一種動物細胞無血清低密度培養基及其應用的製作方法

2023-05-01 05:35:51

專利名稱：：一種動物細胞無血清低密度培養基及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物製藥領域的細胞工程技術，主要涉及動物細胞無血清低密度(50-5X103cellS/mL)培養基及其應用。該動物細胞無血清低密度培養基不僅能夠進行多種動物細胞的無血清克隆化篩選而且能夠滿足密度50-5xl03cells/mL時細胞的生長代謝和產物表達。
背景技術：
：動物細胞培養是生命科學基礎理論研究和生物
技術領域：
廣泛應用的關鍵技術之一。動物細胞由於具有活性高、穩定性好等優點已被生物製藥行業中被廣泛使用。目前美國FDA批准上市的生物技術藥物中70%由動物細胞表達生產的。其廣泛使用的動物細胞有CH0、SP2/0、HEK293、Vero和B服等。生物製藥行業中，優化和篩選穩定表達目標產物的動物細胞系是關鍵技術之一。通常採用融合技術或轉染技術獲得表達目標產物的動物細胞系，採用傳統克隆化方法篩選獲得生長代謝正常、產物表達穩定的細胞株。傳統克隆化方法通常採用動物血清、飼養細胞等動物來源成分進行[1]。動物細胞體外培養過程中，影響動物細胞體外培養效果的最直接、最重要的環境因素是培養基。大多數動物細胞採用含血清培養基進行體外培養。血清等動物來源成分不明確、批次不穩定、價格昂貴等較多因素會影響實驗重複性、可靠性以及生產穩定性[2]。無血清培養基以其成分明確、批次差異小、有利於產物的分離純化及無源性汙染等優點越來越受到使用者的歡迎[3]。無血清培養基一般是在合成培養基的基礎上添加血清替代成分而構成。目前已有商品化的無血清培養基，如SFM-II(Gibco公司)、SFM4(Hyclone公司)、EX-302(JRH公司)、EX-620(JRH公司)、EX-610(JRH公司)、EX-CELL525(JRH公司)等。目前報導的無血清培養基僅能夠滿足細胞密度大於5X103cellS/mL時，細胞的生長代謝和產物表達，且使用細胞株範圍較窄。如KimEJ，等人在以合成培養基D/F12為基礎添加胺基酸、乙醇胺、卵磷脂等物質研究開發出了細胞密度大於6.4X103cells/mL時適合重組CH0細胞生長代謝的無血清培養基w;同年，KimEJ等人以合成培養基IMDM為基礎開發了一種適合rCHO(表達EPO)且細胞密度大於5X10Vells/mL時的無血清培養基，此無血清培養基中添加了蛋氨酸、穀氨酸、PF_68、胰島素、硫酸鋅、暖磷脂、絲氨酸、氫化可的松等物質[5]。DoYunKim等人在2006年以IMDM為基礎添加酵母提取物、硫酸鋅、氯化銅、亞硒酸鈉、乙醇胺等物質開發了適合rCHO細胞的無血清培養基，能夠實現細胞在高密(7X106cell/mL)的的生長[6]。此類滿足細胞密度大於5X103cellS/mL時細胞生長代謝的無血清培養基的文獻較多。目前生物製藥行業，動物細胞培養多採用傳統克隆化方法(含血清和飼養細胞)獲得的細胞株，此細胞株經無血清懸浮馴化後方可用於生產。無血清懸浮馴化過程會出現外源基因丟失和目標產物表達水平下降的現象;.同時，生產用動物細胞在體外長期培養過程中同樣存在目標產物分泌表達穩定性的問題〔"，如外源基因丟失導致目標產物表達水平下降等現象。解決無血清條件下動物細胞克隆化方法，對篩選獲得穩定表達產物的細胞株尤為重要。目前，在無血清條件下能滿足多種動物細胞低密度培養的培養基尚未見報導。經申請人所作的資料檢索，相關的參考文獻如下1、GlassyMC，TharakanJP，ChaoPC.Serumfreemediainhybridomacultureandmonoclonalantibodyproduction.BiochemicalandBiotechnology,1988,32:1015-1028;2、EvenMS,SanduskyCB，BarnardND.Serum-freehybridomaculture:ethical,scientificandsafetyconsiderations.TrendsBiotechnol.2006,24(3):105-8;3、FroudSJ.Thedevelopment,benefitsanddisadvantagesofserum-freemedia.DevBiolStand.1999;99:157-66;4、GstraunthalerG.Alternativestotheuseoffetalbovineserum:serum-freecellculture.ALTEX.2003;20(4):275-81;5、KimEJ,KimNS.LeeGM.Developmentofaserum-freemediumfordihydrofolatereductase-deficientChinesehamsterovarycells(DG44)usingastatisticaldesign:beneficialeffectofweaningofcells.InVitroCellDevBiolAnim.1999Apr;35(4):178-82;6、KimEJ,KimNS,YoonSK，AhnYH,SongJY.Developmentofaserum-freemediumfortheproductionoferythropoietinbysuspensioncultureofrecombinantChinesehamsterovarycellsusingastatisticaldesign.JBiotechnol.1999Apr15;69(2-3):85-93;7、DoYunKim，JoonChulLee,HoNamChang,DukJaeOh.Developmentofserum-freemediaforarecombinantCHOcelllineproducingrecombinantantibody,EnzymeandMicrobialTechnology39(2006)42"33;8、BarnesLM，DicksonAJ.Mammaliancellfactoriesforefficientandstableproteinexpression.CurrOpinBiotechnol.2006;17(4):381-6。
發明內容本發明的目的在於，提供一種動物細胞無血清低密度(5-5xl03cdls/mL)培養基及其應用，該動物細胞無血清培養基適於哺乳動物細胞密度在5-5xl03Cdls/mL時的生長代謝，並且維持細胞正常的比生長速率與產物合成速率，實現了細胞在無血清低密度條件下的生長代謝、產物表達，對傳統克隆化方法的作了有益的改進，使無血清條件下進行細胞克隆化篩選成為可能。採用本發明可以提高實驗結果的重複性、可控性和可靠性；尤其在生物製藥領域，本發明的使用可避免由血清批次間的質量差異造成的生產不穩定性、消除血清中複雜蛋白組分對重組蛋白純化的不利影響、簡化產品質量控制項目、延長生產用動物細胞穩定期，從而提高細胞表達產品的穩定性、質量可靠性及安全性。同時，本發明無血清克隆化方法的應用具有廣泛的應用價值。採用本發明對於建立生產用動物細胞高效穩定表達平臺成為可能；在生產過程中，超過穩定期的細胞可以採用本發明進行細胞株篩選再次獲得生長代謝和產物表達穩定的細胞株；使細胞株改造及細胞株優化成為可能；可作為生產末期細胞庫質量控制檢測的新方法，解決了生物製藥領域技術瓶頸。本發明所採取的技術解決方案如下一種動物細胞無血清低密度培養基，其特徵在於製得的該動物細胞無血清低密度培養基是在合成培養基或商品化的無血清培養基中加入添加物構成；其中所述的添加物及其用量為胰島素5-50mg/L，轉鐵貼蛋白5-50|ig/mL，亞硒酸鈉10-100nM，乙醇氨10-100piM，L-穀氨醯胺4-8mM，脂類溶液適量，腐胺10-100mg/L、胰島素類因子IGF-1:10-500pg/L、酸性成纖維細胞生長因子rh-aFGF:10-600嗎/L，表皮生長因子EGF:5-200pg/L，硫酸亞鐵0.42-0.83mg/L，氫化可的松1—10pmol/L，維生素混合液適量，植物水解物溶液適量。本發明的動物細胞無血清低密度培養基主要用於動物細胞無血清克隆化技術，包括動物細胞無血清低密度培養基和D-多聚賴氨酸粉末包被96孔培養板兩個方面。實現了動物細胞在單細胞或低密度(5-5X103cells/mL)水平下的生長代謝和產物表達及較好細胞集落的形成。無血清克隆化實驗結果的判斷標準是克隆率和克隆陽性率兩個指標。其中克隆率就是單克隆數目除以96孔培養板中細胞懸液的接種數。而陽性率為檢測後為陽性單克隆數目除以單克隆總數。本發明具有如下特點1、該動物細胞無血清低密度培養基不僅能夠進行多種動物細胞的無血清克隆化篩選而且能夠滿足密度5-5xl03cellS/mL時細胞的生長代謝和產物表達。此培養基是實現動物細胞無血清克隆化的前提。2、採用本發明的動物細胞無血清低密度培養基，以D-多聚賴氨酸包被96孔培養板的方法改進細胞集落形態，實現細胞在96孔培養板底部的黏附。此創新之處便於操作人員在光學顯微鏡下對細胞克隆集落的觀察與單克隆的選擇和判斷。圖1是動物細胞無血清克隆化構建細胞株的操作流程；圖2是A、B分別是對比CERC-18細胞採用經D-多聚賴氨酸包被的96孔培養板與未經D-多聚賴氨酸包被的96孔培養板進行無血清克隆化的效果圖。圖3是無血清克隆化獲得的單克隆細胞集落表達產物的檢測圖；以下結合附圖和申請人給出的具體實施方式對本發明作進一步的詳細說明。具體實施方式本發明的動物細胞無血清低密度培養基，是以合成培養基粉末或商品化的無血清培養基粉末為原材料，添加胰島素粉末、轉鐵蛋白粉末、L-穀氨醯胺粉末、亞硒酸鈉粉末、乙醇胺溶液、脂類溶液、表皮生長因子粉末、重組人酸性成纖維生長因子、維生素溶液、植物水解物溶液、腐胺粉末、硫酸亞鐵粉末、氫化可的松粉末、胰島素類因子粉末製備而成。動物細胞無血清低密度培養基的配製及添加物的作用如下1.合成培養基或商品化無血清培養基本發明所述的合成培養基有DMEM、D/F12及RPMI1640等。本發明所述的商品化無血清培養基有EX-302(JRH公司)、EX-620(JRH公司)、SFM4(hydone公司)等。合成培養基或無血清培養基的配置按照常規培養基或無血清培養基說明書的溶解方法進行。之後採用0.22um的濾膜過濾除菌。配置好的培養基置於4'C儲存。2.添加物的作用及配製方法2.1胰島素(Insulin)的作用及配置方法本發明中提供的動物細胞無血清低密度培養基中胰島素是重要的血清替代成分。胰島素可促進糖元與脂肪酸的合成，同時促進RNA、蛋白質和脂類的合成。胰島素可以為重組胰島素、牛源胰島素或人源胰島素，胰島素類因子也可以使用。本發明中提供的動物細胞無血清低密度培養基中胰島素的濃度範圍是5-50mg/L，具體濃度因細胞系的差異而定。推薦使用濃度為5-15mg/L。2.2轉鐵蛋白(Transferrin)的作用及配置方法本發明中使用的轉鐵蛋白主要是細胞獲取微量元素的主要渠道，同時具有促進胰島素髮揮作用的功能。在該發明使用的轉鐵蛋白可以是重組的、人源的或牛源的等，另外檸檬酸鐵也可以起到同樣的作用。轉鐵蛋白的使用濃度在5-50mg/L。具體濃度因細胞系的差異而定。推薦使用濃度為5-15mg/L。2.3亞硒酸鈉(Sadiumseleuite)的作用及配置方法本發明中使用的亞硒酸鈉對細胞生長代謝有著顯著的支持作用。同時硒元素具有消除過氧化物和氧自由基對細胞傷害的功能。亞硒酸鈉的使用濃度為10-100nM。推薦使用濃度為20-60nM。2.4L-穀氨醯胺的作用及配置方法本發明中使用的L-穀氨醯胺主要提供細胞生長代謝過程中所需的能量物質。L-穀氨醯胺的使用濃度為4-8mM。推薦使用濃度為4-6mM。2.5脂類的作用及使用方法本發明中使用的脂類主要是細胞膜合成和細胞生長所必需的物質。為無動物來源成分、化學成分限定的物質。使用時濃度參考說明書推薦濃度，採用相應培養基稀釋即可。2.6乙醇氨的作用及配置方法本發明中使用的乙醇氨是雜交瘤細胞生長所必需的生長因子。乙醇氨的使用濃度10-100)amol/L。具體濃度因細胞系的差異而定。推薦使用濃度為30-50jimol/L。2.7胰島素類因子(IGF-1)的作用、配置及儲存本發明中使用的胰島素類因子具促進細胞增值的能力。胰島素類因子的使用濃度10-500pg/L。推薦使用濃度為20-100)ig/L。該胰島素類因子可以與添加組分中的胰島素同時添加。2.8表皮生長因子(EGF)的作用及配置方法本發明中使用的表皮生長因子具促進細胞生長的作用。表皮生長因子的使用濃度5-200^ig/L。具體濃度因細胞系的差異而定。推薦使用濃度為10-100|ag/L。2.9基因重組人酸性成纖維細胞生長因子(rh-aFGF)的作用及配置方法本發明中使用的酸性成纖維生長因子也是動物細胞無血清低密度(5--5X103cellS/mL)培養基的關鍵成份之一。具有促進細胞生長的作用。細胞在克隆化過程中需要單細胞生長，因此採用多生長因子聯合作用的方法可實現單細胞在無血清條件下的生長代謝。基因重組人酸性成纖維細胞生長因子的使用濃度10-600pg/L。具體濃度因細胞系的差異而定。推薦使用濃度為50-500嗎/L。2.10植物水解物的作用及配製方法本發明中使用的植物水解物是重要的脂肪酸載體和微量元素的來源。本發明所使用的植物水解物是液體且無菌包裝液，含有較多的短肽。本發明所使用的維生素是無菌包裝的維生素混合液。使用濃度參考市售的產品說明書推薦濃度，採用相應培養基稀釋即可。2.11腐胺的作用及配製方法本發明中使用的腐胺也是動物細胞無血清低密度(50--5X103cells/mL)培養基的成份之一，具有促進促細胞分裂的作用。腐胺的使用濃度10-100mg/L。具體濃度因細胞系的差異而定。推薦使用濃度為20-50mg/L。2.12維生素的作用及使用方法本發明中使用的維生素為細胞的生長代謝提供必要的維生素，促進細胞生長和延長細胞活性，提供營養物質的同時降低代謝產物的堆積。本發明所使用的維生素是無菌包裝的維生素混合液。使用濃度參考說市售的產品明書推薦濃度，採用相應培養基稀釋即可。2.13硫酸亞鐵(FeS04*7H20)的作用及配製方法本發明中使用的硫酸亞鐵為培養基提供細胞生長所需的亞鐵離子，同時可以作為轉鐵蛋白的替代成分。硫酸亞鐵的濃度控制在0.42-0.83mg/L。具體濃度因細胞系的差異而定。推薦使用濃度0.83mg/L。2.14氫化可的松的作用及配製方法本發明中使用的氫化可的松是促進細胞有絲分裂的生長激素。氫化可的松的使用濃度1-lOpmol/L。具體濃度因細胞系的差異而定。推薦使用濃度為2-5[imol/L。採用本發明的動物細胞無血清低密度培養基所進行的無血清克隆化方法主要是採用動物細胞無血清低密度培養基，並且結合促進細胞貼壁和細胞增殖的D-多聚賴氨酸改進細胞克隆集落形成來實現的。3、D-多聚賴氨酸包被96孔培養板動物細胞的無血清克隆化篩選須採用96孔培養板進行。為了促進細胞在無血清克隆化過程中形成較為聚集的細胞集落，同時促進細胞生長。該發明採用促進細胞貼壁和細胞增殖的D-多聚賴氨酸包被96孔培養板的方法改進細胞集落形態，並且實現了細胞在96孔培養板底部的黏附。D-多聚賴氨酸包被96孔培養板的時間和濃度需要根據不同細胞系和實驗目的進行篩選，一般使用濃度為10—500mg/L，包被時間為30min-3h完成96孔培養板的包被。D-多聚賴氨酸的配置與儲存D-多聚賴氨酸乾粉採用無菌純水溶解。充分溶解後分裝，-20°(^儲存。本發明使用的D-多聚賴氨酸購於碧雲天公司。4、發明人採用了雜交瘤細胞株CERC-18，該細胞是經免疫的BALB/c小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，獲得CERC-18雜交瘤細胞株。該細胞株能夠穩定高效表達抗人肝癌的單克隆抗體。除此之外，申請人還採用了CERC-1和rCHO-lO細胞株(第四軍醫大學細胞工程中心構建)進行克隆化實驗方法的驗證。採用本發明的動物細胞無血清低密度培養基應用於無血清克隆化是將96孔培養板採用D-多聚賴氨酸進行包被。D-多聚賴氨酸為10-500mg/L，包被時間為0.5-3h。採用梯度稀釋法製備細胞懸液，細胞密度為50cdls/mL，以200pL/孔接種96孔培養板。克隆化結果在光學顯微鏡進行觀察，計算克隆率；上清採用ELISA或免疫螢光的方法進行檢測，計算克隆陽性率。以下是發明人給出的實施例本實施例所採用本發明的動物細胞無血清低密度培養基所進行的無血清克隆化方法的操作流程如下-先進行細胞的復甦；接著進行動物細胞無血清低密度培養基的配置，無菌檢測進行7天，結果陰性即可用於實驗；以PDL包被96孔培養板；製備細胞克隆板；顯微鏡下觀察和上清液的檢測，計算克隆率和陽性率。克隆化細胞株的獲得本實施例的CERC-18和CERC-1雜交瘤細胞株是在體外培養時間超過其穩定期的細胞，進行常規的細胞傳代培養，無血清克隆化時可直接使用。為了獲得生長和表達穩定的細胞株，申請人從原始細胞庫取出rCHO-10(己經完成細胞株質量控制並鑑定合格)，至於37'C水浴中迅速融化。之後在生物安全櫃或超淨臺內進行。將細胞懸液移入含7-8mL無血清培養(4。C)的離心管中，1200rpm離心5min，棄去上清，採用動物細胞無血清培養基重懸細胞沉澱。將細胞懸液移入T-Flask中培養。置於37°C、5%二氧化碳濃度的培養箱中靜止培養。之後在無血清培養基中連續傳代3次以上，細胞活性大於95%即可用於無血清克隆化。動物細胞無血清低密度培養基的配製動物細胞CERC-18與rCHO-10分別採用D/F12合成培養基(hyclone公司)和EX-302(JRH公司)無血清培養基補加添加物組成的動物細胞無血清低密度培養基。D/F12的配置與儲存按照常規基礎培養基的配置方法配製1L的D/F12培養基。稱取5.08gD/F12培養基幹粉溶解於1L純水中，過濾前加入碳酸氫鈉粉末2.438g。採用0.22pm濾膜過濾、4"C儲存。EX-302的配置與儲存參照EX-302說明書配製1L無血清培養基。稱取21.2gEX-302培養基幹粉、0.588gL-穀氨醯胺乾粉，依次分別溶解於1L純水中，過濾前加入碳酸氫鈉乾粉1.6g。採用0.22pm濾膜過濾、fC儲存。胰島素(Sigma公司)採用0.1MHC1鹽酸溶解。將lmg的重組胰島素溶解於lmL0.1MHCl鹽酸中，配製成濃度為lmg/mL母液，0.22um濾膜過濾除菌、4'C儲存。轉鐵蛋白(Sigma公司)採用純水進行溶解。將lmg的轉鐵蛋白溶解於lmL純水中，配製成濃度為lmg/mL的母液，0.22um濾膜過濾除菌、4"C儲存。亞硒酸鈉(Acrosorganics公司)採用純水進行溶解。將5.2mg的亞硒酸鈉溶解於5mL純水中，配製成濃度為6mM的母液，0.22um濾膜過濾除菌、4X:儲存。本實施例中使用的亞硒酸鈉FW:172.94，含硒44-46%。脂類(JRH公司)為無菌包裝、500x母液。分別給1LD/F12合成培養基和1LEX-302無血清培養基添加2mL脂類即可。乙醇氨(Sigma公司)採用純水進行溶解。將15uL的乙醇胺溶解於50mL的純水中，配製成濃度為5mM的母液，0.22um濾膜過濾除菌、4"C儲存。胰島素類因子(JRH公司)分別採用D/F12合成培養基和EX-302無血清培養基進行溶解。將lmg的表皮生長因子溶解於10mLD/F12和EX-302中，配製成濃度為O.lmg/mL的母液，0.22um濾膜過濾除菌、4XM諸存。表皮生長因子(Sigma公司)分別採用D/F12合成培養基和EX-302無血清培養基進行溶解。將lmg的表皮生長因子溶解於lmLD/F12和EX-302中，配製成濃度為lmg/mL的母液，0.22um濾膜過濾除菌、4"C儲存。酸性成纖維生長因子(Sigma公司，純度大於97%)採用純水或無血清培養基進行溶解。將lmg的表皮生長因子溶解於lmLD/F12和EX-302中，配製成濃度為lmg/mL的母液，0.22um濾膜過濾除菌、4'C儲存。腐胺(Sigma公司，FW:161.08，純度為97%)分別採用D/F12合成培養基和EX-302無血清培養基進行溶解。將lmg的腐胺溶解於lmLD/F12和EX-302中，配製成濃度為lmg/mL的母液，0.22um濾膜過濾除菌、4°C儲存。硫酸亞鐵(Sigma公司)分別採用D/F12合成培養基和EX-302無血清培養基進行溶解。將lmg的硫酸亞鐵溶解於lmL無血清培養基中，配製成濃度為lmg/mL的母液，0.22um濾膜過濾除菌、4'C儲存。氫化可的松(Sigma公司)採用無水乙醇進行溶解。將lmg的氫化可的松溶解於lmL無水乙醇中，配製成濃度為lmg/mL母液，4"儲存。維生素混合液(JRH公司)為無菌包裝，40x母液。分別給1LD/F12合成培養基和1LEX-302無血清培養基添加2mL、4mL維生素混合液。植物水解物(JRH公司)為無菌包裝，50X母液。分別給1LD/F12合成培養基和1LEX-302無血清培養基添加12.5mL、37.5mL植物水解物即可。按照上述方法配製胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉、乙醇胺、脂類、L-穀氨醯胺、酸性成纖維細胞生長因子等。其中，各添加物濃度控制如下胰島素5-15mg/L;轉鐵蛋白5-15mg/L;亞硒酸鈉20-60nmol/L;乙醇氨30-50ymol/L;脂類溶液採用培養基500倍稀釋；腐胺為20-50mg/L;類胰島素因子(IGF-1)為20-100ug/L;酸性成纖維細胞生長因子(aEGF)為10-100pg/L;酸性表皮生長因子(FGF)為50-500"g/L;硫酸亞鐵為0.83mg/L;氫化可的松為2-5umol/L;混合維生素溶液採用40倍稀釋；植物水解物溶液採用50倍稀釋、L-穀氨醯胺4-6mM。動物細胞無血清低密度培養基在配製過濾7天後檢査無菌結果，陰性即可用於無血清克隆化。3、D-多聚賴氨酸包被96孔培養板採用無菌純水配製D-多聚賴氨酸。取10mgD-多聚賴氨酸溶解於10mL無菌純水中，母液lg/U-2(TC儲存。採用無菌純水將母液進行稀釋，CERC-18細胞株和rCHO-10D-多聚賴氨酸終濃度分別為50mg/L和100mg/L，200uL/孔，包被2h和lh，之後用於動物細胞無血清克隆化。4、CERC-18細胞懸液的接種將CERC-18細胞株移入生物安全櫃中，取樣後進行細胞計數。採用逐步稀釋的方法將CERC-18細胞密度調整至5cells/mL，200uL/孔接種細胞懸液。接著置於37'C、5%二氧化碳濃度的培養箱中靜止培養。5、光學顯微鏡下觀察細胞懸液接種至96孔培養板後7-10天，在普通光學倒置顯微鏡下進行觀察，標記形成單克隆的細胞集落。採用單克隆數除以96即可得到相應的克隆率。CERC-18細胞在各種培養基中進行克隆化的實驗結果見圖2和表1。其中陰性對照是採用無血清培養基；陽性對照採用傳統的克隆化方法進行，也就是說採用了詞養細胞和血清。實驗組是採用動物細胞無血清低密度培養基結合無血清克隆化方法進行。表l:CERC-18細胞克隆化結果tableseeoriginaldocumentpage156、採用ELISA方法進行上清液中表達產物的檢測CERC-18細胞採用ELISA方法檢測上清液中目標產物的分泌。ELISA方法中使用的試劑如下小鼠IgG標準品購於sigma公司；HRP標記的羊抗鼠IgG購自Pierce公司。檢測結果採用酶標儀進行讀取，獲得相應的螢光值。實驗結果見表2。表2:CERC-18細胞單克隆孔上清中目標產物檢測結果tableseeoriginaldocumentpage16rCH0-IO細胞採用ELISA方法檢測上清液中目標產物的分泌。ELISA方法中使用的試劑如下小鼠IgG標準品購於sigma公司；HRP標記的羊抗人IgG購自Pierce公司。檢測結果採用酶標儀進行讀取，獲得相應的螢光值。其CERC-l細胞在各種培養基中進行克隆化的實驗結果見表3和圖3，其中陰性對照是採用無血清培養基性；陽性對照採用傳統的克隆化方法進行，也就是說採用了詞養細胞和血清。實驗組是採用無血清克隆化培養基進行克隆化的實驗結果。表3:CERC-1細胞克隆1k結果分組克隆化所用培養基結果陰性對照EX-620:4個，克隆率為4.P/。，陽性率為50%m性對照PRMI-1640(雜交瘤細胞專用)+10%FBS單克隆較少，多為多克隆。實驗組EX-620+克隆化添加培養基39個，克隆率為39.7%，陽性率為100%注在進行無血清克隆化的過程中為了更加好的說明無血清克隆化方法的可行性，採用陽性對照(傳統的克隆化方法)和陰性對照(採用無血清培養基)進行比較。rCHO-10細胞在各種培養基中進行克隆化的實驗結果見表4、表5。其中陰性對照是採用無血清培養基；陽性對照採用傳統的克隆化方法進行，也就是說採用了飼養細胞和血清。實驗組是採用動物細胞無血清低密度培養基進行。表4:rCHO-10細胞克隆4匕結果tableseeoriginaldocumentpage17rCHO-10細胞單克隆孔上清中目標產物檢測結果tableseeoriginaldocumentpage17注N.A為顯色結果為弱陽性，但酶標儀不能檢測。權利要求1.一種動物細胞無血清低密度培養基，其特徵在於製得的該動物細胞無血清低密度培養基是在合成培養基中加入添加物構成；其中所述的添加物及其用量為胰島素5-50mg/L，轉鐵貼蛋白5-50μg/mL，亞硒酸鈉10-100nM，乙醇氨10-100μM，L-穀氨醯胺4-8mM，脂類溶液適量，腐胺10-100mg/L、胰島素類因子IGF-110-500μg/L、酸性成纖維細胞生長因子rh-aFGF10-600μg/L，表皮生長因子EGF5-200μg/L，硫酸亞鐵0.42-0.83mg/L，氫化可的松1--10μmol/L，維生素混合液適量，植物水解物溶液適量。2.如權利要求1所述的動物細胞無血清低密度培養基，其特徵在於，所述的合成培養基採用DMEM、D/F12或RPMI1640粉末，或者採用商品化的無血清培養基。3.如權利要求1所述的動物細胞無血清低密度培養基，其特徵在於，該動物細胞無血清低密度培養基適合哺乳動物細胞低密度培養，其細胞密度從50cells/mL至5xl03cells/mL，維持細胞正常生長代謝和產物表達，同時該培養基也適用於高密度細胞培養。4.權利要求1所述的動物細胞無血清低密度培養基用於動物細胞無血清克隆化的應用。5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於，將96孔培養板採用D-多聚賴氨酸進行包被。6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述的D-多聚賴氮酸為10-500mg/L，包被時間為0.5-3h。7.如權利要求4所述的的應用，其特徵在於，採用細胞密度為50cdls/mL的懸液接種96孔培養板，0.2mL/L，置於5%C02培養箱中靜止培養7-10天。全文摘要本發明公開了一種動物細胞無血清低密度培養基及其應用，該動物細胞無血清低密度培養基以合成培養基為原材料，添加胰島素粉末、轉鐵蛋白粉末、L-穀氨醯胺粉末、亞硒酸鈉粉末、乙醇胺溶液、脂類溶液、表皮生長因子粉末、重組人酸性成纖維生長因子、維生素溶液、植物水解物溶液、腐胺、硫酸亞鐵、氫化可的松、胰島素類因子，此培養基能夠滿足哺乳動物細胞在無血清和低密度條件下的生長代謝和產物表達。通過使用動該物細胞無血清低密度培養基，結合D-多聚賴氨酸粉末包被96孔培養板可完成無血清克隆化，實現動物細胞無血清培養的連續性，提高產物表達的穩定性，確保產品質量及安全性，增強生產工藝的可控性。具有廣泛的使用範圍。文檔編號C12N5/06GK101333513SQ20081015005公開日2008年12月31日申請日期2008年6月16日優先權日2008年6月16日發明者強馮,穎屈,玲李,力米申請人:陳志南;米力