所示，T0處的DD信道脈衝落在可接 受的範圍內，即在界限64與66之間，因此確認了校準微粒飛行時間檢測。如圖8所示，微 粒現在可以從DD、CLl和CL2信號中提取。在圖8中，第一微粒與信道DD、CLl和CL2上如 附圖標記70所示的一系列連續信號脈衝相關聯。第二微粒與信道上由附圖標記72表示的 不同脈衝系列相關聯，而第三微粒與信道上由附圖標記74表示的另一脈衝系列相關聯。每 一個此類信號脈衝系列都與前面計算的校準微粒通過流式細胞儀的飛行時間、以及與包括 信道DD、CL1和CL2的各個採集裝置相關聯的詢問點的相對位置相一致。在所示實施例中， 該過程要求緩衝DD信道信號，因為Ttl時間點將會在校準微粒信號觸發飛行時間計算過程 之前出現。相信在很多情況下，微粒通過流式細胞儀的速率變化足以導致頻繁的校準。在這 種情況下，飛行時間校準微粒以相對於其他微粒足量的方式混合到樣本中，以確保飛行時 間校準能夠在給定的時間段內(例如一秒內很多次)多次完成，從而確保考慮了微粒速率 的任何幹擾。如果檢測到新的飛行時間校準微粒，則利用新值重新計算並更新dt，隨後使用 新值識別微球體。圖9-11示出了概述此處描述的系統和方法可採用的過程的較全範圍的流程圖。
10特別地，圖9示出了用於檢測和確定校準微粒的飛行時間、以及隨後基於計算得到的飛行 時間和流式細胞儀中詢問點的相對位置來精確定位和分配信號脈衝的一般過程。圖10示 出了可用於執行校準過程的示例性指令集。圖11示出了可用於基於參照圖10所描述的校 準過程將從多個詢問區域產生的脈衝與特定微粒相關聯的示例性指令集。需要注意的是， 此處描述的方法和系統不一定限於參照圖9-11所述的過程。特別地，在某些實施例中，這 些過程可包括沒有在流程圖中描述的附加步驟。此外，如下文所述，參照圖9-11所描述的 一個或多個過程是可選的，因而可以在某些實施例中省去。如圖9中的框80所示，此處描述的方法和系統可配置成從流式細胞儀的多個採集 器接收數據信號。此外，此處描述的方法和系統可設置成將在至少兩個採集器處接收的信 號和與特定微粒集(例如一個校準微粒集)相關聯的預定信號範圍進行比較，如框82中所 述。在某些情況下，與用於檢測校準微粒的參數無關的信號在這點處基本上可被忽略。更 具體地，不需要監控信號，更不用說存儲在內存中。這樣的情況可幫助減少流式細胞儀檢查 系統的處理和/或存儲器需求。在其他實施例中，與用於檢測校準微粒參數無關的信號可 被監控和/或存儲。在任一情況下，一旦檢測分別符合與校準微粒集相關聯的預定信號範圍內的信號 脈衝，就計算對應於兩個檢測信號的微粒的飛行時間。此處使用的術語「飛行時間」 一般是 指微粒穿過已知距離所花費的時間，諸如流式細胞儀中兩個詢問點之間的距離。在某些實 施例中，飛行時間僅包括從兩個檢測器接收的信號脈衝之間的時間差。在這些情況下，對應 於檢測器的兩個詢問點之間的已知距離通過流式細胞儀中的所有檢測器之間的相等間距 推出，或者通過流式細胞儀中的檢測器之間的已知成比例間距推出。在後面的實施例中， 「已知的成比例間距」一般是指連續排列的詢問點之間的距離彼此成比例。例如，參照圖4， 採集器58與52之間的間距用距離Y表示。代替在微粒流動通道44中等距，採集器54和 56可具有與相對距離Y成比例的間距。例如，採集器56可與採集器58相距1/2Y的間距， 而採集器54可以與採集器56相距2Y的間距。也可以考慮其他成比例距離，從而此處描述 的方法和系統並不限於上述示例。在另一些情況下，飛行時間可包括微粒速率。在這些實施例中，每個檢測器之間的 距離是已知的確定數值，不管每個檢測器之間的距離是相同還是不同。當詢問點在流式細 胞儀的整個詢問區中不是平均分布時、和/或所討論的詢問點不是連續排列在流式細胞儀 的詢問區內時，微粒速率的計算尤其適用(但不限於這些情況)。在某些情況下，框84中的信號脈衝檢測可包括將對應於兩個檢測信號的微粒識 別為特定微粒集中的微粒。在這些情況下，該方法可遵循兩個路線之一，這兩個路線中的一 個是確定微粒是否確實是框88-94所概述的特定微粒集中的部分，而另一個是跳過這些過 程和將該方法直接路由至框96和98，以給不同微粒集中的微粒分配其他信號脈衝。圖9包 括在框86和96之間的點劃線，表示後面的實施例是可選的。鑑於這兩個選擇，框82-86中 概述的過程和框82-94中概述的過程都可稱為使用具有唯一信號的校準微粒來校準流式 細胞儀，以確定流過流式細胞儀的微粒的飛行時間。選擇每種選擇的優點都將在下文中詳 細敘述。由於試樣中微粒聚集的敏感性，有可能參照框84所檢測的兩個信號是由於微粒 的聚集而不是校準微粒集中的單個微粒。假定根據流式細胞儀中微粒的流動速率和流式細胞儀的詢問點之間的間距，聚集微粒與單個微粒的速率之差略微相同，因此，微粒聚集的飛 行時間可用於將從多個詢問區域產生的脈衝與特定微粒相關聯。同樣，在某些實施例中，方 法直接繼續至框96和98，以將其他信號脈衝分配給不同微粒集的微粒，不管校準微粒或微 粒聚集是否已被檢測。這樣的選擇可避免驗證另一採集器處的檢測的額外步驟(下文參照 框88-94更詳細描述的過程)，因此，可簡化此處描述的方法和系統的程序指令。理論上也認為，在其他實施例中(一般是其中使用相關的較高速率和/或詢問點 之間的較窄間距的情況)，聚集微粒與單個微粒之間的速度差可能顯著不同。在這種情況 下，可根據微粒聚集計算出不準確的飛行時間，且關聯來自微粒聚集的脈衝可能不可行。同 樣，在某些實施例中，檢驗參照框84所檢測到的兩個信號是否確實是單個校準微粒是有利 的。在這種情況下，圖9中概述的過程路由至框88，以基於參照框86所描述的兩個數據信 號的檢測和計算出的飛行時間來計算在不同預定範圍內的數據信號在另一個採集器處產 生的時間點。具體而言，該時間根據計算出的飛行時間和對應於另一採集器的詢問點相對 於對應於兩個採集器的詢問點的位置的位置來計算。這樣的時間計算可針對相對於兩個或 多個用於識別校準微粒的詢問點定位於上遊或下遊的詢問點。在針對位於上遊的詢問點計 算該時間的情況下，此處描述的方法和系統可配置成存儲與其他詢問點相關聯的信號，然 後在兩個或多個詢問點處詢問校準微粒之後參照所存儲的信號，以確定校準微粒的識別。在任何情況下，用於驗證過程的採集器可包括任何信道，該信道設置成產生用於 區分單個微粒和微粒團的信號。設置成基於光從被分析物(例如DD信道)散射的光產生 信號的採集器是可行的，因為散射光一般表明物體的尺寸。如圖9的框90所示，確定來自 另一採集器的數據信號是否符合預設信號範圍。如框92所示，一旦從其他採集器採集的數 據信號不在不同的預設範圍內，則檢測到的兩個數據信號被拒絕為表示特定微粒集(即校 準微粒)的微粒，且過程返回框82以繼續將接收到的數據信號和與特定微粒集相關聯的預 定信號範圍進行比較。然而，一旦確定從另一採集器採集的數據信號在不同的預定範圍內， 則如框94中所示，驗證微粒被識別為特定微粒集的一部分。圖10說明了用於校準流式細胞儀的示例性流程圖，具體而言是識別校準微粒、計 算校準微粒的飛行時間、以及驗證校準微粒是單個微粒而不是微粒團。需要注意的是，圖10 是示例性的，從而可採用實現圖9的框80-84中所概述的過程的其他方式。例如，圖10特 別地要求計算用於計算微粒飛行時間的時間差(dt)。然而，如上所述，計算飛行時間可替代 地包括計算微粒速度。對圖10中所示指令的其它變化也可或替代地基於上述討論使用或 選擇使用。如圖10所示，校準過程包括讀取dt_calc_thresh0ld的框100。將這一過程與 圖9中的框82相關聯，參數「dt_calc_thresh0ld」指的是與專屬於用於校準流式細胞儀的 兩個或多個信道的校準集相關聯的預定信號範圍。對於圖10中所概述的實施例，將來自兩 個信道(稱為信道1和信道2)的信號與dt_calc_thresh0ld的值進行比較。如圖10中的框102和104所指出的，讀取來自信道1的信號並與該信道的dt_ calc_threshold進行比較。如果來自信道1的信號小於該信道的dt_calc_threshold，則 該過程返回框102以繼續檢測來自信道1的信號。但是，當來自信道1的信號大於或等於 該信道的dt_calc_thresh0ld時，該過程繼續到框106以將該信號的定時(即當前時間t) 賦值給變量1\。之後，在框108中讀取最小時間延遲(mirudelay)，並在框110確定當前時 間t是否等於或大於T1+最小時間延遲。一般而言，最小時間延遲表示基於流過流式細胞儀的預期流體流動速率和詢問點間距而預期出現在詢問點之間的最小時間量。考慮這樣的 延遲有助於避免可能在詢問點之間連續流動的不同校準微粒的檢測，而這將導致計算一個 錯誤的飛行時間。如圖10指出的，如果當前時間t不等於或不大於T1+最小延遲時間，那 麼過程將指回框110直到完成這樣的確定。此後，在框112，讀取從信道2產生的信號。至於信道1的框104和106，讀取從信 道2產生的信號並分別與框112和114處的信道的dt_calc_thresh0ld進行比較。如果來 自信道2的信號小於該信道的dt_calc_thresh0ld，則過程返回框112以繼續監控來自信道 2的信號。然而，當來自信道2的信號大於或等於該信道的dt_calc_thresh0ld時，該過程 繼續至框116以將該信號的定時(即當前時間t)賦值給變量T2。接著，在框118中產生信 號定時之間的時間差(dt)。然後，在框120中，通過從T1中減去時間差來計算不同預定範 圍內的數據信號在與信道1相等間距的另一個採集器(即信道0)處預期產生的時間(Ttl)。 如框122所示，讀取在時間(Ttl)在信道0中產生的信號。在框124中，確定信道0處產生的 信號是否有效(即符合信道0的校準微粒集的預定信號範圍)。一旦確定該信號無效，則過 程返回框102以試圖重新校準流式細胞儀。相反地，如果在信道0處產生的信號在確認飛 行時間校準微粒的可接受的界限內，那麼如框126所示，變量dt_valid被設定為1。當dt 計算出並有一個有效值的時候，dt_valid是一個為1的布爾變量，而當dt還沒計算出來的 時候，dt_valid為0。為清楚起見，用於圖10和11的流程圖的常量、變量和過程將在下文 中進行限定。返回圖9，不管識別校準微粒是通過框86-94驗證還是該過程從框86直接到框 96，如框96所示，此處描述的方法和系統都可設置成根據計算出的飛行時間和對應於採集 器的相應詢問點的相對位置來精確定位從各個採集器接收且在不同時間點產生的其他信 號脈衝。如框98所示，其他信號脈衝然後與不同微粒集的微粒相關聯。這種過程順序可選 擇地描述為將第一採集器的信道上的脈衝分配給特定微粒、根據飛行時間和對應於第一、 第二採集器的詢問點之間的間距識別在不同的第二採集器的信道上在一時間點產生的脈 衝、將該第二採集器的信道上的該脈衝分配給特定微粒。另外，方法和系統進一步包括根據 飛行時間和對應於第一、第二以及一個或多個其他採集器的詢問點的間距識別在一個或多 個其他採集器的信道上產生的脈衝、並將這一個或多個其他採集器的信道上的脈衝分配給 特定微粒。如圖9所示，該過程還可返回框96以識別從採集器接收的其他信號脈衝，並將 這些脈衝分配給微粒。此外，方法可繼續進行到框99，以基於相關信號脈衝確定微粒特徵。如上所述，相信在很多情況下，通過流式細胞儀的微粒速率的變化足以導致頻繁 的重新校準。同樣，如連接框98和82的箭頭所示，方法可包括在將相關信號脈衝分配給特 定微粒之後，使用流過流式細胞儀的不同校準微粒來重新校準流式細胞儀。需要注意的是， 這種重新校準過程可在通過檢測分別符合校準微粒集的預定信號範圍內的兩個信號脈衝 而檢測到校準微粒時自動啟動。在這檢測之前，信號脈衝的若干其他集合可被識別並分配 給微粒。也就是說，框96-99中概述的過程可不斷重複直到檢測到校準微粒。圖11示出用於基於計算的微粒的飛行時間和詢問點間的間距將從特定微粒的多 個詢問點產生的脈衝與特定微粒相關聯的示例性流程圖。需要注意的是，圖11是示例性 的，因此也可以使用實現圖9中的框96和98中概述的過程的其他方式。例如，圖11特別 要求使用相同的時間差(dt)來關聯在不同詢問點產生的脈衝，並因此呈現具有等距的詢
13問區的流式細胞儀配置。然而，如上所述，詢問點可選擇不均勻分布在詢問區中，因此用於 關聯脈衝的時間差在詢問點中可變化。基於上述討論，在圖11中給出的指令的其他變形同 樣可以選用或替代地採用。如圖11的框130所示，該過程可包括讀取通過圖10概述的過 程建立的布爾變量dt_valid。在框132中，確定dt_valid是否等於1，且如果dt_valid不 等於1，則過程行進至框134以運行dt^alculation過程，例如參照圖10所描述的過程。一旦確定dt_valid等於1，該過程進行至框136，在框136檢測到有效信號脈衝 (即在最小閾值之上的脈衝，其表明來自待測試樣中的微粒的任何子集都在對應於信道0 的詢問點處)。此後，在框138中發生時間延遲，因此當前時間t等於！；+dt (即在信道0 檢測到信號的時間加上流過流式細胞儀的校準微粒的飛行時間計算值)。在該時間延遲後， 信道1處的信號如框140中所示。在框142，進行與在信道1處讀取的信號相關的兩個確 定。具體而言，確定信號是否大於或等於「dt_calc_thresh0ld」(即與信道1專屬的校準微 粒集相關聯的預定信號範圍)或者確定信號是否小於「min_detect」(即表明來自被檢查的 試樣中的任何微粒子集中的至少一個微粒在與信道1相對應的詢問點處的最小閾值)。如果進行任意一個確定，該過程可返回框134以運行dt^alculation過程並建立 校準微粒的新飛行時間和相應的dt，以將多個詢問點處的脈衝與一個微粒相關聯。具體而 言，如果從信道1產生的信號大於或等於「dt_calc_thresh0ld」，則這樣的信號可表明校準 微粒或微粒團，因此可基於檢測到該信號而要求對流式細胞儀進行重新校準。相反的，如果 從信道1產生的信號小於mirudetect，則這樣的信號可表明流式細胞儀中的微粒的飛行時 間相對於針對通過詢問區的大多數最近的校準微粒確定的飛行時間已經變化，從而需要對 流式細胞儀進行重新校準。需要注意的是，代替在檢測到框142中給出的任一情形之後將 該過程返回框134以重新校準流式細胞儀，在某些實施例中，該方法可替代地返回框136， 並啟動檢測信道0上的有效信號的子過程。具體而言，可能需要在每次檢測到框142中給 出的情形之一時重新校準流式細胞儀。在某些實施例中，該過程的路線可基於框142中給 出的情形的檢測進行選擇。無論如何，當在框142中未檢測到兩種情況中的任一種時，該過程可繼續至框 146，並在框144規定的時間延遲後讀取信道2中產生的信號。如框148和150所示，這樣 的過程可能重複η次，η是流式細胞儀中詢問點的個數。在某些情況下，在讀取一個或多個 信道處的信號之後，決策框可納入該過程中，以確定信號是否如框142中描述地等於或大 於相應信道的mirudetect。如果信號小於mir^detect，這樣的信號可能表明流式細胞儀中 微粒的飛行時間相對於經確定的最近通過詢問區的大多數校準微粒的飛行時間已經發生 變化，並且因此，可能需要在這個點處進行再校準。這另外的過程沒有在圖11中示出以簡 化附圖，但是框146和148之間的三個連接點可推出這個結論。為了清楚說明，在圖11和 圖10中使用的常量、變量和過程將在下文進行定義。本領域技術人員在了解本發明內容的情況下將能理解，本發明旨在提供用於將從 流式細胞儀的多個詢問區域產生的脈衝與流過流式細胞儀的特定微粒相關聯的方法、存儲 介質和系統。根據本說明書，本發明的多個方面的進一步修改和替代實施例對本領域技術 人員將是顯而易見的。因此，這種描述被解釋為僅僅是說明性的，並且是為了教授本領域技 術人員執行本發明的一般方式。需要理解的是此處示出和描述的本發明的形式作為當前的 優選實施例。此處示出和描述的元件和材料可替換，部分和過程可顛倒，發明的特定零件可
14以單獨使用，這些對獲得本發明所描述的有益效果的本領域技術人員都是顯而易見的。在 不背離以下權利要求中描述的本發明的精神和範圍的情況下，此處描述的元件可以改變。變量和常量的定義以下是在圖10和11的流程圖中使用的常量和變量ChannelO (信道 0)Channell (信道 1)Channel2(信道 2)Channeln (信道 η)ChannelO_signal (信道 0_ 信號)Channel l_signal (信道 1_ 信號)Channe 12_signal (信道 2—信號)
這是「DD」的一般名稱。
這是「CL1」的一般名稱。
這是「CL2」的一般名稱。
這是表明檢測信道的數量不受限制的一般名稱。
這是被賦值信道0上的信號的幅度的變量。 這是被賦值信道1上的信號的幅度的變量。 這是被賦值到信道2上的信號的幅度的變量。mirudelay (最小_延遲)這是包含連續信道脈衝之間的最小延遲的常量。這個 常量的使用避免了對可能在詢問點之間連續流動的不同校準微粒的檢測。dt 微球在詢問點之間的穿行時間，因此也是連續信道上的脈衝之間的時間。dt_valid 布爾變量，其中1表示已經利用「dt_calculation」確定dt，而0說明 dt包含未知量，不能被信任。dt_calc_threshold 這是設定「信道1_信號」和「信道2_信號」必須跨越以被當 作校準微球體的閾值的常量。min_detect 最小閾值，其表明來自被檢查的試樣內的任何微粒子集的至少一個 微粒在詢問點處。t 包含運行時標的變量。T0 包含當「信道0_信號」跨越較低閾值時的時標的變量。T1 包含在過程dtjalculation」中使用的信道1峰值的時標的變量。T2 包含在過程「dtjalculation」中使用的信道2峰值的時標的變量。過程的定義此處所列是在圖10和11的流程圖中使用的過程Microsphere_peak_detect (微球_體峰_值檢測)關聯多個信道上的信號脈衝 以產生微球體檢測事件的過程。dt_calculation(dt_ 計算)計算 dt 並設置 dt_valid 為 1 的子過程。ChannelO_peak_detect (信道0_峰值_檢測)在信道0上尋找有效信號脈衝的 子過程。Channell_detect (信道1_檢測)在信道1上讀取信號的子過程。Channel2_detect (信道2—檢測)在信道2上讀取信號的子過程。Channeln_detect (信道n_檢測)在信道η上讀取信號的子過程。
權利要求
一種流式細胞儀，包括微粒流動通道；照明系統，所述照明系統被配置成將光導向所述微粒流動通道的多個不同詢問點；多個採集器，所述多個採集器分別被配置成從包括所述詢問點的詢問區域採集光，並進一步被設置成產生表示所採集的光的程度的信號；以及檢查系統，所述檢查系統包括處理器和可由所述處理器執行的程序指令，所述程序指令用於接收所述信號；將從至少兩個採集器接收的信號與和一特定微粒集相關的預定信號範圍進行比較；一旦檢測到分別符合所述預定信號範圍的信號脈衝，則識別所述特定微粒集的微粒；以及計算所述微粒的飛行時間。
2.如權利要求1所述的流式細胞儀，其特徵在於，所述檢查系統進一步包括可由所述 處理器執行的程序指令，所述程序指令用於根據所計算出的飛行時間和對應於所述採集器的相應詢問點的相對位置來精確定位 從所述採集器中的每一個接收並在不同時間點產生的其它信號脈衝；以及 將所述其它信號脈衝關聯到不同微粒集的微粒。
3.如權利要求2所述的流式細胞儀，其特徵在於，所述檢查系統進一步包括可由所述 處理器執行的程序指令，所述程序指令用於基於所述相關信號脈衝確定所述不同微粒集的 所述微粒的特徵。
4.如權利要求1所述的流式細胞儀，其特徵在於，所述檢查系統進一步包括可由所述 處理器執行的程序指令，所述程序指令用於一旦識別所述特定微粒集的微粒，就驗證從另 一採集器接收的數據信號在預設信號範圍內，其中從所述另一採集器接收的所述信號脈衝 在根據所計算的飛行時間和對應於所述另一採集器的詢問點相對於對應於所述兩個採集 器的詢問點的位置的位置的時間點處。
5.如權利要求1所述的流式細胞儀，其特徵在於，所述多個不同詢問點之間的距離已 知，並且其中所述檢查系統進一步包括可由所述處理器執行的程序指令，所述程序指令用 於確定所述微粒的速率。
6.如權利要求1所述的流式細胞儀，其特徵在於，所述多個不同詢問點沿所述微粒流 動通道等距。
7.如權利要求1所述的流式細胞儀，其特徵在於，所述多個不同詢問點沿所述微粒流 動通道不均勻分布。
8.如權利要求1所述的流式細胞儀，其特徵在於，對應於所述兩個採集器的所述兩個 詢問點沿所述微粒流動通道連續排列。
9.如權利要求1所述的流式細胞儀，其特徵在於，至少一個詢問點插入對應於所述兩 個採集器的所述兩個詢問點之間。
10.一種將從流式細胞儀中的多個詢問區域產生的脈衝關聯到一特定微粒的方法，包括使用具有獨特信號的校準微粒來校準所述流式細胞儀，以確定流過所述流式細胞儀的微粒的飛行時間；將第一採集器的信道上的脈衝分配給一特定微粒；根據所述飛行時間和對應於所述第一和不同的第二採集器的所述流式細胞儀的詢問 點之間的間距來識別在所述第二採集器的信道上在一時間點產生的脈衝；以及 將所述第二採集器的所述信道上的所述脈衝分配給所述特定微粒。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，進一步包括根據所述飛行時間和對應於所述第一、第二以及一個或多個採集器的詢問點的間距來 識別在一個或多個其他採集器的信道上在多個時間點產生的脈衝；以及將所述一個或多個其它採集器的信道上的所述脈衝分配給所述特定微粒。
12.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，進一步包括基於所分配的脈衝確定所述 微粒的特定特徵。
13.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，校準所述流式細胞儀的所述步驟包括詢 問所述流式細胞儀中的已知位置處的兩個或多個詢問點處的校準微粒。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，校準所述流式細胞儀的所述步驟進一步 包括詢問相對於所述兩個或多個詢問點位於上遊的另一個詢問點處的校準微粒； 存儲與另一詢問點相關聯的信號；以及在詢問所述兩個或多個詢問點處的校準微粒之後，參照所存儲的信號以確認對所述校 準微粒的識別。
15.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，進一步包括在校準所述流式細胞儀的所 述步驟之前，將具有多個校準微粒的複合試樣注入所述流式細胞儀中，其中所述複合試樣 包括足夠的微粒濃度，以使沿所述流式細胞儀的詢問區流動的微粒的間距等於或小於所述 詢問區內的至少某些詢問點之間的間距。
16.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述校準微粒的獨特信號包括閾值信號 值，所述閾值信號值高於為流過所述流式細胞儀的其它微粒集的相應信道而設置的信號範 圍。
17.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，進一步包括在將所述第一和第二採集器 的信道上的脈衝分配給所述特定微粒的所述步驟之後，使用流過所述流式細胞儀的不同校 準微粒重新校準所述流式細胞儀，其中重新校準所述流式細胞儀的所述步驟包括計算隨後 流過所述流式細胞儀的微粒的新飛行時間。
18.一種存儲介質，包括可由處理器執行的程序指令，所述程序指令用於 當微粒流過流式細胞儀時，監控對應於所述微粒的可測量參數的數據信號；檢測從所述流式細胞儀的不同採集器產生的兩個數據信號，其中所述兩個數據信號具 有分別符合特定微粒集的預定範圍的值；計算所檢測到的兩個數據信號之間的時間差；基於對所述兩個數據信號的檢測和計算得到的所述兩個數據信號的時間差，計算不同 預定範圍內的數據信號預期在另一採集器處產生的時間點；以及 隨後執行兩個決定性動作中的一個，所述兩個決定性動作包括 一旦確定從另一採集器採集的所述數據信號在不同的預定範圍內，就驗證所述特定微粒集中的微粒已被識別；以及一旦確定從另一採集器採集的所述數據信號不在不同的預定範圍內，就拒絕所檢測到 的兩個數據信號作為所述特定微粒集的微粒的代表。
19.如權利要求18所述的存儲介質，其特徵在於，所述數據信號從包括散射信號、報告 標籤信號、螢光信號、磁信號以及電磁諧振信號的組中選出。
20.如權利要求18所述的存儲介質，其特徵在於，所述兩個數據信號都是螢光信號。
21.如權利要求18所述的存儲介質，其特徵在於，從另一採集器採集的所述數據信號 是散射信號。
22.如權利要求18所述的存儲介質，其特徵在於，所述程序指令進一步可由所述處理 器執行，以用於一旦驗證所述特定微粒集的微粒已被識別，就根據所述微粒的飛行時間和對應於所述 不同採集器的相應詢問點的相對位置來檢測從所述不同採集器接收且在不同時間點產生 的其他信號脈衝；將所述其他信號脈衝關聯到不同微粒集中的微粒；以及基於所關聯的信號脈衝確定所述不同微粒集中的微粒的特徵。
全文摘要
提供將從流式細胞儀中的多個詢問區產生的脈衝與流過流式細胞儀的特定微粒相關聯的方法、存儲介質和系統。方法、存儲介質和系統的實施例包括用於利用具有唯一信號的校準微粒校準流式細胞儀以確定流過流式細胞儀的微粒的飛行時間的配置。基於所計算的飛行時間和與流式細胞儀的採集器相對應的詢問區的相對位置，所述方法、存儲介質和系統可進一步包括將其它信號脈衝關聯到一個或多個不同微粒集的微粒的配置。
文檔編號G01N15/10GK101965508SQ200880107435
公開日2011年2月2日 申請日期2008年9月17日 優先權日2007年9月17日
發明者A·R·希爾弗阿斯 申請人:盧米尼克斯股份有限公司