檢測megsin蛋白的方法及其應用的製作方法

2023-05-01 11:17:01 1

專利名稱：檢測megsin蛋白的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及評價腎功能的方法，其包括測定活體樣品，如尿液，血液等，中的megsin蛋白。此外，本發明涉及含抗megsin蛋白抗體的腎功能診斷試劑。
背景技術：
腎移植是治療晚期腎衰的唯一方法，此時腎的血過濾和解毒功能已完全衰竭。但是在日本，支持腎移植的腎源供應體系的建設很不完善。此外，移植方法本身的社會認同還處於一種初級階段，因此在現今的狀況下，只能以透析療法來進行腎移植治療。
如今，接受透析的病人數量估計約為170,000。每位患者平均每年的治療費用需要6百萬日圓，這被認為是給醫療保險制度增加壓力的最大原因之一。此外，每周2-3天，每天4-6小時的透析，大大地制約了患者參加社會活動。
腎衰是腎病的最終結局。導致腎衰的原因和發病過程不盡相同。有許多是由非腎源疾病導致的，如藥物中毒，傳染病，惡性腫瘤，糖尿病，系統性紅斑狼瘡(SLE)，都會導致腎障礙並最終導致腎衰。
腎障礙的顯著症狀只出現在晚期，即病情已惡化至接近腎衰時。因此，它們易被忽視，很多病例在症狀出現時腎臟已經發生不可逆性的損害。因此，在症狀出現前儘可能的早期發現腎障礙是非常重要的，這樣可以防止腎衰的發生，以減少對患者參加社會活動的制約，並進一步減少透析治療給社會醫療保險造成的財政負擔。
至今，被稱為尿分析的尿蛋白和尿沉積檢測廣泛應用於腎障礙的診斷。但是，即使在正常人中因劇烈運動，心理壓力，豐富的肉類膳食，月經前等也會出現暫時性的尿蛋白升高。在另一方面，有與腎疾病無關的尿蛋白，如主要見於青少年(正常健康人群中約有0.5％)中的體位性蛋白尿。在尿道疾病，膀胱疾病，女性生殖器疾病等情況下，也可檢測到尿蛋白。因此，只檢測尿蛋白很難確診腎障礙。
尿液離心後可用顯微鏡觀察到尿沉積。但是，在正常健康人的尿沉積中同樣可檢測到紅細胞沉積，這可能是來自於非腎障礙的其它的失調，比如那些與尿道相連的器官的失調。因此，尿沉積也不足以對腎障礙確診。
一種早期診斷糖尿病性腎病的方法包括，定量分析可作為糖尿病性腎病指標的滲入尿中的白蛋白含量，並將此含量與正常人的值進行比較，但即使正常人尿中白蛋白的含量也有波動，所以這種方法不能完全解釋糖尿病性腎病的準確狀態。
此外，可化驗血清肌酐(Cr)和血液尿素氮(BUN)以測定血液中尿成分的滯留，但此方法易受飲食影響。因此，從尿蛋白以及血清Cr和BUN中得到的異常值未必起因於腎障礙，因這些均常見於正常健康人或其它疾病的患者。
腎障礙還可通過測定各種物質，包括尿β2-微球蛋白、N-乙醯萄萄糖胺酶(NAG)、IgG、運鐵蛋白、白細胞介素-6、等來診斷。但是，在許多病例中這些檢測不能反映腎障礙的嚴重程度，並因此遠非有效。
而且，即使通過檢測尿液中的這些血液成分懷疑有全腎障礙或涉及免疫反應的疾病，仍很難鑑定腎組織內受到所述疾病影響的部位。除上述方法外，目前尚無方法能以足夠的敏感性和特異性來診斷腎病和確定其嚴重性。腎活檢的組織學診斷被認為是最終診斷並確定腎障礙及其嚴重程度所必需的。
但是，腎活檢是有創性檢查，常伴有併發症，比如出血，感染等。而且，要進行此類檢查，必須住進具有良好設備和專家的醫院，給患者帶來身體和社會的重負。
如上所述，通過尿分析的檢測是簡便易行的，同時也是處理大量尿樣的極好方法。但它遠不能滿足對腎障礙的確診。另一方面，腎活檢是診斷和確定腎障礙嚴重程度的可靠方法。但是它的使用受到高度限制，而且無法改進。因此，需要有一種既具有尿液分析的簡便性，又具有腎活檢的準確性的方法。
在特定組織，不限於腎，中特異性表達的蛋白常用作器官功能性紊亂的指標。例如，酶蛋白如LDH和γGTP廣泛用於肝功能的指標。但尚無一種腎特異性蛋白可作為腎功能的指標。
本發明人通過大量DNA序列分析和資料庫分析分離到一種在腎小球膜細胞中強效表達的被稱為megsin的基因。而且成功得到megsin蛋白，其含有由megsin全長cDNA克隆編碼的380個胺基酸。本發明人使用Swiss Prot資料庫按FASTA程序進行胺基酸同源性檢索(T.Miyata等，臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.)，120828-836(1998))發現人megsin蛋白屬於SERPIN(絲氨酸蛋白酶抑制劑)超家族(R.Carrell等，Trends Biochem.Sci.，1020(1985)；R.Carrell等，冷泉港Symp.Quant.Biol.，52527(1987)；E.K.O.Kruithof等，血液，864007(1995)；J.Potempa等，生物化學雜誌，26915957(1994)；E.Remold-O』Donnell，FEBS Let.，315105(1993))。這些發現均見專利申請(PCT/JP98/04269)。
人megsin蛋白在人成纖維細胞，平滑肌細胞，內皮細胞，和角質化細胞中弱表達，而在腎小球膜細胞中表達很強。IgA腎病患者和正常健康個體間對腎組織中megsin蛋白表達水平的比較揭示，在IgA腎病患者中megsin蛋白表達水平顯著較高。因此，尿液或血液中的megsin蛋白可作為腎小球膜細胞增生性腎病(例如，IgA腎病等腎病)的一種標記物。megsin蛋白的基因表達有可能與腎病的發生和進程密切相關。但是至今還不清楚megsin蛋白基因表達與腎病進展的關係。

發明內容
本發明的一個目的是解決上述問題，並且提供一種診斷腎病和確定其嚴重程度的方法，以及提供用於此方法的試劑和試劑盒。
首先，本發明人認為為了對腎病確診並確定其嚴重程度，測定與疾病程度相關的特異蛋白是必需的。因此至力於研究存在於腎小球中的腎小球膜細胞。腎小球膜位於腎小球毛細血管叢(glmomerlar tuft)中的小葉中央，是一種能作為核心將各小葉連接在一起的組織。腎小球膜為腎小球基底膜覆蓋。它由腎小球膜細胞(與毛細血管腔之間隔著內皮細胞)和腎小球膜基質(與3層腎小球基底膜中的內透明層連接的無定形物質)構成。
腎小球膜細胞在維持腎小球的結構和功能中起著關鍵作用。它們的增殖被認為是腎小球疾病，如腎小球腎炎和腎小球硬化症發病的主要因素。此外，腎小球膜細胞是所有類型的腎炎破壞的靶。例如，腎小球膜細胞的增殖和細胞外腎小球膜基質的積累被認為是各種腎小球疾病(如慢性腎小球腎炎和糖尿病性腎炎這兩種導致末期腎衰的主要病因)患者的腎小球硬化症發展的第一步(D.Schlondorff，Kidney Int.，491583-1585，(1996)；R.B.Sterzel等，腎小球膜細胞，免疫性腎病，595-626(1997))。因此，鑑定在腎小球膜細胞中特異性表達的基因並闡明其表達調節與腎病之間的相關性，有助於闡明腎小球膜細胞的生物學特性及腎小球膜細胞相關疾病的病因，並由此治療或診斷腎小球膜細胞相關疾病。
有報導類固醇試劑對於伴有腎小球膜細胞極度增殖的IgA腎病是有效的(J.V.Donadio等，J.Am.Soc.Nephrol.81324-1332(1997))。但是，類固醇試劑的使用經常引起嚴重的副作用，所以，應避免對類固醇試劑無效型IgA腎病無目的地給與類固醇試劑。因此，類固醇治療必需與組織損傷的嚴重程度如腎小球膜細胞的增殖相關，相應地，長期存在能簡便評價腎小球膜細胞增殖程度的腎功能檢查方法。
本發明人認為megsin蛋白的基因表達增加與腎病的發生和發展有關，這種增加使megsin蛋白產量的增加，由此導致megsin蛋白滲漏至尿液和血液中，其滲漏量與病情的進展相關。為證實此機理，發明人試圖測定和比較在各種活體樣品中megsin蛋白的濃度或含量，並因此通過測定megsin蛋白的濃度或含量來評價與megsin蛋白相關的腎病，以此完成本發明。因此，本發明涉及一種評價腎功能的方法，以及用於此方法的試劑或試劑盒，如下所列(1)一種評價腎功能的方法，其包含測定活體樣品中的megsin蛋白；(2)(1)所述腎功能評價法，其包含測定活體樣品中的megsin蛋白，以及將其與正常樣本中megsin蛋白的測定值進行對比；(3)(1)所述腎功能評價法，其中的活體樣品是尿液；(4)(1)所述腎功能評價法，其中通過採用抗megsin蛋白抗體經抗原抗體反應測定活體樣品中的megsin蛋白；(5)(4)所述腎功能評價法，其中抗megsin蛋白抗體是單克隆抗體；(6)腎功能診斷試劑，其包含抗megsin蛋白抗體；(7)(6)所述腎功能診斷試劑，其中抗megsin蛋白抗體是單克隆抗體；(8)檢測活體樣品中megsin蛋白的顆粒，其中此種顆粒包含固體顆粒，抗megsin蛋白抗體附著在其表面；(9)(8)所述megsin蛋白檢測顆粒，其中固體顆粒具有磁性；
(10)(8)所述megsin蛋白檢測顆粒，其中固體顆粒的相對密度不小於1；(11)(8所述megsin蛋白檢測顆粒，其中抗megsin蛋白抗體是單克隆抗體；(12)檢測活體樣品中megsin蛋白的方法，包含下列步驟i)將megsin蛋白檢測顆粒與活體樣品，所述顆粒包含固體顆粒，其表面結合有抗megsin蛋白第一抗體；ii)將偶聯標記分子的抗megsin蛋白第二抗體與已接觸了活體樣品的megsin蛋白檢測顆粒接觸；iii)檢測通過抗megsin蛋白第二抗體結合至megsin蛋白的標記分子；(13)(12)所述檢測方法，其中抗megsin蛋白第一抗體和抗megsin蛋白第二抗體都是單克隆抗體；(14)(13)所述檢測的方法，其中抗megsin蛋白第一抗體和抗megsin蛋白第二抗體具有不同識別位點；(15)(12)中所述的檢測方法，其中的活體樣品是尿液；(16)(12)中所述的檢測方法，其中的活體樣品是血液；(17)用於檢測megsin蛋白的試劑盒，其中包含下列部件(a)可結合抗megsin蛋白抗體的磁性固體顆粒，(b)抗megsin蛋白抗體，可以預先結合至所述磁性固體顆粒上，或可以間接附著其上，及(c)磁體(18)(17)中所述用於megsin蛋白檢測的試劑盒，進一步含有結合了標記分子的抗megsin蛋白抗體。
如上所述，megsin蛋白被分離為由高度表達於人腎小球膜細胞中的基因編碼的蛋白。本發明的megsin蛋白不只包含具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的蛋白質(人megsin蛋白)，還包括與其功能等價的蛋白質。例如，來自非人的其它物種的megsin蛋白同系物可以稱為是與其功能等價的蛋白質。其它實例有這些同系物的前體和片段。megsin蛋白-蛋白酶複合物也可作為腎功能的指標，只要其可以在活體樣品中檢測。來自非人物種的megsin蛋白同系物可作為評價相關物種中腎功能的指標。故，它們可用於理解腎功能紊亂模型中的疾病狀態。
可如下得到非人物種megsin蛋白同系物首先，根據編碼人megsin蛋白(SEQ ID NO1)的cDNA序列，設計對應於ORF起點和終點的簡併引物，利用該引物經PCR擴增同源cDNA。如果擴增的cDNA不是全長cDNA，再根據5』RACE等方法確定其上遊鹼基序列。例如，用提取自培養的腎小球膜細胞的mRNA作為大鼠模板進行RT-PCR。所用簡併引物可以是，例如，具有下列鹼基序列的寡核苷酸。大鼠的megsin蛋白同系物的部分結構可通過對這類PCR方法所得克隆的序列測定而揭示。
簡併引物FYGTGAATGCTGTGTACTTAAAGGC AANTGN/SEQ IDNO3(對應於172VNAVYFKGK180)簡併引物R21AANAGRAANGGRTCNGC/SEQ ID NO4(其中R是A或G，該引物對應於357ADHPFLF363)但是，用這組引物對只能擴增所述cDNA的一部分，為得到5』區域，必需從大鼠megsin蛋白的克隆片段製備基因特異引物，用它們進行再次簡併PCR。所用引物的鹼基序列(對應於megsin蛋白的N末端胺基酸序列)如下所示簡併引物 RM-CtermC1ATGGCNTCNGCNGCNGCNGCNAAYGC/SEQ ID NO5(其中Y是T或C；該引物對應於編碼megsin蛋白N-末端的序列)RM-MR-A2CGACCTCCAGAGGCAATTCCAGAGAGATCAGCCCTGG/SEQ ID NO6RM-MR-A1GTCTTCCAAGCCTACAGATTTCAAGTGGCTCCTC/SEQ ID NO7(兩者均為大鼠megsin蛋白特異性反向引物)通過將得到的PCR產物插入pGEM-T-easy載體(Promega)以測定鹼基序列，可以得到編碼所述大鼠同系物的cDNA的3』區域。最後，根據如上所得鹼基序列設計引物，通過5』RACE和3』RACE可以測定編碼所述同系物的全長cDNA的鹼基序列。兩個基因特異性反義引物，即RM-PR01GCTCAGGGCAGTGAA GATGCTCAGGGAAGA/SEQ ID NO8和RM-PR02CTGACGTGCACAGT CACCTCGAGCACC/SEQ ID NO9可用於大鼠中的5』RACE。另一方面，基因特異性有義引物RM-MR-S3GAGGTCTCAGAAGAAGGCACTGAGGCAACTGCTGCC/SEQ ID NO10可用於3』-RACE中。用同樣方法可分離小鼠的同系物。依照上面的方法，可以測定大鼠和小鼠的megsin cDNA序列，它們分別如SEQ ID NO18(大鼠)和SEQ ID NO20(小鼠)所示。
本發明用於測定megsin蛋白的方法沒有限定。例如，利用megsin蛋白抗體和megsin蛋白間的免疫反應的免疫分析，其特異性和靈敏性甚佳。這類實例有免疫沉澱，放射免疫分析，免疫螢光分析，酶免疫分析，化學發光試驗，和免疫組化。此外，megsin蛋白可利用抗megsin蛋白抗體通過Western印跡法測定。這些免疫分析可以組合，比如在免疫沉澱後進行Western印跡。這些試驗方法為本技術領域所熟知。
免疫組化染色法是使本發明抗體與分離的人體細胞或其破碎細胞液、組織或其破碎組織液、血清、胸膜積液、腹水、淚液等反應，進一步與經過異硫氰酸螢光素(FITC)等螢光物質或過氧化物酶等酶標記的抗小鼠IgG抗體或其結合片段反應，再用顯微鏡觀察。也可利用生物素化的抗體與鏈黴抗生物素蛋白結合型標記物質的結合對每一標記物質進行間接標記。此外，由於megsin蛋白是一種蛋白酶抑制劑，可藉助其對蛋白酶的抑制活性作為指標來對其進行檢測。或者，可利用megsin蛋白對蛋白酶的親和性對其進行檢測。
對megsin蛋白免疫分析而言所必需的抗體的來源或其製備方法不限，只要其能識別檢測對象，即megsin蛋白即可。因此，可以使用多克隆抗體，單克隆抗體，及其混合物等。此外，也可僅用含抗體分子可變區的片段。抗megsin蛋白抗體可如下得到。例如，本發明所用抗體包含抗具有SEQ IDNO2所示胺基酸序列的蛋白的抗體。抗megsin蛋白或其部分胺基酸序列的抗體(例如，多克隆抗體或單克隆抗體)或抗血清可按照傳統的抗體或抗血清製備方法製備，用作抗原的有，megsin蛋白、包含其部分胺基酸序列的寡肽、以及融合蛋白，比如c-myc-(His)6-Tag-megsin蛋白和MBP-megsin蛋白。例如，單克隆抗體可按下列方法製備。如果使用帶部分胺基酸序列的合成肽作為免疫原，優選儘量使用對megsin蛋白特異性的高度親水性胺基酸序列。這樣的胺基酸序列包括SEQ ID NO11到17，它們都用於實施例中。在這些序列中，表示為SEQ ID NO12(人)，SEQ ID NO14(人)，或SEQ ID NO17(大鼠)的胺基酸序列尤其產生對腎小球組織有較好反應性的抗體。
本發明的megsin蛋白或具有該megsin蛋白部分胺基酸序列的合成肽，可單獨或與載體或稀釋劑一起給藥於溫血動物體內能產生抗體的部位。用作免疫原的合成肽為與載體蛋白，如牛甲狀腺球蛋白和匙孔血藍蛋白相結合的肽形式。為提高抗體的生產，可將弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑與抗原一起給藥。每1到6周免疫一次，共免疫約2到10次。可用的溫血動物如，猴，兔，狗，豚鼠，小鼠，大鼠，綿羊，山羊，和家禽，優選小鼠或大鼠。單克隆抗體生成細胞可如下製備選擇已免疫的具有可檢測的抗體滴度的溫血動物(如小鼠)，在末次免疫的2到5天後，取動物的脾或淋巴結，使這些組織中的抗體生成細胞與骨髓瘤細胞融合，得到能產生單克隆抗體的雜交瘤。使下述標記的megsin蛋白與抗血清反應，並測定與抗體結合的標記的活性，由此可測定抗血清中的抗體滴度。
本發明中不與除megsin蛋白以外的蛋白質發生交叉反應的單克隆抗體可通過選擇能識別megsin蛋白特異性表位的抗體而得到。一般地，特異於所述蛋白的表位在該蛋白的胺基酸序列中包含至少7個或更多連續的胺基酸殘基，優選10到20個胺基酸。因此，例如，識別含以下肽的表位，並包含至少7個連續胺基酸殘基的單克隆抗體可以是megsin蛋白特異性單克隆抗體，所述肽具有選自SEQ ID NO2(人)、SEQ ID NO19(大鼠)，或SEQID NO21(小鼠)所示的胺基酸序列。可篩選在SEQ ID NO2，SEQ ID NO19(大鼠)，或SEQ ID NO21(小鼠)的胺基酸序列中保守的序列以選出megsin蛋白家族的通用表位。如果一個區域包含特異於所有序列的胺基酸序列，可挑選出能識別不同物種的單克隆抗體。
抗MEGSIN蛋白單克隆抗體可按照免疫球蛋白的分離和純化方法分離和純化，與多克隆抗體的分離和純化相似。公知的純化方法包括，例如，鹽析，醇沉澱，等電點沉澱，電泳，離子交換劑(如DEAE)的吸附和解吸，超速離心，凝膠過濾，或排它性收集抗體的特異性純化方法，例如用抗原結合固相或活性吸附劑，如蛋白A或蛋白G，收集抗體，然後使所述結合分離而得到抗體的方法。
以這種方式得到的可識別本發明megsin蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，可用於診斷和治療腎小球膜細胞相關疾病。使用這些抗體測定megsin蛋白的方法有夾心法，其包括使megsin蛋白與結合在固相載體上的抗體或標記的抗體反應，然後檢測此反應產生的夾心複合物中的MEGSIN蛋白；或競爭法，其包括使標記的人尿源megsin蛋白和受檢標本中人尿源megsin蛋白與抗體進行競爭性反應，根據與抗體反應的標記抗原的量可以測定受檢標本中的人尿源megsin蛋白。
通過夾心法測定人尿源megsin蛋白可分兩步或一步進行，其中兩步法是使固相抗體與人尿源megsin蛋白反應，未反應的物質經過洗滌完全除去，再加入標記的抗體形成固相抗體-標記的人尿源megsin蛋白抗體複合物；一步法是使固相抗體，標記的抗體，和人尿源MEGSIN蛋白同時混合在一起。
適用於該試驗的固相載體有聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯酸酯、尼龍、聚縮醛、氟樹脂等合成樹脂，纖維素，瓊脂糖等多糖，玻璃，金屬等。固相載體的形狀可以是多樣的，有顆粒狀，盤狀，球形，纖維狀，棒狀，板狀，容器形式，小格，試管等。吸附有抗體的載體可(適當)加入防腐劑，如疊氮鈉，應冷藏保存。
另一方面，已知固體顆粒可作為試劑用於評價人類精子的授精能力。這些顆粒表面結合了一種單克隆抗體，該抗體能與已發生頂體反應的人類精子特異性反應(日本專利第2651249號)。這種用於檢測精子授精能力的顆粒是一種固體顆粒，其結合有能與已發生頂體反應之人類精子特異性反應的單克隆抗體。通過使精子與所述顆粒反應，並計數與所述顆粒結合的精子，來評價人類精子的授精能力。授精能力無需使用複雜技術如放射活性、螢光等便可準確、簡單且不費時地檢測。由於磁性固體顆粒可利用磁體輕易聚集，故可用於測定小量樣品的量。本發明人發現，可利用此技術更簡便準確地檢測megsin蛋白。
抗體可用已知的化學結合或物理吸附方法固相化。化學結合方法有，應用戊二醛的方法，應用N-琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯，N-琥珀醯亞胺基-2-馬來醯亞胺乙酸酯等的馬來醯亞胺法，以及應用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸化物的碳二亞胺法等。其它的例子有，馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯法，N-琥珀亞胺基-3-(2-二硫代吡啶基)丙酸酯法，雙重氮化(bisdiazolated)聯苯胺法，二棕櫚基賴氨酸法。或者先使兩種有著不同表位的抗體與待檢物質反應形成複合物，然後用經上述方法固定的第三抗體捕獲所述複合物。
對所述標記無限制，只要其可用於免疫分析。具體地說，可以使用酶，螢光物質，發光物質，放射性物質，金屬螯合物等。優選的標記酶有，例如，過氧化物酶，鹼性磷酸酶，β-D-半乳糖苷酶，蘋果酸脫氫酶，葡萄球菌核酸酶，Δ-5-類固醇異構酶，α-甘油磷酸脫氫酶，丙糖磷酸異構酶，辣根過氧化物酶，天冬醯胺酶，葡萄糖氧化酶，核糖核酸酶，尿素酶，過氧化氫酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，葡糖澱粉酶，和乙醯膽鹼酯酶等。優選的螢光物質包括，例如，異硫氰酸螢光素，藻膽蛋白，羅丹明，藻紅蛋白，藻青蛋白，別藻青蛋白，和鄰苯二甲醛等。優選發光物質包括，例如，異魯米諾，硝酸雙-N-甲基吖啶(lucigenin)，魯米諾，芳香族吖啶鎓酯，咪唑，吖啶鎓鹽，及其修飾的酯，蟲螢光素，螢光素酶，和水母發光蛋白。優選放射性物質包括，例如，125I，127I，131I，14C，3H，32P，35S等。
將上述標記物與抗體結合的方法眾所周知。具體地說，有直接標記和間接標記。通常使用的直接標記法是使用交聯劑將抗體或抗體片段化學共價結合到標記上。交聯劑包括N，N』-鄰亞苯基雙馬來醯亞胺，4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷酸N-琥珀醯亞胺酯，6-馬來醯亞胺己酯·N-琥珀醯亞胺酯，4，4』-二硫代嘧啶，以及其它已知的交聯劑。可按照交聯劑的特性，採用已知的方法使之與酶和抗體反應。間接標記法的例子包括首先使低分子量半抗原如生物素，二硝基苯，吡哆醛或螢光胺與抗體結合，再用該半抗原的結合配對物間接標記該抗體。抗生物素蛋白和鏈黴抗生物素蛋白可用作生物素的識別配體，而二硝基苯，吡哆醛，或螢光胺可用識別這些半抗原的抗體標記。
辣根過氧化物酶可用作標記抗體的酶。使用此酶是因為它可與多種底物反應並且通過過碘酸鹽氧化方法輕易附著在抗體上。偶爾可將抗體片段，例如，Fab』，Fab，F(ab』)2用作抗體。多克隆和單克隆抗體都可用同樣的方法進行酶標記。採用上述交聯劑得到的酶標抗體可由已知方法如親和層析等純化。以便用作更為靈敏的免疫分析系統。純化的酶標抗體加入防腐劑如硫柳汞，穩定劑如甘油，然後保存。標記的抗體可以凍幹並在涼爽陰暗的地方長期保存。
當標記試劑為酶時，可使用其底物，必要時還使用一種顯色劑來測定其活性。當過氧化物酶用作酶時，H2O2用作底物溶液，2，2』-連氮-二[3-乙基苯並噻唑啉磺酸]銨鹽(ABTS)，5-氨基水楊酸，鄰苯二胺，4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)，或3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺等用作顯色劑。當鹼性磷酸酶用作此酶時，鄰硝基苯磷酸酯鹽，對硝基苯磷酸酯鹽等可用作底物。當β-D-半乳糖苷酶用作酶時，螢光素-二(β-D-半乳糖吡喃糖苷)，4-甲基傘形酮基(methylumbelliferyl)-β-D-半乳糖吡喃糖苷等可用作底物。本發明也包括用於megsin蛋白的免疫分析試劑，其包括標記的或固定化的單克隆或多克隆抗體。本發明進一步包括含有所述試劑、用於標記檢測的指示劑、以及對照樣品的試劑盒。
任何活體樣品如體液包括血漿，血清，血液，尿液，組織液，或腦脊髓液等，只要含有megsin蛋白或其前體或片段，都可用作檢測本發明的megsin蛋白的樣本。在這些活體樣品中，隨著腎小球膜細胞的增殖和活化，可在尿液中以高頻率檢測出megsin蛋白。因此，尿液中megsin蛋白的檢測可用作腎小球膜增生性腎病，如IgA腎病的標記(marker)。
這裡的腎功能評價指充分了解作為構成腎組織之重要細胞的腎小球膜細胞的狀況，也指是否存在引起腎小球膜細胞異常的腎病以及其嚴重程度。本發明所說的腎疾病包括導致腎小球膜細胞異常的任何疾病。具體地說，包括IgA腎病，急性腎小球腎炎，腎小球局灶硬化(focal sclerosingglomerulopathy)，膜增生性腎小球腎炎，糖尿病腎炎，狼瘡性腎炎等。受到這些腎病影響的腎功能變化狀況可以由本發明方法進行評價。在上述這些疾病中，用於評價腎功能的本方法尤其有效於指示腎小球膜細胞增生性腎病，如IgA腎病。而且，本發明用於評價腎功能的方法不僅可用於診斷腎病的存在或其嚴重程度，還可以評價治療效果或預後判斷。另外，本發明用於評價腎功能的方法對尿蛋白檢查顯示陽性的尿樣測定megsin蛋白的含量可以排除非於腎小球膜細胞增殖的疾病，象急性腎盂腎炎，慢性腎盂腎炎，隱匿性腎病症候群(minimal-change nephritic syndrome)，慢性腎小球腎炎，腎澱粉樣變性病等。
按照本發明評價腎功能的方法，獲得要進行腎功能檢測的個體的活體樣品，依照上述方法測定其中的megsin蛋白濃度。優選地，根據測定的濃度和體積確定megsin蛋白含量，並與正常人進行對比。為計算尿液試樣的megsin蛋白含量，收集一天中所有尿液並測定其尿量。這樣，可以確定一整天的尿液中的megsin蛋白含量。可選地，即使在偶爾採取尿樣的情況下，也可用肌酸酐校正來推測其含量。術語「肌酸酐校正」是指根據肌酸酐濃度校正由於尿中含量的變化對目標成分的稀釋(或濃縮)的影響。每日排洩到尿液中的肌酸酐量是固定的。基於此事實，偶爾收集的尿液佔每日總尿量的百分比可以從肌酸酐濃度求出，還可將同一尿液中目標成分的濃度換算為每天的總排洩量。或者，可用通常用於腎功能診斷的體重校正方法預測血液中的含量。體重校正方法是根據從採血個體的體重預計的體積來計算血液成分的量。
或者，可在一定時間內通過觀察某個體活體樣品中的megsin蛋白濃度變化追蹤腎功能的變化，不必再轉換成量。或者先設定特定物種或人種等群體的體液中megsin蛋白濃度的正常值，然後將某個體的megsin蛋白濃度(或含量)與該正常值進行比較，從而確定腎功能是否異常。
本發明所用活體樣品可以是尿液或血液。更優選尿液，因為收集尿液不會對身體造成損傷，且可直接反映取樣時的腎功能狀況，。儘管收集血液會造成一些創傷，但由於megsin蛋白是腎特異性蛋白，其測定值的變化與腎功能異常密切相關。故，用血液和尿液中的megsin蛋白含量作為腎功能的指標可獲得較高特異性。與現今廣泛採用的用尿蛋白為標誌來篩查腎功能疾病的方法相比，利用megsin蛋白作指標可獲得具有更高敏感性和特異性的篩選方法。一種通過測定尿液中megsin蛋白而評價腎功能的方法詳述於下，該方法的基礎是用單克隆抗體經免疫學方法測定megsin蛋白。
(A)抗體的製備(1)動物的免疫以及抗體生成細胞的製備可如下免疫動物。哺乳動物，如大鼠，小鼠等，用按照傳統方法(例如，T.Miyata等，臨床研究雜誌.，120828-836(1998))純化的人megsin蛋白免疫。優選對細胞融合所用無限增殖細胞的來源動物品系進行免疫。例如，優選8-10周齡的小鼠，雌雄均可。免疫如下進行(1)純化的人megsin蛋白與合適的佐劑(例如，弗氏完全佐劑，氫氧化鋁膠百日咳疫苗等)混合為乳劑，(2)以皮下，腹膜內，靜脈等方式給藥至動物。重複此免疫過程2-5次，每次間隔1-2周。末次免疫為對動物腹膜內給藥0.5-2μg的人megsin蛋白。從如此免疫的動物體液得到多克隆抗體。在每次免疫的3-7天後，從眼底靜脈叢採血，血清抗體滴度由下述的蛋白A玫瑰花結試驗(歐洲免疫學雜誌，4500-507(1974))測定。在抗體滴度足夠高時收穫抗體或抗體生成細胞。
蛋白A玫瑰花結試驗如下進行72孔Terasaki板(Falcon)用人成紅細胞系K562(日本癌症研究來源庫(JCRS))包被；加入用PBS(磷酸氫二鈉2.90g，磷酸氫鉀0.20g，氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，蒸餾水1L)稀釋的標本；將平板於CO2保溫箱中37℃靜置30分鐘；用PBS洗孔；加入用蛋白A包被的綿羊紅細胞(Amersha Pharmacia Biotech)；顯微鏡觀察花結的形成。
從上述人megsin蛋白免疫的動物可獲得抗體生成細胞。抗體生成細胞可從脾，淋巴結，外周血等獲得。但是，特別優選脾。例如，在末次免疫的3-4天後，無菌摘除脾，在極限必需培養基(MEM)(用水製藥)中切碎，用鑷子剝離組織和細胞，經1,200rpm離心5分鐘後，棄去上清。沉澱用Tris-HCl緩衝液(pH7.65)處理1-2分鐘，去除紅細胞。用MEM洗滌三遍，得到用於細胞融合的脾細胞。
(2)無限增殖細胞的製備具有無限增殖能力的任何細胞都可用作融合中的無限增殖細胞。一般使用骨髓瘤細胞。優選採用抗體生成細胞的同類型細胞。例如，以小鼠為例，已知下列細胞係為8-氮鳥嘌呤抗性小鼠(BALB/c)的骨髓瘤細胞系。
P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(Current.Topics in Microbiol.Immunol.，811-7，(1978))，P3/NS1/1-Ag4-1(NS-1)(歐洲免疫學雜誌，6511-519，(1976))，SP2/0-Ag14(SP-2)(自然，276269-270，(1978))，P3-X63-Ag8653(653)(免疫學雜誌，1231548-1550，(1979)，P3-X63-Ag8(X63)(自然，256495-497，(1975))將這些無限增殖細胞系在8-氮鳥嘌呤培養基中傳代(普通培養基，在RPMI-1640培養基中添加穀氨醯胺(1.5mM)，2-巰基乙醇(5×10-5M)，慶大黴素(10μg/ml)，胎牛血清(FCS，CLS)(10％)，進一步在這個普通培養基中加入8-氮鳥嘌呤(15μg/mM))，在細胞融合前於普通培養基中傳代培養3-4天以確保在細胞融合當天細胞數量達到2×107個以上。
(3)細胞融合細胞融合可如下進行。培養孔用MEM培養基或PBS充分洗滌後，使(1)中所得抗體生成細胞與在(2)中製備的無限增殖細胞以5-10∶1的比例混合。1,200rpm離心5分鐘後，棄去上清，使沉澱的細胞充分分離。細胞以0.1-1.0mL/108加入到含1-4g聚乙二醇-1000(PEG-1000)，1-4mL MEM培養基，0.5-1.0mL二甲亞碸的混合物中，在攪拌融合細胞時保持混合物在37℃。然後，每隔10分鐘向混合物中添加3mL MEM培養基進行稀釋，通過多次添加MEM至總量為50mL來終止細胞融合反應。接著，離心(1,500×5分鐘)後棄去上清，輕敲細胞，加入100mL普通培養基(RPMI-1640培養基，10％FCS)，用刻度移液管輕輕吹打使細胞懸浮。96孔板每孔分配100μL懸浮液，在5％CO2培養箱中37℃孵育3-5天。培養板每孔加入100μL HAT培養基(補充了次黃嘌呤(10-4M)，胸腺嘧啶脫氧核苷(1.5×10-5M)，氨基喋呤(4×10-7M)的普通培養基)，再孵育3天。其後，每三天棄去培養液上清的一半，加入等量的HAT培養基。在5％CO2培養箱中37℃繼續孵育約2周。
(4)雜交瘤的篩選和克隆在已觀察到融合細胞生長菌落的孔中棄去一半的上清，加入等量的HT培養基(無氨基喋呤的HAT培養基)，將細胞孵育4天。取部分培養上清液，採用上述的蛋白A玫瑰花結試驗測定抗megsin蛋白的抗體滴度。抗體滴度也可採用如下的其它方法測定。例如，將雜交瘤培養上清液加入到固相(如微量滴定板)上，megsin蛋白直接或與載體一起吸附於該固相上；加入用放射性物質或酶標記的抗免疫球蛋白抗體(如果用於細胞融合的細胞來自小鼠時，則使用抗小鼠免疫球蛋白抗體)或蛋白A；檢測附著於該固相上的抗-megsin蛋白單克隆抗體。抗體滴度測定方法還有將雜交瘤培養上清液加至吸附了抗免疫球蛋白抗體或蛋白A的固相上；加入以放射性物質或酶等標記的megsin蛋白；檢測附著於該固相上的抗-megsin蛋白單克隆抗體。
對觀察到有與megsin蛋白反應的抗體產生的孔通過有限稀釋的方法重複進行4次克隆，挑選megsin蛋白抗體滴度穩定的細胞系作為能產生抗megsin蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
(5)單克隆抗體的製備通過體外或體內培養所得雜交瘤可產生單克隆抗體。當進行體內培養時，可將雜交瘤移植至任意動物上。優選使用與用於細胞融合的脾細胞來源相同的動物。例如，可將(4)中得到的2-4×106個能產生抗megsin蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞腹膜內給藥至已用降植烷處理過(在腹膜內給藥0.5mL 2，6，10，14-四甲基十五烷-降植烷後培養2周)的8-10周齡BALB/c雌性小鼠。2-3周後，由於內臟腔內腹水的積累小鼠腹部膨大，該腹水中含高濃度的單克隆抗體。收集腹水，離心(3,000rpm×5分鐘)除去固體物質，純化IgG。另一方面，雜交瘤可以無血清體外培養，合適量的抗體分泌到上清液中。腹水或培養上清液用50％硫酸銨鹽析，然後對PBS透析1-2周。使透析過的級分通過蛋白A Sepharose凝膠柱，收集IgG級分得到純化的單克隆抗體。
抗體同種型的測定依照Ouchterlony方法(雙向免疫擴散試驗)(免疫學實驗入門，生物化學實驗15，學會出版中心，74頁(1981))。採用Folin法以及280nm處光吸收值(1.4(OD280)＝免疫球蛋白1mg/mL)求出蛋白含量。
(6)單克隆抗體的鑑定上述得到的單克隆抗體可如下鑑定(1)利用人類淋巴細胞衍生的細胞系如HSB-2，K562等進行免疫沉澱反應，這些細胞表面已用碘標記(免疫學雜誌，1382850-3855(1987))；(2)用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)(免疫學雜誌，1422743-2750(1989))。
(7)標記的單克隆抗體的製備所得純化的單克隆抗體可利用戊二醛法(免疫化學，643(1969))，過碘酸法(組織化學和細胞化學雜誌，22，1084(1974))，馬來醯亞胺法(生物化學雜誌，79233(1976))，吡啶基二硫化物法(生物化學雜誌，173723(1978))等進行酶標記。
例如，如下進行過碘酸法(1)過碘酸(38.5mg/mL)攪拌加入到過氧化物酶溶液(4mg/mL)中；(2)室溫下反應20分鐘；(3)用1mM乙酸緩衝液(pH4.5)更換PD-10(Amersham Pharmacia Biotech)緩衝液；(4)加入40μL 0.2M氫氧化鈉；(5)加入已對10mM碳酸緩衝液(pH9.5)透析的10mg單克隆抗體；(6)室溫下反應2小時；(7)反應完成後，混合物冰上冷卻；(8)加入100μL硼氫化鈉(4mg/mL)溶液，反應2小時；(9)將PD-10換為PBS；(10)3,000rpm離心30分鐘；(11)上清液採用Sephacryl S200 HR26×30(Amersham PharmaciaBiotech)凝膠過濾；(12)通過測定403和280nm處的吸光值得到標記的單克隆抗體級分；(13)將牛血清白蛋白(10mg/mL)加入到該級分中；(14)-20℃保存，使用前用PBS-吐溫(商標)20稀釋。
(B)製備檢測用顆粒本文用於檢測的顆粒可通過將抗megsin蛋白單克隆抗體經物理或化學方法結合到合適的顆粒如層析所用凝膠上而製備。本發明中將抗體結合至化學活化顆粒的方法因具有預期的結合穩定性而為優選。具體如，將本發明所用抗體結合至已被對甲苯磺醯氯活化而甲苯磺醯化的顆粒的方法。
所用顆粒材料可用玻璃，瓊脂糖，Sepharose，瓊脂糖填充型多孔硅藻土，親水性共聚丙烯酸凝膠，聚苯乙烯等製備。使用磁性顆粒可利用磁體吸引顆粒，從而測定微量樣品。例如，將可以磁化的物質(如Fe2O3)放入顆粒核心中，可以使顆粒超順磁化。這類顆粒作為免疫學分析的固相有售。這類顆粒要採取適合的形狀，如球形，不定形斷面等，但優選球形顆粒。顆粒大小不限，如平均粒徑可以是5-1000μm。此外，使用比重大於反應液(約1)的顆粒易於收集，其效果與使用磁性顆粒的近似。此外，使用較大比重的顆粒對與易於脫離的抗體結合更有利，因為收集顆粒時可以採用較溫和的離心條件。
抗megsin蛋白抗體可通過直接或間接方式結合到顆粒上。例如，如果使用小鼠單克隆抗體作為抗體，可將能識別小鼠IgG的抗體結合到顆粒上，從而使小鼠抗體間接結合於顆粒上。這樣的抗體稱為第二抗體。除了第二抗體外，利用蛋白A或蛋白G(它們結合免疫球蛋白恆定區)，或利用生物素化抗體捕獲與抗生物素蛋白結合的顆粒等也可完成間接結合。為使第二抗體、蛋白A或蛋白G化學結合到顆粒上，優選在進行結合前活化顆粒。能將蛋白偶聯至顆粒的任何活化方法都可以選擇作為顆粒的活化方法。這樣的活化方法包括，甲苯磺醯氯法，溴化氰法，溴乙醯法，戊二醛法等。也有市售的活化顆粒。這些活化顆粒的活化和與蛋白，如第二抗體，蛋白A，蛋白G等的結合，可按照傳統方法進行。
另外，已偶聯至第二抗體，蛋白A，蛋白G等的顆粒也有售。已知市售的顆粒如下所示。
DynabeadsTMM-450，M-280，Veritas提供，Dynal Japan進口綿羊抗小鼠IgG包被型山羊抗小鼠IgG包被型綿羊抗大鼠IgG包被型綿羊抗家兔IgG包被型Polyscience公司山羊抗小鼠IgG(H和L鏈)羧化珠山羊抗家兔IgG(H和L鏈)羧化珠蛋白A羧化珠山羊抗家兔IgG(H和L鏈)微磁顆粒山羊抗家兔IgG(H和L鏈)微磁顆粒蛋白A微磁顆粒綿羊抗小鼠IgG(H和L鏈)微磁顆粒本發明抗體與上述顆粒的結合可如下進行(1)用蛋白溶液處理懸浮於合適培養基中的顆粒以阻止非特異性結合，(2)混合含抗體的腹水或純化的抗體溶液。
(C)檢測方法本發明的檢測方法是收集受檢者血液或尿液，離心後取上清作為樣品。離心尿液可分離沉渣，靜置尿液上清，或使用經過濾除去沉渣的尿液。使利用上面製備的檢測顆粒所稀釋的標樣與在(7)中得到的標記抗體混合，室溫下孵育2小時。反應結束後，洗滌混合物，加入底物溶液進行顯色反應。然後，混合物離心除去顆粒，上清轉移到微量滴定板上，測定吸光度。採自正常人的標樣也按照同樣的方法檢測，對比吸光度。可以僅比較megsin蛋白的濃度，以及比較體液中megsin蛋白的絕對含量(通過乘以個體的體液體積即可得到)，或依據其它類似校正值來比較。
(D)試劑盒用於進行上述實驗的材料可以作為試劑盒提供。該試劑盒可以包括檢測顆粒(已如上述偶聯了抗體)和磁體。它也可包括結合有標記分子的抗體。此外，本發明的試劑盒還包括試管，離心管，其它類似容器，移液管或其它吸取裝置，或顯微鏡。此外，可組合檢測標記所必需的酶底物，依據陽性或陰性標準品。可用能作為上述檢測顆粒之原料固體顆粒和抗體替代檢測顆粒。本發明參考以下實施例詳述，但不限於此。


圖1表示採用作為抗原的合成肽-2的特異性多克隆抗體進行Western印跡的結果，該肽具有megsin蛋白的部分胺基酸序列(SEQ ID NO12)。每一條帶表示如下1；MBP2MBP-megsin蛋白3His-megsin蛋白4MBP-PAI II5在CHO細胞中表達的megsin蛋白6用megsin蛋白基因轉染的重組病毒感染的蠶的體液
7megsin蛋白基因轉染前的病毒載體感染的蠶的體液8未感染病毒的蠶的體液9正常人血清圖2表示採用作為抗原的合成肽-3的特異性多克隆抗體進行Western印跡的結果，該肽具有megsin蛋白的部分胺基酸序列(SEQ ID NO13)。每一條帶表示的蛋白同圖1。
圖3表示採用作為抗原的合成肽-342的特異性多克隆抗體進行Western印跡的結果，該肽具有megsin蛋白的部分胺基酸序列(SEQ ID NO15)。每一條帶表示的蛋白同圖1。
圖4表示採用作為抗原的MBP-megsin蛋白的特異性多克隆抗體進行Western印跡的結果。每一條帶表示的蛋白同圖1。
圖5顯示了尿megsin蛋白的ELISA檢測結果。縱軸表示megsin蛋白檢測值(肌酸酐比例AU)。樣品來自健康人(16份樣品)，IgA腎病患者(24份樣品)，隱匿性腎病症候群患者(24份樣品)。
圖6表示了尿megsin蛋白的Western印跡檢測結果。每一條帶表示如下1MBP-megsin蛋白2-5健康人的濃縮尿液6-7IgA腎病患者的濃縮尿液圖7表示IgA腎病患者腎組織的免疫染色的顯微照片。
圖8表示健康人腎組織免疫染色的顯微照片。I為放大33倍，II-IV放大80倍。
圖9表示健康人的腎，肝，脾組織免疫染色的顯微照片。V放大倍數為33倍的照片，VI是80倍，VII和VIII是40倍。
圖10表示用大鼠megsin肽-2抗體對正常大鼠的腎，肝，脾組織進行免疫染色的顯微照片。I和II為放大倍數100倍的照片，III和IV是40倍。
圖11表示通過免疫沉澱法檢測megsin蛋白的結果。
泳道1抗-megsin肽-2抗體(-)泳道2抗-megsin肽-2抗體(+)泳道3分子量標記物圖12表示使用CHO-megsin或MBP-megsin作為抗原並使用抗-megsin肽-2抗體的ELISA結果。縱軸表示492nm的吸光度，橫軸表示抗原濃度(μg/mL)。
圖13表示使用CHO-megsin或MBP-megsin作為抗原並使用抗-megsin肽-4(257-272)抗體的ELISA結果。縱軸表示492nm的吸光度，橫軸表示抗原濃度(μg/mL)。
實施本發明的最佳模式[實施例1]腎小球膜細胞從寶公司(日本東京)購入的人腎小球膜細胞和CHO(中國倉鼠卵巢細胞)在含有10％胎牛血清的Dulbecco’s改良型Eagle’s培養基中，5％CO2培養箱37℃下培養。將人腎小球膜細胞傳7-10代後用於下面的實驗。
抗megsin蛋白合成肽多克隆抗體的製備採用與絲氨酸蛋白酶抑制劑家族其它成員的同源性低且具有親水性的區域作為免疫原，製備抗megsin蛋白多克隆抗體。具體地說，挑選帶有人megsin(SEQ ID NO2)和大鼠megsin(SEQ ID NO19)的下列胺基酸序列的多肽作為免疫原距N-末端的位置 胺基酸序列SEQ ID NO/No.
16-30 FREMDDNQGNGNVFF 11/172-86 SQSGLQSQLKRVFSD 12/2339-354ATGSNIVEKQLPQSTL 13/3257-272NLMEWTNPRRMTSKYV 14/4342-356SNIVEKQLPQSTLFR 15/34274-87 LGLQYQLKRVLAD 16/rat1341-354ESNIVEKLLPESTV17/rat2具有上述胺基酸序列並在N-末端附著了一個C(對肽3而言是在其C-末端)的肽段在自動合成儀432A型(Perkin Elmer，Foster City，CA)上合成。合成肽經反相HPLC純化後，凍幹，用於競爭實驗以確認免疫力和免疫學特異性。
這些合成肽各通過N-(6-馬來醯亞胺基己醯氧基)琥珀醯亞胺(同仁化學研究所監製)與牛甲狀腺球蛋白(Sigmar)結合，對0.85％NaCl溶液透析，與佐劑(Difco)充分混合為乳劑，皮下注射家兔。第一次注射(20μg/兔)三周後，進行第二次免疫(50μg/兔)，此後，每二周一次共進行4次免疫(50,100,200μg/兔)。弗氏完全佐劑只用於第一次免疫，此後，使用弗氏不完全佐劑。在41和55天後，通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)評價血清抗體滴度，以確認採血得到的血清能與合成肽反應。為進行首次反應，在96孔板的每一已預先固定了50ng抗原的孔中加入100μL連續稀釋的抗血清。洗板後，在第二次反應中使HRP偶聯型山羊抗兔IgG(Cappel)與之反應。洗滌後，採用鄰苯二胺(和光純藥)為底物進行顯色反應，在492nm測定吸光度。抗體滴度的增長得以確認。
抗megsin蛋白合成肽的多克隆抗體的純化按照傳統方法(細胞工程學增編(實驗講義系列)抗肽實驗講義，秀潤社，日本)通過免疫親和層析純化megsin蛋白合成肽的多克隆抗體。更具體地，此方法如下進行1)將每一合成肽固定到FMP(2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸)活化的Cellulofine(生化學工業)上以製備親和柱；2)用PBS(一)稀釋表現出抗體滴度增長的兔血清，使用肽柱親和純化該抗體。通過Western印跡(圖1-4)確認純化抗體與megsin蛋白融合蛋白的反應，從而證明得到的純化抗體是megsin蛋白特異性抗體。
抗大鼠megsin合成肽的抗體的製備使每種大鼠megsin合成肽附著於匙孔血藍蛋白(KLH)(Calbiochem-Novabiochem，La-Jolla，CA)。即，懸浮在0.05M磷酸鈉緩衝液(pH7.2)中的KLH與溶解於二甲基甲醯胺中的間馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)室溫下攪拌30分鐘。反應液用0.05M磷酸鈉緩衝液(pH6.0)透析，然後作為KLH-MB使用。然後，將上述的肽懸浮於蒸餾水中，並與所得KLH-MB一起保溫。加入一半的0.2M磷酸氫二鈉到KLH-MB並在室溫下攪拌3小時。反應之後，用磷酸鈉緩衝液透析，最後凍幹。
用所得KLH偶聯型合成肽和佐劑免疫家兔。弗氏完全佐劑(FCA)(DIFCO Laboratories，USA)只用於第一次免疫，弗氏不完全佐劑(DIFCOLaboratories，USA)用於隨後的免疫。以2-3周的間隔免疫5次。使用蛋白A親和柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)從抗血清中純化IgG。在兔免疫前也獲取血清，以同樣方式純化IgG。
兔多克隆抗megsin肽IgG反應性的研究兔IgG(以megsin肽作為免疫原產生的)的反應性採用下列多種蛋白作為抗原進行研究。如下製備MBP-megsin蛋白和His-megsin蛋白1)根據SEQID NO1所示megsin基因的鹼基序列經PCR擴增編碼區域；2)將擴增產物插入到麥芽糖結合蛋白融合蛋白表達載體pMAL-c(New England Biolab)以得到表達MBP與megsin蛋白的融合蛋白的載體；3)用此載體轉化大腸桿菌；接著4)利用直鏈澱粉等經親和層析從破碎細胞液中純化表達產物，得到MBP-megsin蛋白。為得到His-megsin蛋白，構建融合蛋白表達載體，其在載體ptrcHisA(Invitrogen)(其以與組氨酸標籤的融合蛋白形式表達所插入的基因)中包含上述megsin基因。用此載體轉化大腸桿菌JM109，經IPTG誘導表達後，從破碎細胞液經鎳柱等純化融合蛋白形式的His-megsin蛋白。
然後，使重組megsin如下在CHO細胞中表達。通過利用PCR引入突變，將c-myc標籤和組氨酸標籤連接到megsin cDNA全長編碼區的N-末端。將標籤偶聯型megsin cDNA克隆至哺乳動物表達載體pREP9(Invitrogen)。採用LipofectAMINE(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)將含有人megsin cDNA的pREP9轉化至CHO細胞(105細胞)，該細胞已在6孔板上於37℃，5％CO2培養箱中進行了培養。用0.5mg/ml焦硫酸遺傳黴素(和光純藥)篩選穩定的轉化體。然後，用(His)6親和柱從培養上清液中純化c-myc-組氨酸標籤偶聯型megsin重組體(CHO megsin)。
被megsin蛋白(+)病毒感染的蠶的體液指依照已知方法(普通病毒學雜誌783073-3080(1979))用已引入megsin基因的病毒感染的蠶的體液。另一方面，被megsin蛋白(-)病毒感染的蠶的體液是指用不含megsin基因的病毒感染的蠶的體液。設計這些megsin重組體所必需的megsin編碼基因可利用腎小球膜細胞的mRNA為模板經PCR合成，或從本發明人構建的megsin基因克隆載體(保藏號FERM BP-6518)得到。
觀察對纖溶酶原激活劑抑制因子-1，MBP-纖溶酶原激活劑抑制因子-2融合蛋白(MBP-PAI II)，等等的反應性。挑選這些蛋白以確認抗體的交叉反應性，它們與megsin蛋白有一定程度的同源性。
MBP-megsin蛋白，His-megsin蛋白，
MBP-PAI II，PAII，在CHO細胞中表達的megsin蛋白，megsin蛋白(+)病毒感染的蠶的體液megsin蛋白(-)病毒感染的蠶的體液未經病毒感染的蠶的體液，以及人血清白蛋白。
每一蛋白溶液用同樣量的樣品緩衝液(0.25％Tris-HCl，2％SDS，30％甘油，10％β-巰基乙醇，0.025％溴酚藍)(第一化學藥品)處理，100℃加熱5分鐘，蛋白用4-20％的梯度膠經SDS-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)(Laemmli，U.K.，自然，227680-685(1970))分離。經SDS-PAGE分離的蛋白通過100V恆定電壓1小時印跡在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(BioRad)上，使用的印跡液為25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH8.3。已印跡的PVDF膜用蒸餾水洗後，在含5％Block Ace的TTBS液中封閉3小時。PVDF膜用TTBS(20mM Tris，500mM NaCl，0.05％吐溫20，pH7.5)洗後，4℃下與第一抗體，即稀釋在TTBS中的兔多克隆抗megsin肽IgG，反應過夜。然後，用擴增的鹼性磷酸酶免疫印跡試劑盒(Amplified Alkaline PhosphataseImmuneblot Kit)(BioRad)檢測。就是說，首先與TTBS稀釋的生物素化山羊抗家兔IgG一起室溫下孵育1小時，接著與鏈黴抗生物素蛋白-生物素化鹼性磷酸酶複合物反應，該複合物事先由鏈黴抗生物素蛋白和生物素化鹼性磷酸酶室溫下孵育1小時而製備。PVDF膜在TTBS中洗滌，然後和底物(氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯，甲苯胺溶液)室溫下孵育約30分鐘，使與第一抗體結合的抗體顯色。通過與足量蒸餾水充分反應而終止該反應。
結果見圖1-4。各圖中參與反應的抗體是以下列物質為免疫原得到的。
圖1.免疫原megsin肽-2圖2.免疫原megsin肽-3圖3.免疫原megsin肽-342，和圖4.免疫原MBP-megsin蛋白[實施例6]親和純化的抗megsin肽IgG的酶標記藉助市售標記試劑盒(AP標記試劑盒Boehringer-Mannheim)遵循試劑盒上的指示，用鹼性磷酸酶標記實施例3得到的親和純化的抗megsin肽IgG。藉助另一標記試劑盒(ECL蛋白生物素標記組件Amersham PharmaciaBiotech)遵循試劑盒上的指示進行生物素標記。
尿中megsin蛋白的ELISA檢測來自16例健康人，24例IgA腎病患者，和24例隱匿型腎病症候群患者的尿液經離心排除不溶性物質。再用截留分子量為5,000的超濾膜(Ultarafree，Millipore)將其濃縮。用兔多克隆抗-megsin肽-2-IgG包被96孔ELISA板各孔。每孔加120μL PBS(-)，接著加入120μL濃縮尿液，4℃靜置過夜。用PBS(-)洗孔，加入Block Ace(大日本製藥)室溫下封閉2小時。各孔再用含0.05％(w/v)吐溫20(和光純藥)的PBS(-)洗，加入鹼性磷酸酶標記的兔多克隆抗-megsin肽-1抗體，室溫下靜置1小時。用吐溫-PBS洗後，每孔中加入100μL顯色底物溶液(1mg/mL鄰苯二胺(和光純藥)-1M 二乙醇胺(和光純藥)緩衝液(pH9.8))。室溫下反應後，用50μL/孔1N氫氧化鈉終止反應，用微滴板讀取儀(Spectra MAX250，Moleculare Devices)讀取405nm的吸光度。從標準曲線確定尿液中megsin蛋白濃度。用市售肌酸酐檢測試劑(用於自動分析儀「Dia」-Crea，Dia Pharmaceutical)測定同一尿樣中的肌酸酐濃度，將megsin蛋白量校正為肌酸酐比例。結果如圖5所示。健康人和IgA腎病患者間(p＜0.001)，或IgA腎病患者和隱匿型腎病症候群患者間(p＜0.001)，觀察到megsin蛋白濃度的顯著差異。
由於觀察到健康人和IgA腎病患者間megsin蛋白濃度的顯著差異，通過測定尿中magsin蛋白可以確定腎病的發生。此外，由於IgA腎病患者和隱匿型腎病症候群患者間的顯著差異，表明依照本發明測定尿megsin蛋白可以區分這些疾病。這兩種疾病用尿蛋白作為指標進行傳統篩選時無法區分，因為它們都顯示陽性結果。
此外，與沒有進行肌酸酐校正的尿megsin蛋白濃度相比，儘管megsin蛋白濃度易於在腎病患者出現且其值很高，僅少量病例難以證明統計學上的顯著差異。故按本發明測定尿中megsin蛋白時，優選通過諸如肌酸酐校正等方法比較含量。
採用Western印跡檢測並定量尿中megsin蛋白將採自8個健康人和9個IgA腎病患者的尿樣離心，棄去不溶物後，用截留分子量5,000(Ultrafree，Millipore)的超濾膜濃縮。用等量的樣品緩衝液(0.25％Tris-HCl，2％SDS，30％甘油，10％β-巰基乙醇，0.025％溴酚藍)(第一化學藥品)處理濃縮尿液，100℃加熱5分鐘，然後在4-20％的梯度膠(第一化學藥品)上經SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(Laemmli，U.K.(1970)自然227，680-685)分離。SDS-PAGE分離所得蛋白用100V恆定電壓經1小時印跡在聚偏二氟乙烯膜(BioRad)上，所用印跡液為25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH8.3。已印跡的PVDF膜用蒸餾水洗後，在含5％Block Ace的TTBS液中封閉3小時。PVDF膜用TTBS(20mM Tris，500mM NaCl，0.05％吐溫20，pH7.5)洗，4℃稀釋在TTBS中的家兔多克隆抗megsin肽IgG(第一抗體)反應過夜。
然後，用擴增的鹼性磷酸酶免疫印跡試劑盒(BioRad)檢測。即，首先與TTBS稀釋的生物素化山羊抗家兔IgG一起室溫下孵育1小時，接著與鏈黴抗生物素蛋白-生物素化鹼性磷酸酶複合物反應，該複合物由鏈黴抗生物素蛋白和生物素化鹼性磷酸酶室溫下孵育1小時而製備。PVDF膜在TTBS中洗滌，然後和底物(氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，甲苯胺溶液)室溫下孵育約30分鐘，使與第一抗體結合的抗體顯色。通過與足量蒸餾水充分反應來終止反應。使用電泳圖像處理儀(AE-6920M-05，Atto)和電泳位置圖像分析軟體(AE-6920WSE/MSE，Atto)定量分析顯色的凝膠區帶。結果(電泳圖譜)如圖6所示。圖象分析儀的測定如下。與健康人濃縮尿液的區帶相比，可觀察到IgA腎病患者的區帶較緻密。可見，通過定量分析這些區帶的密度可定量測定megsin蛋白。
圖象分析儀的測定結果泳道測定結果1分子量標記物28.535.2413.854.8632.8715.1 製備檢測顆粒本發明的檢測顆粒可通過將抗megsin肽IgG經由抗小鼠IgG抗體偶聯至市售磁性顆粒而獲得。甲苯磺醯活化型DynabeadsTMM-450(勻質甲苯磺醯活化型順磁聚苯乙烯顆粒Dynal Biotech)用作本發明顆粒，其1mM鹽酸液經無菌蒸餾水洗一次，然後用0.2M硼酸緩衝液(pH9.5)洗一次。接著將抗megsin肽IgG抗體溶於0.2M硼酸緩衝液(pH9.5)中至濃度150μg/mL，然後將此溶液加至等量活化型顆粒懸浮液(抗體/顆粒＝75μg/15mg)中。接著使混合物在22℃溫和攪拌24小時。用磁體收集抗體偶聯型顆粒，棄去上清，留下吸附在磁體上的顆粒。顆粒按照如下順序清洗(1)用5mL 0.1M PBS(pH7.0)洗滌10分鐘，(2)用5mL 1M乙醇胺-HCl(pH 9.5)洗滌2小時，(3)用含0.1M氯化鈉，0.1％牛血清白蛋白(BSA)，0.1％吐溫20的5mL0.05M Tris(pH7.5)洗滌12小時，(4)用不含吐溫20的如(3)所述緩衝液5mL洗滌2小時。
此後，用磁體收集顆粒，棄去上清，將顆粒懸浮在含10％Block Ace的PBS(-)/BSA中至4×108顆粒/mL(30mg/mL)的濃度。所得IgG偶聯型顆粒可在4℃下保持穩定至少6個月。
通過磁性顆粒方法測定尿中megsin蛋白利用實施例9中製備的抗體偶聯型顆粒經磁性顆粒法測定偶爾採集的尿樣中的megsin蛋白濃度，這些尿樣來自12例健康人和24例患有不同腎病的患者，其中12例為IgG腎病患者，另12例為隱匿型腎病症候群患者。尿樣保存於-80℃，測定前解凍。將它們於3,000rpm下離心5分鐘，取上清作樣品。如下測定500,000偶聯了第一抗體(家兔多克隆抗megsin肽-2抗體)的磁性顆粒放入已用Block Ace(大日本製藥)封閉的試管(1.5ml)中。每種尿樣取500μL與等量的鹼性磷酸酶標記型家兔多克隆抗megsin肽-1抗體的PBS(-)液混合，室溫下旋轉2小時。然後，3,000rpm離心5分鐘後，用磁體吸住顆粒，棄去上清，加入1mL洗液(含0.05％(w/v)吐溫20(和光純藥)的PBS(-)(pH7.4)(吐溫-PBS))，攪拌洗滌顆粒共4次，然後加入100μL底物溶液，攪拌下反應20到30分鐘。含有1mg/mL鄰苯二胺(和光純藥)的1M二乙醇胺(和光純藥)緩衝液(pH9.8)用作底物溶液。反應完成後，用50μL 1N氫氧化鈉終止反應，在450nm下測定吸光度。從標準曲線計算尿megsin蛋白濃度。如實施例7所述測定同一尿樣中的肌酸酐濃度，將megsin蛋白濃度校正為肌酸酐比例。
依照測定結果，與健康人的相比，IgA腎病患者的尿megsin蛋白測定值(肌酸酐校正值AU)分布在上部區域。此外，IgA腎病患者的尿megsin蛋白測定值也比隱匿型腎病症候群患者的高。故根據本發明，不僅可判斷某人是否患由腎病，而且可以準確確定腎病的狀態。
使用megsin肽抗體對腎組織進行免疫組化染色3例IgA腎病患者(2位男性，1位女性年齡21-48歲)經同意取其腎組織。從腎腫瘤患者手術切除的腎組織中取無腫瘤組織用作正常腎組織樣品。提供正常腎組織的患者尿液未見異常，從組織學角度排除腎小球表現異常者。經患者同意，從其體內取除腎以外的其它組織作為對照。又從正常Wister系大鼠(雄性，8周齡)取腎和其它器官。
腎組織按照傳統方法包埋在冰凍組織包埋劑(O.C.T.化合物)中。使用冷凍切片機從冷凍包埋組織上切下4μm的冷凍切片。將這些冷凍切片用3-氨基丙基乙氧基矽烷(Sigma)包埋在載玻片上(用4％多聚甲醛固定15分鐘)。
冷凍切片用含0.5％吐溫20的PBS洗滌，以4％脫脂牛奶封閉，與抗megsin肽-2抗體和抗megsin肽-4抗體一起在溼容器中4℃孵育過夜。以1∶100稀釋的過氧化物酶標記型山羊抗家兔IgG抗體(DAKO)洗滌組織切片並室溫下孵育2小時。使用含有0.003％充氧水的3，3』-二氨基聯苯胺檢測過氧化物酶。以蘇木精染色細胞核。遵循傳統方法進行蘇木精/伊紅染色。
IgA腎病患者腎組織免疫組化染色的顯微照片(ECLIPSE E40080倍放大，Nikon)如圖7所示。圖中顯示，在人腎小球組織中有一個可用本發明的肽抗體染色的位點。尤其是，在腎小球膜細胞內和腎小球膜基質內觀察到顯著的陽性染色，但是腎小管沒有被染色。
人腎組織腎小球可被人megsin肽-2抗體染色(圖8-I和8-II)，或可被人megsin肽-4抗體染色(圖9-V和9-VI)。尤其是，可在腎小球膜區觀察到顯著的陽性染色。在另一方面，腎組織間隙未被人megsin肽-4抗體染色(圖8-I)。肝組織(圖9-VII)，脾組織(圖9-VIII)，胰腺組織，心臟，和主動脈組織也未被人megsin肽-2抗體染色(未列出數據)。由於過量megsin肽-2完全抑制了組織染色，故免疫染色的特異性可以得到確認(圖8-IV)。用免疫前的家兔IgG檢測不到免疫反應(圖8-III)。此外，與megsin肽-2抗體和megsin肽抗體-4相比，用抗megsin肽-1或megsin肽-3的抗體不能在人腎組織的腎小球上進行特異性免疫染色(未列出數據)。
用megsin蛋白(大鼠megsin肽-2；圖10-I)通過免疫染色同樣可以在大鼠腎組織的腎小球觀察到陽性結果。在腎間質，肝組織(圖10-III)，或脾組織(圖10-IV)觀察不到反應。通過先與大鼠megsin肽-2一起孵育，對大鼠腎組織的免疫反應得到抑制(圖10-II)。用免疫前的家兔IgG，或用抗大鼠megsin肽-1的抗體檢測不到免疫反應(未列出數據)。
免疫沉澱反應嘗試檢測megsin蛋白以確認在人腎小球膜細胞中megsin蛋白的存在。即用[35S]甲硫氨酸實施免疫沉澱反應(T.Minori等，生物化學雜誌259560(1984))，所得免疫複合物經SDS-PAGE和放射自顯影進行分析。
首先，將腎小球膜細胞在標記培養基(含10％熱滅活的胎牛血清和[35S]甲硫氨酸(3.7Mbq/mL)的DMEM)中37℃、5％CO2培養箱培養16小時，使所有蛋白成分被標記。
接著，細胞用冷PBS洗滌，懸浮於200μL TSA(Tris-HCl緩衝液(pH8.0)，0.14M氯化鈉，0.025％疊氮鈉)中，該緩衝液含1％Triton X-100，1％牛血紅蛋白，1mM碘乙醯胺，0.2U/mL抑酶肽，1mM PMSF(苯甲基磺醯氟)。4℃下1小時靜置後，4℃下100,000×g離心1小時得到裂解物。
使放射性標記的抗原(105-106cpm)與1μL實施例2及實施例3所得抗megsin肽-2多克隆抗體(0.7mg/mL)4℃下孵育90分鐘。
添加蛋白G-sepharose(Pharmacia Biotech)後進一步4℃下孵育90分鐘以沉澱免疫複合物。沉澱物用含0.1％Trition X-100和0.1％牛血紅蛋白的TSA洗滌3次，再用0.05M Tris-HCl緩衝液(pH6.8)洗滌一次。
將已洗滌的免疫沉澱物懸浮於30μL樣品緩衝液(0.5M Tris-HCl緩衝液(pH6.8)，10％SDS，β-巰基乙醇，甘油，1％BPB)中，煮沸5分鐘。以旋渦混合器混合使之懸浮，混合物200×g離心1分鐘。上清液按照傳統方法進行SDS電泳和放射自顯影分析。14C-甲基化蛋白混合物(分子量依次為220，97.4，66，46，30kDa；Amersham International)用作分子量標記。結果於圖11所示。在50kDa的分子量標記附近觀察到被抗megsin肽-2抗體特異性識別的多肽(第二道中指示為「meg」的條帶)。
megsin的ELISA檢測對表達於CHO細胞的megsin蛋白(CHO-megsin蛋白T.Miyata等，臨床研究雜誌120828-836(1998)；PCT/JP98/04269)和實施例5所述的MBP-megsin蛋白實施ELISA檢測。
純化的CHO-megsin蛋白溶液(50μL/孔)用50mM碳酸緩衝液(pH9.6)逐步稀釋，然後加至96孔ELISA板上，4℃過夜。每孔經PBS洗滌後，加350μLBlock Ace(大日本製藥)室溫封閉2小時。然後，每孔用含0.05％吐溫20的PBS(吐溫-PBS)洗滌。實施例2和3中得到的抗megsin肽-2多克隆抗體和抗megsin肽-4多克隆抗體用吐溫-PBS稀釋後每孔加入50μL，室溫靜置1小時。每孔用吐溫-PBS洗滌，加入生物素化抗家兔IgG(Cappel)，4℃靜置過夜，用吐溫-PBS洗滌。
每孔加入過氧化物酶標記的鏈黴抗生物素蛋白溶液(Amersham)，室溫靜置1小時。每孔再用吐溫-PBS洗滌，然後加入100μL/孔鄰苯二胺底物顯色液(在含0.009％充氧水的檸檬酸-磷酸緩衝液(pH9.0)中溶解鄰苯二胺至濃度為0.04％)。室溫避光反應10-30分鐘，每孔加入50μL 2M硫酸終止反應，使用微滴板讀取儀(SPECTRAmax250，Molecular Device，日本)讀取492nm的吸光度。
對MBP-megsin蛋白進行同樣處理。結果見圖12(megsin肽-2抗體)和圖13(megsin肽-4抗體)。結果表明，megsin肽-2抗體和megsin肽-4抗體均以濃度依賴方式與megsin蛋白發生特異性反應。作為對照的CHO或MBP上清液沒有觀察到任何反應。
工業應用本發明有利於腎功能的評價，其並非如腎活檢一樣對身體造成明顯損傷，而是使用如尿液和血液這樣的無創性樣品來進行評價。對體外簡易腎功能評價的認識使得可以對更多患者實施快速而經濟的檢驗服務。有許多腎病希望通過早期診斷可以推遲透析治療。因此，本發明不僅減輕了受檢者的負擔，並通過提供操作簡單的腎功能評價方法得以檢查並發現更多將來可能要接受透析的患者。此外，由於有極佳的指示物(即存在於活體樣品如尿液、血液中，能反映腎功能的megsin蛋白)，可獲得較高的評價可靠性。
尤其是，本發明提供的megsin蛋白的免疫檢測方法，和用於此方法的試劑盒，在利用磁性顆粒載體的可操作性上具有優勢。通過本檢測方法可實現megsin蛋白的快速準確檢測。此外，由於本方法可以充分了解腎小球膜細胞增殖情況，本發明可以方便地確定何時開始或是否繼續使用治療IgA腎病的類固醇療法。
序列列表110黑川清宮田敏男扶桑藥品工業株式會社120megsin蛋白的測定方法及其應用130F2-101DP1PCT140141150JP 1999-753051511999-03-19150JP 1999-3066231511999-10-2816021170PatentIn Ver.2.021012111143212DNA213人(Homo sapiens)220221CDS222(1)..(1140)300302腎小球膜超顯性基因，megsin，是一種在IgA腎病中上調的新型絲氨酸蛋白酶抑制劑。303臨床研究雜誌3041203054306828-8363071998-8-154001atg gcc tcc ctt gct gca gca aat gca gag ttt tgc ttc aac ctg ttc 48Met Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asn Ala Glu Phe Cys Phe Asn Leu Phe1 5 10 15aga gag atg gat gac aat caa gga aat gga aat gtg ttc ttt tcc tct 96Arg Glu Met Asp Asp Asn Gln Gly Asn Gly Asn Val Phe Phe Ser Ser20 25 30ctg agc ctc ttc gct gcc ctg gcc ctg gtc cgc ttg ggc gct caa gat 144Leu Ser Leu Phe Ala Ala Leu Ala Leu Val Arg Leu Gly Ala Gln Asp35 40 45gac tcc ctc tct cag att gat aag ttg ctt cat gtt aac act gcc tca 192Asp Ser Leu Ser Gln Ile Asp Lys Leu Leu His Val Asn Thr Ala Ser50 55 60gga tat gga aac tct tct aat agt cag tca ggg ctc cag tct caa ctg 240Gly Tyr Gly Asn Ser Ser Asn Ser Gln Ser Gly Leu Gln Ser Gln Leu65 70 75 80aaa aga gtt ttt tct gat ata aat gca tcc cac aag gat tat gat ctc 288Lys Arg Val Phe Ser Asp Ile Asn Ala Ser His Lys Asp Tyr Asp Leu85 90 95agc att gtg aat ggg ctt ttt gct gaa aaa gtg tat ggc ttt cat aag 336Ser Ile Val Asn Gly Leu Phe Ala Glu Lys Val Tyr Gly Phe His Lys100 105 110gac tac att gag tgt gcc gaa aaa tta tac gat gcc aaa gtg gag cga 384Asp Tyr Ile Glu Cys Ala Glu Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Val Glu Arg115 120 125gtt gac ttt acg aat cat tta gaa gac act aga cgt aat att aat aag 432Val Asp Phe Thr Asn His Leu Glu Asp Thr Arg Arg Asn Ile Asn Lys130 135 140tgg gtt gaa aat gaa aca cat ggc aaa atc aag aac gtg att ggt gaa 480Trp Val Glu Asn Glu Thr His Gly Lys Ile Lys Asn Val Ile Gly Glu145 150 155 160ggt ggc ata agc tca tct gct gta atg gtg ctg gtg aat gct gtg tac 528Gly Gly Ile Ser Ser Ser Ala Val Met Val Leu Val Asn Ala Val Tyr165 170 175ttc aaa ggc aag tgg caa tca gcc ttc acc aag agc gaa acc ata aat 576Phe Lys Gly Lys Trp Gln Ser Ala Phe Thr Lys Ser Glu Thr Ile Asn
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1.一種用於評價腎功能的方法，其包括測定活體樣品中的megsin蛋白。
2.權利要求1所述用於評價腎功能的方法，其包括測定活體樣品中的megsin蛋白，並將其與正常標本中的megsin蛋白量進行對比。
3.權利要求1所述評價腎功能的方法，其中的活體樣品是尿液。
4.權利要求1所述評價腎功能的方法，其中用抗megsin蛋白抗體經抗原-抗體反應測定活體樣品中的megsin蛋白。
5.權利要求4所述評價腎功能的方法，其中的抗megsin蛋白抗體是單克隆抗體。
6.用於診斷腎功能的試劑，其包含抗megsin蛋白的抗體。
7.權利要求6所述用於診斷腎功能的試劑，其中的抗megsin蛋白抗體是單克隆抗體。
8.用於檢測活體樣品中megsin蛋白的顆粒，其中該顆粒包含固體顆粒，所述固體顆粒表面結合有抗megsin蛋白抗體。
9.權利要求8所述用於檢測megsin蛋白的顆粒，其中所述固體顆粒具有磁性。
10.權利要求8所述用於檢測megsin蛋白的顆粒，其中所述固體顆粒的相對密度不小於1。
11.權利要求8所述用於檢測megsin蛋白的顆粒，其中的抗megsin蛋白抗體是單克隆抗體。
12.用於檢測活體樣品中megsin蛋白的方法，其包含下列步驟i)使檢測megsin蛋白的顆粒與活體樣品接觸，該顆粒包含固體顆粒，所述固體顆粒表面結合有抗megsin蛋白的第一抗體。ii)使結合有標記分子的抗megsin蛋白第二抗體與已接觸活體樣品的megsin蛋白檢測顆粒接觸，並且，iii)檢測通過所述抗megsin蛋白第二抗體與megsin蛋白結合的所述標記分子。
13.權利要求12所述的檢測方法，其中抗megsin蛋白第一抗體和抗megsin蛋白第二抗體都是單克隆抗體。
14.權利要求13所述的檢測方法，其中抗megsin蛋白第一抗體和抗megsin蛋白第二抗體為具有不同識別位點的抗體。
15.權利要求12所述的檢測方法，其中的活體樣品是尿液。
16.權利要求12所述的檢測方法，其中的活體樣品是血液。
17.用於檢測megsin蛋白的試劑盒，其含有下列組件a)可結合抗megsin蛋白抗體的磁性固體顆粒，b)抗megsin蛋白抗體，其預先固定於所述磁性固體顆粒上，或可以間接固定於其上，還有c)磁體
18.權利要求17所述用於檢測megsin蛋白的試劑盒，其進一步包含與標記分子結合的抗megsin蛋白抗體。
全文摘要
本發明提供一種通過測定活體樣品中megsin蛋白來評價腎功能的方法。另外,本發明還提供了用於測定活體樣品中megsin蛋白的免疫分析試劑和試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK1352744SQ00807212
公開日2002年6月5日 申請日期2000年3月17日 優先權日1999年3月19日
發明者宮田敏男 申請人:黑川清, 扶桑藥品工業株式會社, 宮田敏男