類孢子細胞子群及其用途的製作方法

2023-05-01 14:19:21

專利名稱：類孢子細胞子群及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及類孢子細胞子群的鑑別、分離和使用。
背景技術：
多能細胞的使用已經在醫藥研究領域，尤其是提供用於治療因遺傳缺陷、損傷和/或疾病過程引起的組織損傷的試劑領域引起人們的關注。理想情況是，可將能夠分化成受影響細胞類型的細胞移植到有需要的個體中，在個體體內，這些細胞將與器官微環境相互作用，並提供必要的細胞類型來修復損傷。胚胎幹(Embryonic stem, ES)細胞是來源於胚泡的多能細胞，其可在體外以未分化狀態無限增殖，可在體內分化成所有細胞譜系，並且可在體外經過誘導而分化成大多數細胞類型(馬丁(Martin)，美國國家科學院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.), 78 :7634-7638 (1981)) 儘管已經從人類中分離出 ES 細胞，但其在研究以及治療學中的應用因倫理方面的約因而受到阻礙(弗蘭克(Frankel)，科學(Science). 287 :1397(2000))。已經不斷地嘗試從包括造血細胞(美國專利第5，750，397號)、神經細胞(蓋吉(Gage)，科學，287 :1433-1438(2000))、胃腸細胞(普騰(Potten)，倫敦皇家學會哲學彙刊 B 輯生物科學(Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.) 353 :821-830 (1998))、表皮細胞(瓦特(Watt)，倫敦皇家學會哲學彙刊B輯生物科學，353 :831-837(1998))和間充質幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)(美國專利第5，736，396號)在內的非胚胎 組織分離幹細胞。也已經從骨髓中純化出另一細胞群，即專能成體祖細胞(multipotentadult progenitor cell, MAPC)(雷耶斯(Reyes)等人，血液學(Blood), 98 (9)2615-2625(2001);雷耶斯和維特法雷(Vetfaillie)，紐約科學院年報(Ann NY Acad Sci)，938 :231-235(2001))。這些細胞能夠在體外擴增以實現超過100代群體倍增，同時無端粒縮短或不會發生核型異常。經顯示，MAPC也能在指定培養條件下分化成各種間充質細胞類型(例如成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞和骨骼肌成肌細胞)、內皮、神經外胚層細胞，且更近來顯示其分化成肝細胞(斯查沃茲(Schwartz)等人，臨床研究(Clin Invest), 109 1291-1302(2000))。使用ES細胞或其它多能細胞用於個體的再生療法的一個問題是控制這些細胞的生長和這些細胞成為個體治療所需的特定細胞類型的分化。如斯查丁納(Schuldiner)等人，美國國家科學院院刊，97 :11307-11312(2000)中所揭露，其中所用八種生長因子都不能僅定向分化成一種細胞類型。因此，仍需要用於產生適於多種應用(包括治療各種器官和/或組織的損傷和/或疾病)的可移植專能和多能細胞群的新方法。此外，專能或多能細胞的來源因這些細胞必須從活體組織採集而受到限制。瓦坎提(Vacanti)等人的美國公開申請案第2004/0057942號和第2004/0033598號揭露了對缺氧具有特別高耐受性的小原始細胞。經證實，這些稱為「類孢子」細胞的細胞可基本上耐受完全缺氧環境至少24小時(儘管缺氧4小時或24小時，細胞仍可存活)。類孢子細胞的增殖能力比從特化組織分離的終末分化細胞強。增殖能力是一種重要的特性，因為組織工程、細胞療法和基於基因的療法常常會因醫師無法獲得足夠數量的細胞投予患者而受阻。因此，本發明一個目的是提供表達特定細胞表面或基因表達標記物的類孢子細胞子群。本發明另一目的是提供多能類孢子細胞子群，以及分離多能類孢子細胞子群的方法。

發明內容
已經鑑別出表達特定細胞表面受體和/或基因表達標記物的類孢子細胞子群。在一個實施例中，所述細胞表達至少一種細胞表面/基因表達標記物，例如0ct4、nanog、2邙296、《^ 仂、6(^3、仳卩1、￡。3衍、￡8§1、5( 2、？3叉6、巢蛋白、50六-1、0)29、0)34、0)90、81整合素、cKit、SP-C、CC10、S FUDAXl和SCGlO。在大多數實施例中，所述細胞表達標記物組合。本發明還提供可經過誘導而分化成內胚層、中胚層或外胚層來源的細胞的類孢子細胞子群。這些類孢子細胞子群不管來源的組織如何，都可用於產生來源於全部三種胚層的細胞。本發明描述用於鑑別和獲得類孢子細胞子群的方法。所述方法包括培養分離的類孢子細胞一段足以表達細胞表面和/或基因表達標記物的時間，以及鑑別這些細胞表面和/或基因表達標記物。還描述用於從類孢子細胞群中純化出相關類孢子細胞子群的方法。在一些實施例中，所述方法包括(a)提供類孢子細胞群；(b)鑑別表達例如0ct4、nanog、Zfp296、cripto、Gdf3, UtFU EcatU EsgU Sox2、Pax6、巢蛋白、SCA-1、CD29、CD34、CD90、BI 整合素、cKit、SP-C、CC10、SF1、DAX1和/或SCGlO等一種或一種以上標記物的類孢子細胞子群；和(c)純化所述子群。在一些實施例中，使用細胞表面標記物特異性抗體分離所述細胞。患有病症(例如皮膚病)、腫瘤或疾病(例如糖尿病)的患者可例如通過將類孢子細胞子群投予損傷區域(例如患者皮膚的損傷區域、切除腫瘤的區域或胰臟)來進行治療。全身投藥也是可能的。所述方法可用於治療在例如視網膜、腸、膀胱、腎臟、肝臟、肺、神經系統(包括脊髓或腦)或內分泌系統等多種組織中的任一種中具有功能細胞缺陷或病症的患者。


圖I顯示從胰島瘤(胰臟腫瘤)分離的類孢子細胞。
具體實施例方式I.定義如本文中所用，多能類孢子細胞是一種能夠產生來源於全部三種胚層(中胚層、內胚層和外胚層)的細胞的類孢子細胞。如在類孢子細胞的上下文中使用的術語「分離的」表示這種細胞與其天然環境分開。分離的細胞可完全與其它細胞類型分離，或者可在群體中以較多量存在。如本文中所用，富集類孢子細胞的群體是這樣一種細胞群，其已經與在其天然環境中存在的其它細胞分離，以致細胞混合物中這種細胞的比例高於在其天然環境中所發現或剛分離後的比例。如本文中所用，「可檢測標記」是指可添加到相關結合搭配物以允許檢測所述結合搭配物的任何部分。II.類孢子細胞群類孢子細胞的來源類孢子細胞可從例如禽類、爬行動物、兩棲動物或哺乳動物等動物供體獲得。舉例來說，可從齧齒動物、兔、母牛、豬、馬、山羊、綿羊、狗、貓、非人類靈長類動物或人類分離出哺乳動物類孢子細胞。類孢子細胞可從成熟動物獲得。由於類孢子細胞對於缺氧的耐受性優於分化的細胞，故也可從死亡的動物(包括已經死亡達24小時或更長時間的動物)分離 有活力的類孢子細胞。類孢子細胞是從在食品雜貨店購買的雞肝(禽類)分離。初始分離時，臺盼藍染料排除測試(trypan blue dye exclusion test)顯示有活力的(染料排除的)類孢子細胞極少。分離後三天，可以看到大的漂浮的類孢子細胞團，數量太多無法計數(數據未顯示)。在給定的供體內，類孢子細胞可從多種來源獲得。舉例來說,可從體液(例如血液、唾液或尿液)和大多數(如果不是全部的話)功能器官獲得類孢子細胞。此外，還可從隨後將用類孢子細胞治療的患者、從另一個人或從不同物種的動物獲得類孢子細胞。可獲得自體、同種異體和異種類孢子細胞子群並用於治療患者或生長組織。類孢子細胞也可從患病組織(例如癌組織)分離得到(圖I)。由此分離的類孢子細胞在適當條件下具有顯著的再生潛力。類孢子細胞的分離用於分離類孢子細胞的方法揭露於頒予瓦坎提等人的美國專利第7，060，492號、第7，575，921號和第7，560，275號中。簡單點說，從動物獲得組織或血液樣品。最易於獲得的一種樣品是全血樣品。所屬領域技術人員應理解，分離方法可根據用作原材料的組織類型而略有變化。舉例來說，在樣品是血液樣品的情況下，其可被放入含有抗凝血劑的管中。收集後，組織樣品，無論其是體液樣品還是從實體器官獲得的細胞懸浮液樣品，都以足以使樣品內的細胞在離心管底部聚結成球的時間和速度離心。所得細胞小球再懸浮於補充有葡萄糖、轉鐵蛋白(transferrin)、胰島素、腐胺(putricine)、硒、孕酮、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和喊性成纖維細胞生長因子(basic fibroblastgrowth factor, bFGF)的適合培養基(例如DMEM/F-12培養基)中。隨後將懸浮的細胞轉移到組織培養容器中，並在37°C或接近37°C下培育。起初，當樣品是血液樣品時，培養燒瓶主要含有造血細胞。然而，在培養數天後，紅細胞溶解，以致培養物主要(如果不是全部的話)含有類孢子細胞。這是因為紅細胞沒有細胞核；而類孢子細胞在這些條件下仍能存活。當從實體組織分離類孢子細胞時，可通過用一系列移液管(各自具有比前一個小的孔徑)溼磨樣品，來溶解分化細胞。舉例來說，所用最後一個移液管可具有約15U的孔徑。再培養數天後，類孢子細胞倍增，並且可連合形成細胞團(球)。經過一段時間(通常約7天)，其數量可大幅增加。通常，當如上文所述進行分離時，根據臺盼藍排除研究，超過90%的細胞存活。所屬領域技術人員將認識到，經由減小孔的移液管進行溼磨不是從較大的分化細胞分離類孢子細胞的唯一方式。舉例來說，可使含有類孢子細胞和分化細胞的懸浮液通過具有特定尺寸的孔的過濾器。過濾器內孔隙的尺寸(以及類似地用於溼磨的移液管的直徑)可根據希望的分離程序嚴格度而變化。一般說來，過濾器內的孔隙越小，或用於溼磨的移液管直徑越小，則將從分離程序存活的分化細胞的數量越少。用於分離類孢子細胞的其它方法是冷凍/解凍和尺寸排阻法。在一些實施例中，用於從血液/骨髓分離類孢子細胞，同時確保排除細胞/幹細胞類型的方法包括在不添加任何冷凍保護劑情況下，將經過抗凝血處理的全血冷凍到-20°C到_80°C，隨後將冷凍的樣品解凍。在冷凍期間形成的細胞內冰晶將殺死所有其它細胞。隨後在培養基中溼磨細胞，接著培養。剩餘的生長細胞是類孢子細胞。從血液分離類孢子細胞的其它技術包括缺氧24小時。用高滲溶液溶解血液或骨髓樣品以使細胞/幹細胞破裂。在培養物中不使用血清和餵養細胞來選擇類孢子細胞。這些方法特別適用於血液以及其它組織。類孢子細胞子群的富集本發明揭露一種用於富集和表徵、鑑別或分析富集類孢子細胞的子群的方法。所述富集子群是使用由所述細胞表達的細胞表面或基因表達標記物鑑別。如實例中所說明，將細胞培養一段足以表達特定標記物的時間，並使用所屬領域技術人員已知的技術確定標記物的表達。富集類孢子細胞的群體對例如0ct4、nanog、Zfp296、cripto、Gdf3> UtFUEcatU EsgU Sox2、Pax6、巢蛋白、SCA-1、CD29、CD34、CD90、BI 整合素、cKit、SP-C, CC10、SFU DAXl和SCGlO等一種或一種以上特定細胞標記物呈陽性。在檢測相關標記物之後可使用富集類孢子細胞的群體，這些細胞可進一步培養以促進額外分化，或可從富集的子群進一步分離表達所述標記物的細胞。所屬領域技術人員已知用於分離表達相關蛋白質的細胞供進一步增殖的方法。舉例來說，可使用美國專利第7，310，147號中揭露的通過使上千個細胞成像來運作的市售ClonePix FL系統(英國Gentix公司)分離表達相關標記物的細胞。隨後使用特定螢光探針來檢測和鑑別發螢光的集落。然後，自動收集具有所需螢光度水平的細胞(例如目標蛋白質的最高製造者)(曼恩(Mann),自然方法(Nature Methods), i_ii, (2007))。這些細胞的球形團連續傳代產生較純的不成熟且更原始的幹細胞群。在其它實施例中，使用細胞表面或基因表達標記物分離相關類孢子細胞子群。在關於細胞表面標記物的一個實施例中，所述方法包括(a)提供如上文所述分離的類孢子細胞群；(b)培養所述類孢子細胞群一段足以表達所述標記物的時間；(C)使所述細胞群與標記物特異性結合搭配物在足以使結合搭配物與其在所述類孢子細胞群每一細胞上可能存在的目標結合的條件下接觸；和(d)分離標記物陽性子群。在一些實施例中，在上文論述的步驟(C)中，在足以使每一結合搭配物與其在類 孢子細胞群每一細胞上可能存在的目標結合的條件下，細胞與第一標記物特異性第一結合搭配物以及第二標記物(不同於第一標記物)特異性第二結合搭配物接觸；(d)選擇對標記物呈陽性的第一類孢子細胞子群；(e)使第一類孢子細胞子群與對一種或一種以上其它細胞表面標記物具特異性的一種或一種以上其它結合搭配物在足以使每一結合搭配物與其在細胞群每一細胞上可能存在的目標結合的條件下接觸；(f)從第一細胞子群取出結合於步驟(e)的至少一種抗體的細胞；和(g)收集第二細胞子群，由此分離類孢子細胞子群。在一些實施例中，結合搭配物是細胞表面標記物特異性抗體。所揭露的子群的分離可使用能根據一種或一種以上特定標記物的表達或表達的缺乏而分離細胞的任何方法(包括(但不限於)螢光活化細胞分選法(fluorescence-activated cell sorting,FACS))進行。標記物選自由以下各物組成的群組0ct4、nanog、Zfp296、cripto、Gdf3、UtFl、Ecal、Esgl、Sox2、Pax6、巢蛋白、SCA-1、CD29、CD34、CD90、BI 整合素、cKit、SP-C, CC10、SFl、DAXl、SCG 10、SCA-1、CD34、CD90、CKIT、BI整合素。
分離步驟可按一系列步驟逐步或同時進行。舉例來說，可個別地評估每一標記物的存在或不存在，根據個別標記物的存在與否，在每一步驟產生兩個子群。之後，可選出相關子群，並根據下一標記物的存在或不存在再分。或者，可通過只分出具有特定標記物概況(marker profile)的細胞來產生子群，其中短語「標記物概況」是指關於兩種或兩種以上標記物存在或不存在的概要。這些個別標記物組合中每一者都表示一種不同的標記物概況。當添加其它標記物時，這些概況會變得更複雜，並對應于越來越小的初始混合的細胞群的百分含量。在一些實施例中，採用標記物特異性抗體來分離和/或純化具有相關標記物概況的類孢子細胞子群，並且應了解，根據相關標記物概況，可使用這些抗體陽性或陰性選擇某一群體的數個部分，這些部分在一些實施例中接著再分成數部分。在一些實施例中，結合搭配物標記有可檢測標記。結合不同標記物的不同結合搭配物可標記有不同可檢測標記，或者可採用相同可檢測標記。所屬領域技術人員已知多種可檢測標記，以及用於將可檢測標記與例如抗體和其片段和/或衍生物等生物分子偶聯的方法。代表性可檢測部分包括(但不限於)共價連接的發色團、螢光部分、酶、抗原、具有特異性反應性的基團、化學發光部分和可以電化學方式檢測的部分等。在一些實施例中，結合搭配物經生物素化。在一些實施例中，使用包含與螢光標記(包括(但不限於)Cy3、Cy5和Cy7)偶聯的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素基團的第二結合搭配物來檢測結合細胞表面上的標記物的生物素化結合搭配物(第一結合搭配物)。在一些實施例中，結合搭配物用例如Cy3、Cy5或Cy7等螢光標記直接標記。在一些實施例中，結合搭配物用螢光標記直接標記，且結合抗體的細胞藉助螢光活化細胞分選法分離。所屬領域技術人員已知其它檢測策略。III.類孢子細胞子群的應用細胞培養和遺傳操作本文中揭露的細胞可直接投予患者；在投予前經過誘導而分化成內胚層、外胚層或中胚層中任一來源的細胞；或者可遵循遺傳操作使其表達特定因子。舉例來說，可通過用包括編碼這些因子的序列的基因構築體轉染類孢子細胞子群，來使其表達激素，例如胰島素。類孢子細胞子群的分化類孢子細胞子群不管其來源組織如何都可經過誘導而分化成來自三種胚層中任一種的細胞，例如皮膚和毛髮細胞，包括上皮細胞、角化細胞、黑素細胞、脂肪細胞；形成骨骼、肌肉和結締組織的細胞，例如肌細胞、軟骨細胞、骨細胞、肺泡細胞；實質細胞，例如肝細胞、腎細胞、腎上腺細胞和胰島細胞(例如a細胞、S細胞、PP細胞和P細胞)；血液細胞(例如白細胞、紅細胞、巨噬細胞和淋巴細胞)；視網膜細胞(和感官知覺中所涉及的其它細胞，例如形成耳中的毛細胞或舌上的味蕾的細胞)；神經組織，包括腦和神經；和成纖維細胞。類孢子細胞子群可經過誘導而以多種方式分化。標記物陽性類孢子細胞當與患者體內的組織接觸或與將受組織釋放的物質(例如生長因子、酶或激素)影響的所述組織足夠接近時可發生分化。細胞分化受細胞從周圍組織接收到的信號影響。舉例來說，當細胞表面上的受體結合併轉導來自患者體內組織所釋放的分子(例如生長因子、酶或激素)的信號時，將發生此信號傳導。或者，或另外，可通過將某種物質(例如生長因子、酶、激素或其它信號傳導分子)添加到細胞環境中，來誘 導本文中揭露的細胞分化。舉例來說，可將某種物質添加到含有類孢子細胞子群的培養皿中、添加到適於將細胞施用於組織的網格或其它襯底，或添加到患者體內的組織中。當全身或局部投予誘導細胞分化的物質時，其可根據藥學上可接受的方法投予。舉例來說，可在載劑或賦形劑存在或不存在下，以生理學相容的緩衝液投予蛋白質、多肽或寡核苷酸。因此，類孢子細胞子群可在培養物中或在患者體內分化，並且可在與固體支撐物接觸或暴露於自然表達、外源投予或因遺傳操作而表達的物質後進行分化。在一個實施例中，通過將類孢子細胞群暴露於「外胚層分化」培養基來誘導所述細胞分化成外胚層來源的細胞。在另一實施例中，通過將類孢子細胞群暴露於「中胚層分化培養基」來誘導所述細胞分化成中胚層來源的細胞。在又一實施例中，通過將類孢子細胞群暴露於「內胚層培養基」來誘導所述細胞分化成內胚層來源的細胞。所屬領域技術人員已知「內胚層」、「中胚層」和「外胚層」培養基的組分。可使用已知的細胞表面標記物來驗證細胞確實分化成相應細胞培養基譜系的細胞。最普遍認可的用以確定三種胚層分化的標記物是a胎蛋白(對於內胚層細胞)、a平滑肌肌動蛋白(對於中胚層)和￠-111微管蛋白(對於外胚層)的表達，所有這些蛋白質通常都是在這些組織發肓的最早期表達。不管分化的刺激物如何，足以幫助維持或修復組織的已經分化或將要分化的類孢子細胞子群都可投予患者(例如，皮膚燒傷或其它受外傷區域、骨折、韌帶撕裂、萎縮的肌肉、功能失常的腺體或受神經退化過程或自體免疫反應不良影響的區域的部位)。腫瘤類孢子細胞(i)疫苗治療獲得的類孢子細胞子群可為特別有用的研究工具，並且有可能用於療法中，例如，從胰臟腫瘤分離的類孢子細胞可與樹突狀抗原呈遞細胞一起使用，作為連續細胞介導的疫苗。目前的實驗性樹突狀細胞疫苗使用了很短的一段時間，但最終失敗了，很可能是因為這些疫苗是源自於成熟腫瘤細胞。如果腫瘤細胞的遺傳學發生改變，那麼疫苗可能會變得無用，類似於每年的病毒流感疫苗所出現的情形。獲得有力進化的腫瘤幹細胞應能製造出更有效的疫苗。可培養腫瘤源性類孢子細胞群並用於刺激免疫系統細胞攻擊並潛在地治療腫瘤或惡性疾病，如例如廖(Liau)等人，神經腫瘤學雜誌(J. of Neuro. )90(6)1115-24(1999)中所證實。廖等人(1999)證實，可通過實際地分離特定類型腦腫瘤(顱內膠質瘤)的細胞，並刺激可源自於患者的稱為樹突狀細胞的特定類型免疫細胞，所述免疫細胞接著實際地處理由腫瘤細胞產生的抗原，並由此刺激免疫系統其餘部分攻擊實際腦腫瘤，引起腫瘤消退或消失，以此治療腦腫瘤。此攻擊是通過由例如T-8、T-4以及B細胞和自然殺傷細胞等免疫細胞產生的細胞因子的產生來介導。這一特殊方法已經在治療腦腫瘤的動物和早期人類試驗中顯示出治療益處。這種技術的一個主要局限性在於，儘管能製造出針對特定類型腫瘤細胞的有效疫苗，但隨時間推移，腫瘤發生突變，並因此可能產生不會對初始疫苗具反應性的新腫瘤。因此，可使用將表達更多種抗原並能持續保持在培養狀態的腫瘤源性類孢子細胞代替腫瘤細胞。由於這些類孢子細胞表達抗原並發生突變,故可以合成最新的疫苗，並用於治療患者的腫瘤復發。人們已經注意到，在稱為胰島瘤的特定類型腫瘤中存在類孢子細胞。沒有理由預期無法從所有腫瘤類型分離出類孢子細胞。使用腫瘤源性類孢子細胞刺激疫苗的一個潛在優勢在於這樣一個事實因為類孢子細胞非常原始，所以其具有充分的潛力來表達並分化成多種腫瘤細胞，且表達多種抗原。換句話說，如果使用較為基礎的腫瘤細胞來製造疫苗，那麼針對具有較大潛力產生不同類型腫瘤抗原的細胞的免疫反應的多樣性將會因腫瘤中發生的自然突變而最終產生更有效的疫苗。此外，還可能從血液、骨髓和胸腺分離出能夠分化成免疫系統所有細胞類型(包括自然殺傷細胞、T-4和T-8細胞，以及B或抗體產生細胞)的類孢子細胞。另外,樹突狀細胞(抗原呈遞細胞)可由類孢子細胞進化得到。這將有可能不僅利用各種類型腫瘤細胞，而且利用例如病毒、HIV和細菌(例如炭疽)等微生物在體外刺激免疫系統。這樣可提供一種產生針對腫瘤和例如 HIV和炭疽熱等感染性疾病的新疫苗的機制。此外，還可能在體外培養通過活檢從腫瘤得到的類孢子細胞，並且可使用不同治療劑來測試針對體外惡性類孢子細胞的作用，由此預測治療劑為化療劑、疫苗或輻射時患者的反應。就像從病弱的患者分離細菌並通過培養和敏感性測試以選擇有效抗生素治療一樣，從活檢樣品分離腫瘤類孢子細胞將有可能進行腫瘤培養和化療敏感性測試。此外，從患者分離的腫瘤類孢子細胞將適用於不斷演變的分子診斷學和蛋白質組學領域，由此概述出患者腫瘤所需的診斷和治療介入。(ii)腫瘤細胞的DNA修復活細胞中的DNA常常暴露於損傷劑，例如輻射、致癌物質和氧化。已知DNA受損與細胞的惡性轉化相關聯。因此，細胞因DNA修復基因的存在而受到保護，免於變為惡性。舉例來說，如果某個人對於某一特定類型的癌症具有遺傳傾向，那麼在一些情況下，這種DNA修復系統的缺陷可得以證實。一個實例是遺傳性非息肉病性結腸癌綜合症。這種疾病由表現為家族性結腸癌的DNA修復缺陷組成。核苷酸錯配可導致癌症。正常DNA修復基因將校正此錯配，並由此防止腫瘤形成。近期的幹細胞研究顯示，神經元幹細胞具有跟蹤和追捕到遷移的膠質瘤(一種特定類型的腦腫瘤)細胞的能力。歸因於此腫瘤追蹤現象，使得神經幹細胞中插入例如幹擾素-Y、腫瘤壞死因子和白細胞介素12等化學物質的基因。移植後，這些獨特的幹細胞隨即能夠追捕到腦腫瘤細胞，並通過分泌抗腫瘤化學劑損傷這些細胞。此外，近期的文獻證實，成體幹細胞當放入體內時能夠與正常細胞融合。與上文論述的DNA修復相關的揭露內容可例如見於以下文獻中奧雷尼克(Ourednik)等人，自然生物技術(Nature Biotechnol), 20 (11) :1103-1110 (2002);斯蒂沃特(Stewart)等人，生物短評(Bioessays), 24 (8) =708-13(2002);艾特撒(Ehtesam)等人，癌症療法(CancerTherapy) ,9(11) :925-934(2002);艾特撒等人，癌症研究(Cancer Reserves)，62 (20)5657-63(2002);弗格森(Ferguson)等人，致癌基因(Oncogene) 20 (40) :5572-9 (2001)。因此，可使用本文中揭露的類孢子細胞群，使用通過追蹤找尋到惡性細胞、融合和DNA修復的獨特特性治療腫瘤。據觀察，在體外類孢子細胞與在培養物中與所述類孢子細胞一起生長的正常細胞群集並融合。類孢子細胞能夠容易地從加有抗凝血劑的非製備型冷凍血液分離，並在培養物中擴增。與神經幹細胞相反，這些類孢子細胞特別易於由血液得到，並且當培育時數量迅速增加。此外，類孢子細胞很小，因此，其因數量大、尺寸小和結構極為簡單而與腫瘤細胞融合的機會較大。先前的描述基本上顯示了膜結合DNA的很小且很簡單的結構或袋。所有細胞都具有天然DNA修復系統。一個實例為核酸內切酶，其可切掉受損、缺陷型DNA，隨後使用DNA聚合酶，用正常DNA代替這些受損的DNA區段。隨著細胞老化，其DNA修復系統失效，由此發生惡性轉化。大部分的癌症治療方法都集中在手術移除腫瘤以及使用腫瘤細胞殺滅機制，例如化療、輻射或免疫療法。這些方法伴隨著顯著的發病率，且並不總是有效。即使已知這些修復系統存在，但還沒有使用DNA修復將腫瘤細胞轉變成正常細胞的方法，並且癌症的發生涉及這些修復系統的失效。輸注數十億個源自於患者自身血 液且具有可找尋並追捕到腫瘤細胞的新DNA修復系統的類孢子細胞將能夠與腫瘤細胞融合，並將其DNA修復系統貢獻給有缺陷的腫瘤細胞。其也可通過分泌具有營養作用的因子而對腫瘤細胞發揮修復作用。這些類孢子細胞可直接輸注到腫瘤中或通過靜脈內(IV)或腹膜內(IP)途徑提供。由於此舉將增強已知存在的天然DNA修復系統，故與例如化療等較為傳統的細胞自毀方法相比較，副作用將最小。由患者自身的血液可基本上產生無限數量的類孢子細胞來完成此任務。此外，還可使用基因插入技術將表達例如幹擾素Y和腫瘤壞死因子等抗腫瘤物質的核苷酸序列插入類孢子細胞中。一旦輸注，這些經過遺傳工程改造的類孢子細胞就將追捕腫瘤細胞，並與其融合，由此將具有治療作用的幹擾素或TNF直接遞送到腫瘤。此方法代表著現有技術的改進，因為類孢子細胞群可在體外擴增以供應無窮量的簡單細胞結構，這些細胞結構可追捕、融合併由此修復腫瘤細胞中所發現的受損DNA。現有技術已經證實，神經幹細胞具有這些特性，但從患者採集神經幹細胞可能伴隨許多風險。這種治療方法可用於治療乳房、肺、腦和前列腺以及其它器官的癌症。(iii)退化性疾病的逆轉基於基因的治療方法或基因插入技術涉及特定核苷酸序列或基因的有效遞送，此舉將因所述特定基因產生的所需蛋白質的產生而引起臨床改進。潛在應用包括用於癌症、疫苗、遺傳和代謝病症以及包括病毒感染、心血管疾病和其它器官疾病狀態在內的其它區域的治療方法。基於基因的治療方法的一個主要限制是找到一種適宜且有效的遞送系統。已經針對基因插入和腺病毒載體以及隨之發生的患者感染作了大量工作，因所需治療基因的插入而引起所需蛋白質的表達。問題包括無效基因插入所需宿主細胞中，以及實際上感染宿主的病毒載體的有害作用。如實例中所證實，可容易地從包括體外擴增的血液的患者分離類孢子細胞群；可通過例如靜脈內、腹膜內或皮下等各種途徑將類孢子細胞安全地回輸給患者。可使用例如瓦坎提等人，移值進展(Transplantation Proceedings),33 :592-598(2001)中所揭露的技術等技術，在體外環境中插入編碼例如因子8 (用於治療血友病)等蛋白質的基因，使帶有新治療基因和產物的類孢子細胞群擴增。潛在應用的其它證據包括Brdu的表達，表明活性核酸的合成。此方法也可利用類孢子細胞群以重組技術實際在體外產生例如因子8等所需治療蛋白，由此產生治療蛋白。理想的情況是，有可能實現持久的體內作用。舉例來說，可從血友病或戴薩克斯氏病(Tay Sach' s disease)患者分離出血液類孢子細胞群，在體外插入基因，隨後可將經基因校正的細胞(correctedcell)安全地再植入患者中，使有校正酶缺陷並治癒疾病的潛力的細胞增殖。導致疾病的任何已知基因酶缺陷都適於使用此方法處理。有可能治療的遺傳疾病包括例如亨廷頓氏病(Huntington' s Disease)、肌肉萎縮症、家族性高膽固醇血症、囊腫性纖維化、苯酮尿症、血色病、鐮狀細胞貧血和糖原貯積病。隨著人類基因組圖譜的繪製，最終將研究出大多數導致疾病的遺傳突變，為利用適當基因插入技術進行治療提供了可能。自體源性類孢子細胞群可提供遞送這些經校正基因所需的媒介。這些類孢子細胞群尺寸小以及分裂和允許插入治療性核酸序列供表達的非凡能力的特性表明，這是一種合理的應用。基因插入可在體外利用僅包括所需基因序列的單獨裸DNA於類孢子細胞中發生。此舉將防止與使用例如腺病毒技術等病毒載體有關的任何種類的潛在危險。使用此基因插入模式可提供額外的治療方法，例如插入核酸序列以製造治療劑，例如腫瘤抑制蛋白或血管生成抑制劑，由此使腫瘤停止生長。可插入類孢子細胞群中的另一基因包括血管活性基因，例如VEGF，其用以治療缺血性心臟病，由此避免旁路心臟手術的需求。類孢子細胞可表達將產生用於治療囊腫性纖維化的蛋白質的CFRT基因，這些類孢子細胞已經通過循環行進到肺部，或已經通過支氣管注射到肺中，由此移入肺組織中並發生分化，產生所需的基因產物來幫助治療囊腫性纖維化的症狀。 如果需要大量產生所需產物，那麼可利用生物可降解的骨架材料、水凝膠或例如從冷凍血液和其它組織(例如心臟、肺和CSF)分離的天然來源的基質植入類孢子細胞。基因插入療法先前的一個局限性是產物量隨時間推移可能會因經基因校正的細胞在體內耗散並最終消失而減少。使用在天然或生物可降解骨架上插入基因核苷酸的類孢子細胞群產生組織構築體，將是克服此限制的一種方式。用於投予細胞的結構和製劑可藉助包括單獨或在載體或支撐結構之上或之中的類孢子細胞群的組合物，將細胞群投予患者。在許多實施例中，將不需要載體。通過將類孢子細胞注射到需要所述細胞的部位之上或之中來進行投予。在這些情況下，類孢子細胞通常將通過洗滌移除細胞培養基，並且將懸浮於生理性緩衝液中。在其它實施例中，細胞將具備支撐結構，或將被合併到支撐結構之上或之中。支撐結構可為網格、固體支撐物、管、多孔結構和/或水凝膠。支撐結構在整體上或部分上可為生物可降解或非生物可降解的。所述支撐物可由天然或合成聚合物、金屬(例如鈦)、骨骼或羥磷灰石或陶瓷形成。天然聚合物包括膠原蛋白、透明質酸、多糖和葡糖胺聚糖。合成聚合物包括聚羥基酸(例如聚乳酸、聚乙醇酸和其共聚物)、聚羥基烷酸酯(例如聚羥基丁酸酯)、聚原酸酯、聚酸酐、聚氨酯、聚碳酸酯和聚酯。固體支撐物支撐物結構可為鬆散的編織或非編織網格，其中細胞被接種於網格中和網格上。所述結構可包括固體結構支撐物。所述支撐物可為管，例如用於使神經軸突再生長的神經管。所述支撐物可為支架或瓣膜。所述支撐物可為例如膝關節或髖關節等關節或其部分的假體，其具有多孔界面，允許細胞內生長和/或將細胞接種於多孔結構中。支撐物結構可為一種可滲透結構，其具有成形並且支撐水凝膠-細胞混合物的孔狀腔或空隙。舉例來說，支撐物結構可為多孔聚合物網格、天然或合成海綿，或者由金屬或例如骨骼或羥磷灰石等材料形成的支撐物結構。支撐物結構的孔隙度應使得養分能擴散到結構中，由此有效地到達細胞內部，並且由細胞產生的廢物可擴散到結構外。支撐物結構可成形為符合所需新組織的空間。舉例來說，支撐物結構可成形為符合燒傷的皮膚區域或者損失的軟骨或骨骼部分的形狀。根據製造的材料，支撐物結構可通過切割、成型、澆鑄或任何產生所需形狀的其它方法成形。支撐物可在用細胞接種或用水凝膠-細胞混合物填充支撐物結構之前或之後成形，如下文所述。其它因子，例如生長因子、誘導分化或脫分化的其它因子、分泌產物、免疫調節劑、消炎劑、退化因子、促進神經支配(innervation)或增強淋巴網絡的生物活性化合物和藥物，都可併入聚合物支撐物結構中。
適合聚合物的實例是丙交酯乙交酯共聚酯(polyglactin)，其為乙交酯與丙交酯的90 10共聚物，並且被製造為VICRYL 編織型可吸收縫合線(艾斯頓公司(EthiconCo.)，新澤西州薩默維爾市(Somerville，N.J.))。聚合物纖維(例如VICRYL )可被編織或壓製成毛氈狀聚合物薄片，其接著可被切割成任何所需的形狀。或者，聚合物纖維可在模具中壓制在一起，所述模具將聚合物纖維澆鑄成支撐物結構所需的形狀。在一些情況下，可將其它聚合物添加到聚合物纖維內，因為這些聚合物經成型以修改或賦予纖維網格其它結構。舉例來說，可將聚乳酸溶液添加到此聚乙醇酸纖維網格薄片中，並且可一起成型所述組合以形成多孔支撐物結構。聚乳酸結合聚乙醇酸纖維的交聯物，由此用這些物質塗覆個別纖維，並固定經成型纖維的形狀。聚乳酸還填充於各纖維之間的空間中。因此，可根據引入支撐物中的聚乳酸的量改變孔隙度。將纖維網格成型成所需形狀所需的壓力可能相當溫和。所需要的只是將纖維固持在合適的位置，保持足夠長時間以發揮聚乳酸的結合和塗覆作用。或者，或另外，支撐物結構可包括由此項技術中已知的技術製造的其它類型的聚合物纖維或聚合物結構。舉例來說，可通過蒸發聚合物溶液中的溶劑獲得薄聚合物膜。如果由具有所需形狀的凸紋圖案的模具蒸發聚合物溶液，那麼可將這些膜澆鑄成所需形狀。也可使用此項技術中已知的壓縮成型技術將聚合物凝膠成型成薄的可滲透聚合物結構。許多其它類型的支撐物結構也是可能的。舉例來說，支撐物結構可由海綿、泡沫狀物、珊瑚或具有內部孔的生物相容性無機結構，或由交錯編織的聚合物纖維製成的網格薄片形成。這些支撐物結構可使用已知方法製備。水凝膠在另一實施例中，細胞與水凝膠混合以形成細胞-水凝膠混合物。此細胞-水凝膠混合物可直接施用於受損組織。舉例來說，如美國專利第5，944，754號中所述，水凝膠-細胞混合物可簡單地刷塗、浸潰或噴塗到所需表面上，或者傾倒或以其它方式施用以填充所需腔或裝置。水凝膠提供一種供細胞粘附和生長的薄基質或骨架。當與患者的病症相關的組織具有不規則形狀時，或當將細胞施用於遠端部位時(例如，當將類孢子細胞置於腎囊之下以治療糖尿病時)，這些投藥方法可能特別適合。或者，可將水凝膠-細胞混合物引入可滲透的生物相容性支撐物結構中，以致所述混合物基本上填充支撐物結構，並且當其凝固時呈現支撐物結構的形狀。因此，支撐物結構可導引由置於其中的類孢子細胞或其子代成熟的組織的發育和形狀。如下文進一步描述，支撐物結構可在用水凝膠-細胞混合物填充之前或之後提供給患者。舉例來說，支撐物結構可置於組織(例如皮膚、肝臟或骨骼系統的受損區域)內，隨後使用注射器、導管或其它適合裝置用水凝膠-細胞組合物進行填充。需要時，可使支撐物結構的形狀符合受損組織的形狀。在以下小節中將描述適合的支撐物結構、水凝膠和遞送方法。水凝膠應為生物相容、生物可降解的，能夠維持活細胞且優選能夠在體內迅速(例如在遞送到支撐物結構之後約5分鐘內)凝固。大量細胞可均勻分布於水凝膠內。水凝膠通常可支撐約5X IO6個細胞/毫升。水凝膠還能夠擴散以使養分到達細胞並帶出廢物。可使用多種不同的水凝膠。這些水凝膠包括(但不限於):(I)在體溫下凝固或凝結的溫度相關性水凝膠(例如PLUR0NICS ) ；(2)通過離子交聯的水凝膠(例如海藻酸鈉)；
(3)通過曝露於可見光或紫外光凝結的水凝膠(例如具有丙烯酸酯端基的聚乙二醇聚乳酸共聚物)；和⑷在PH改變時凝結或凝固的水凝膠(例如TETR0NICS )。所屬領域技術人員 已知用於合成上述其它聚合物的方法。參看例如聚合物科學與工程簡明百科全書(ConciseEncyclopedia of Polymer Science and Engineering), J. I.克洛維茲(J. I. Kroschwitz)編，約翰威立出版公司(John Wiley and Sons),紐約州紐約市(New York, N. Y. ), 1990。許多聚合物，例如聚(丙烯酸)、海藻酸鹽和PLUR0NICS 都是市售的。可使用離子型多糖(例如海藻酸鹽或殼聚糖)來懸浮活細胞，包括類孢子細胞和其子代。這些水凝膠可通過使海藻酸(一種從海藻分離的碳水化合物聚合物)的陰離子鹽與例如鈣陽離子等離子交聯來製造。水凝膠的強度隨鈣離子或海藻酸鹽的濃度增加而增力口。美國專利第4，352，883號描述了海藻酸鹽與二價陽離子在水中於室溫下發生離子交聯，形成水凝膠基質。將類孢子細胞子群與海藻酸鹽溶液混合。將所述溶液遞送到已經植入的支撐物結構，隨後其因體內生理濃度的鈣離子的存在而在短時間內凝固。或者，在植入前將溶液遞送到支撐物結構，並使其在含鈣離子的外部溶液中凝固。一般說來，這些聚合物可至少部分溶於水溶液(例如水、具有帶電側基的水性醇溶液或其單價離子鹽)。存在許多帶有可與陽離子(例如聚(磷腈)、聚(丙烯酸)和聚(甲基丙烯酸))反應的酸性側基的聚合物的實例。酸性基團的實例包括羧酸基團、磺酸基團和滷代(優選氟代)醇基團。帶有可與陰離子反應的鹼性側基的聚合物的實例為聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基吡啶)和聚(乙烯基咪唑)。通過使帶有帶電側基的水溶性聚合物與含有帶相反電荷的多價離子的水溶液反應來使聚合物交聯，所述多價離子當所述聚合物具有酸性側基時為多價陽離子，或當所述聚合物具有鹼性側基時為多價陰離子。用於使聚合物與酸性側基交聯形成水凝膠的陽離子包括二價和三價陽離子，例如銅、鈣、鋁、鎂和鍶。將這些陽離子鹽的水溶液添加到聚合物中以形成柔軟、高度膨脹的水凝膠。用於使聚合物交聯形成水凝膠的陰離子包括二價和三價陰離子，例如低分子量二羧酸根離子、對苯二甲酸根離子、硫酸根離子和碳酸根離子。將這些陰離子鹽的水溶液添加到聚合物中以形成柔軟、高度膨脹的水凝膠，如關於陽離子所述。為防止抗體進入水凝膠但允許養分進入，水凝膠中有用聚合物的尺寸在介於IOkDa與18. 5kDa之間的範圍內。較小的聚合物產生密度較高且孔較小的凝膠。也可使用溫度相關性或熱敏感性水凝膠。這些水凝膠具有所謂的「反向膠凝(reverse gelation) 」特性，即，其在室溫或低於室溫下為液體，並且當升溫到較高溫度(例如體溫)時發生膠凝。因此，這些水凝膠易於在室溫或低於室溫下以液體形式施用，並且當升溫到體溫時自動形成半固體凝膠。結果，當首先將支撐物結構植入患者體內，隨後用水凝膠-細胞組合物填充時，這些凝膠特別適用。所述溫度相關性水凝膠的實例為PLUR0NICS (巴斯夫-萊多特公司(BASF-Wyandotte))，例如聚氧乙烯-聚氧丙烯F-108、F-68和F-127、聚(N-異丙基丙烯醯胺)和N-異丙基丙烯醯胺共聚物。這些共聚物可用標準技術操作以影響其物理特性，例如孔隙度、降解速率、轉變溫度和硬度。舉例來說，在鹽存在和不存在下添加低分子量糖會影響典型熱敏感性聚合物的下限臨界溶解溫度(lower critical solution temperature, LCST)。此外，當通過在 4°C下分散來製備濃度在介於5%與25% (W/V)範圍內的這些凝膠時，粘度和凝膠-溶膠轉變溫度會受到影響，所述凝膠-溶膠溫度與濃度呈反相關。這些凝膠具有能夠使類孢子細胞和其子代存活並得到滋養的擴散特徵。美國專利第4，188，373號描述使用PLUR0NIC 多元醇的水性組合物來提供熱膠凝 水性系統。美國專利第4，474，751號、第4，474，752號、第4，474，753號和第4，478，822號描述利用熱凝性聚氧亞烴基凝膠的藥物遞送系統。利用這些系統，凝膠轉變溫度和/或凝膠硬度二者都可通過調整PH值和/或離子強度以及聚合物的濃度加以改變。其它適合的水凝膠具pH相關性。這些水凝膠在等於、低於或高於特定pH值下為液體，並且當暴露於特定PH值(例如7. 35到7. 45，即人體內細胞外流體的正常pH範圍)時膠凝。因此，這些水凝膠能夠以液體形式容易地遞送到植入的支撐物結構，並在暴露於體內PH時自動形成半固體凝膠。所述pH相關性水凝膠的實例為TETR0NICS (巴斯夫-萊多特公司)、乙二胺的聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物、聚(甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯-g_乙二醇)和聚(甲基丙烯酸2-羥基甲酯)。這些共聚物可通過標準技術操作以影響其物理特性。可用於投予類孢子細胞或其子代的其它水凝膠可藉助可見光或紫外光凝固。這些水凝膠由包括水溶性區域、生物可降解區域和至少兩個可聚合區域的大分子單體製成(參看例如美國專利第5，410，016號)。舉例來說，水凝膠可以生物可降解、可聚合大分子單體開始，所述大分子單體包括核心、在核心每一端上的延伸和在每一延伸上的端帽(endcap)。所述核心為親水性聚合物，延伸為生物可降解聚合物，且端帽為能夠使大分子單體在曝露於可見光或紫外光(例如長波長紫外光)時交聯的寡聚物。所述光凝固水凝膠的實例包括聚氧乙烯嵌段共聚物、具有丙烯酸酯端基的聚乙二醇聚乳酸共聚物以及兩端由丙烯酸酯封端的IOK聚乙二醇-乙交酯共聚物。與PLUR0NIC 水凝膠相同，這些包含所述共聚物的水凝膠可通過標準技術操作以改變其物理特性，例如降解速率、結晶度差異和硬度。水凝膠可通過注射或導管或者在植入其它支撐物結構時投予。交聯可在投予之前、期間或之後發生。除非另作定義，否則本文中使用的所有科技術語都具有與本發明所屬領域技術人員通常所了解相同的含義。本文中引用的出版物以及這些出版物中引用的材料都明確地以引用的方式併入本文中。實施例
使用專利申請案中所述的方法，從骨髓以及數個代表內胚層、中胚層和外胚層的組織中分離類孢子細胞群。分離後立即將細胞放入由DMEM/F12及抗生素B27、FGF和EGF構成的稱為「基礎培養基」的培養基中。細胞在此基礎培養基中維持數周，在此期間，執行連續研究以鑑別這些細胞所表達的標記物。使用基因表達分析和免疫組織化學針對蛋白質表達的鑑別來鑑別標記物。在暴露於「基礎培養基」的同時，分析從代表內胚層、中胚層和外胚層的組織獲取的類孢子細胞中與胚胎幹細胞相關的標記物的表達。從內胚層組織(肺和肝臟)、中胚層組織(肌肉)和外胚層組織(脊髓和腎上腺)獲得的類孢子細胞群都表達與骨髓獲取的類孢子細胞相同的基因和蛋白質標記物組，並且當維持於「基礎培養基」中時不存在與骨髓源性類孢子細胞相同的標記物。隨後將細胞暴露於三種分化培養基中的一種內胚層分化培養基、中胚層分化培養基和外胚層分化培養基。各培養基的組成如下 內胚層分化培養基肝細胞培養基抗壞血酸、BSA-FAF,氫化可的松(hydrocortisone)、轉鐵蛋白、胰島素、hEGF、吉諾黴素(genomyosin)加10%胎牛血清。中胚層分化培養基DMEM加20%胎牛血清。外胚層分化培養基加有10%胎牛血清的由DMEM/F12加B27、BEDA FGF,EGF構成
的基礎培養基。當將類孢子細胞群(包括從骨髓和所述代表性組織中每一者獲取的解聚細胞團)暴露於如上文所述補充的各「分化培養基」時，如由已知蛋白質和基因標記物的表達所確定，細胞根據所用培養基而分化成內胚層、中胚層或外胚層的代表性細胞，即，當使用內胚層分化培養基時，細胞表達與內胚層組織一致的以下蛋白質標記物細胞角蛋白18、白蛋白和a胎蛋白。也表達基因標記物GATA4。當使用中胚層分化培養基時，細胞表達與中胚層組織一致的以下蛋白質標記物肌球蛋白(myosin)、肌間線蛋白(desmin)、a平滑肌肌動蛋白。也表達基因標記物burachyury。當使用外胚層分化培養基時，細胞表達與外胚層組織一致的以下蛋白質標記物巢蛋白、Map2P-III微管蛋白(二者都為神經元標記物)、04(少突細胞的標記物)、GFAPs (膠質細胞的標記物)。Map2的表達也通過基因表達分析驗證。所屬領域技術人員應了解，最普遍認可的用以確定三種胚層的分化的標記物是a胎蛋白(對於內胚層)、a平滑肌肌動蛋白(對於中胚層)和￠-111微管蛋白(對於外胚層)的表達，所有這些蛋白質通常都是在這些組織發育的最早期表達。此外，基因標記物map2、burachyury和gata4都是在胚胎胚層形成的極早期表達。結果(i)骨髓源性類孢子細胞從骨髓分離的類孢子細胞群在數天內產生多個細胞團。包含在所述細胞團內或單獨的個別細胞表達以下基因標記物，所有這些標記物都與胚胎幹細胞相關0ct4、Nanog、Daxl> Fgf4、Zfp296、Cripto、Gdf3> Utfl> Cdx2、Ecatl> Esgl> Sox2 和 Pax6、cMyc (增殖性基因)、Fgf5、01ig2和Pdgfrl2。也觀察到標記物巢蛋白(一般與神經幹細胞相關的標記物)。
0ct4是POU轉錄因子，且nanog是NK-2類同源異型盒轉錄因子，二者都與胚胎幹細胞未分化狀態和多能性的維持有關。(潘(Pan)等人，細胞研究(Cell Res. ), 12 321-329(2002);克拉克(Clark)等人，幹細胞(Stem Cells)，22 :169-179 (2004);丹羽(Niwa)，發育學(Development)，134 :635-646 (2007))。Cripto (畸胎瘤源性生長因子 I ;在內層細胞團中早期表達的標記物)是一種多功能細胞表面蛋白，在脊椎動物胚胎發生中起到重要作用(斯曲茲(Strizzi)，致癌基因，24 :5731-5741 (2005))。⑶F3是TGF P配體超家族的成員，特定地以多能狀態表達(萊維(Levine)，發育學，133 :209-16 (2005))。未分化胚胎轉錄因子(Undifferentiated embryonic transcription factor, UtFl)最初被鑑別為在小鼠胚胎幹細胞中以幹細胞特異性方式表達的轉錄輔因子。Utf I是針對多能性的假定標記物(丹羽，細胞結構和功能(Cell Structure and Function), 26 (3) :137-148 (2001))。胚胎幹細胞相關性轉錄物 I (Embryonic stem cell associated transcript I, Ecatl)是胚胎幹細胞相關性轉錄基因(trans gene)。胚胎幹細胞特異性基因(Embryonic stemcell-specific gene, Esgl)編碼含KH結構域的蛋白，在包括ES細胞、胚胎胚細胞和專能生殖系幹細胞在內的多能細胞中表達(靜音-筱原(Kanatsu-Shinohara),細胞(Cell), 1001-1012 (2004)) o 性別決定區(sex determining region, SRY)盒 2,又稱 Sox2 和 Pax6，是與ES細胞和神經幹細胞相關的標記物。Sox2是誘導性多能幹細胞中所需的一個關鍵轉錄因子(趙(Zhao)，細胞生物化學雜誌(J. Cell Biochem. ) 105(4) :949-55 (2008))。巢蛋白是主要在來自中樞神經系統的幹細胞中表達的VI類中間絲蛋白(弗雷德瑞斯坎(Frederisken)等人，神經科學雜誌(J. Neurosci)，8 :1144-51 (1988))。因此，從骨髓獲得的類孢子細胞表達指示多能性的標記物。如由免疫組織化學所證實，這些細胞還表達與胚胎幹細胞相關的以下蛋白質標記物C_kit和Scal (表面標記物)以及E- I丐粘素。應注意一個事實從骨髓分離的類孢子細胞針對以下胚胎幹細胞標記物染色呈陰性Daxl、成纖維細胞生長因子4(fibroblast growth factor 4,Fgf4)、尾側型同源異型盒轉錄因子 2 (caudal type homeobox transcription factor 2, Cdx2)、Neo 和 Eras (ES 的腫瘤形成基因)和Rex I。這些細胞針對神經嵴幹細胞標記物P75染色呈陰性。其也不表達以下蛋白質標記物Cd45、Cd31或Cd34(內皮細胞和造血幹細胞標記物)。(ii)肌肉從肌肉獲得的類孢子細胞最初表達與利用從骨髓獲得的類孢子細胞所觀察相同的胚胎幹細胞標記物，即，所述細胞表達0ct4、Daxl、Fgf4、Zfp296、Cripto Gdf3> Utfl、Cdx2、Ecatl、Esgl、Sox2 和 Pax6、cMyc、Fgf5> 01ig2、Pdgfrl20與骨髓源性類孢子細胞相同，肌肉源性類孢子細胞針對Daxl、Fgf4, Cdx2、Neo和Eras,Rex I (胚胎幹細胞標記物)、P75 (神經嵴標記物)、Cd45或Cd31 (內皮細胞和造血幹細胞標記物)染色呈陰性。從肌肉分離的類孢子細胞在形成多個細胞團(呈球形式)之後，對這些細胞進行研究。這些細胞球在早達幾天內開始形成，但在初始分離後至少3周未測試到標記物。細胞球最終生長到直徑超過300微米的尺寸。由肌肉類孢子細胞形成的細胞球針對以下標記物染色呈陽性ckit，一種指示幹細胞(未必為胚胎幹細胞(ESC))的細胞表面標記物。在3周時這些細胞球中約50 %的細胞呈陽性，但在90天時僅I %到5 %呈陽性(這表明當這些細胞成熟時，其逐漸喪失其「幹細胞性(stem cellness)」)。也對從肌球(myosphere)脫落的細胞進行分析。這些細胞是由肌球生長並成熟時獲得並脫落的細胞。針對幹細胞抗原I (Sca-I)、CD31和CD45的抗體都直接與PE偶聯。針對⑶29、⑶34和⑶90的抗體都直接與FITC偶聯。細胞球中的細胞對以下標記物呈陽性SCA-U⑶29、⑶34、⑶90和BI整合素，而其對作為較成熟細胞的造血細胞和內皮細胞的標記物⑶31、⑶45呈陰性。標記物的表達隨傳代次數而變化。當從細胞球脫落的細胞附著時，其首先失去不成熟標記物CD90，隨後開始失去Sca-I。另外，肌球細胞不表達成熟細胞標記物MyoD,並且極少表達或不表達Pax7和Myf5。然而，當接種這些肌球時，粘附細胞成熟而表達Pax7、MyoD和肌間線蛋白，並在添加到分化培養基中後融合形成多核肌小管。接種到成脂培養基和成骨培養基中的肌球細胞分化成脂肪和骨骼。當肌球源性細胞用GFP標記，隨後注射到肌肉中時，其產生GFP標記的肌肉纖維。通過形成肌球產生的細胞為專能幹細胞，因為其不表達肌源性標記物，例如Pax7、Myf5和MyoD，而在其成熟時，其表達這些標記物，並且能夠形成多核肌小管、成脂細胞和成骨細胞，且可在體內使受損的肌肉再生。針對MyoD (核)、肌間線蛋白(細胞質)和Scal (表面)的染色顯示黃-紅色。針對Pax7(核)的染色顯示綠色。這些發現利用反轉錄酶PCR確定，因為肌球為肌肉形成前細胞，並且其不表達Pax7、Myf5或MyoD。而從肌球脫落的細胞附著且隨後成熟，以表達Pax7、Myf5和MyoD。(iii)肺利用從肺分離的類孢子細胞觀察到類似的時間相關性標記物表達。從肺分離的類孢子細胞最初表達cKit，隨後表達巢蛋白。之後，從細胞球脫落的細胞表達SP_C(肺泡中II型內皮細胞的標記物；基因表達和蛋白質分析)和CClO (針對克拉拉細胞(Clara cell);基因表達和蛋白質分析)。(iv)腎上腺腎上腺表達極早期幹細胞標記物，隨後成熟以表達嗜鉻細胞和製造兒茶酚胺的細胞的標記物。當最初分離時，與來自骨髓的細胞相同，從腎上腺獲得的類孢子細胞表達0ct4、Daxl、Fgf4、Zfp296、Cripto、Gdf3、Utfl、Cdx2、Ecatl、Esgl、Sox2 和 Pax6、cMyc、Fgf5、01ig2、Pdgfrl2。類似地，腎上腺源性類孢子細胞針對Daxl、Fgf4、Cdx2、Neo和Eras、Rex I (胚胎 幹細胞標記物)、P75 (神經嵴標記物)、Cd45或Cd31 (內皮細胞和造血幹細胞標記物)染色呈陰性。按時表達成熟細胞標記物SF1 (腎上腺皮質的類固醇激素合成標記物)、DAX1、SCGlO祖細胞、嗜鉻細胞(cromaffin)。(v)腦和外周神經系統腦和外周神經系統包括腦、脊髓和外周神經。在這些組織中，已經鑑別出胚胎標記物Sca-I和Oct-4。其成熟以顯示巢蛋白、外周神經中其它神經標記物和許旺氏細胞(Schwann cell)的標記物。
權利要求
1.一種分離的類孢子細胞子群。
2.根據權利要求I所述的類孢子細胞子群，其表達一種或一種以上選自由以下各物組成的群組的標記物:0ct4、nanog、Zfp296、cripto、Gdf3> UtFl> Ecatl> Esgl> Sox2、Pax6、巢蛋白、SCA-1、CD29、CD34、CD90、B1 整合素、cKit、SP-C、CC10、SF1、DAXl 和 SCGlOo
3.根據權利要求2所述的類孢子細胞子群，其中，所述細胞是從選自由外胚層、中胚層和內胚層組織組成的群組的出生後動物組織分離。
4.根據權利要求3所述的類孢子細胞子群，其中，所述出生後動物組織選自由哺乳動物、禽類、爬行動物和兩棲動物組織組成的群組。
5.根掘權利要求4所述的類孢子細胞子群，其中，所述組織選自由心臟、腸、膀胱、腎臟、肝臟、肺、腎上腺、皮膚、視網膜和胰臟組成的群組。
6.一種分離類孢子細胞子群的方法，其包含以下步驟 (a)從組織分離類孢子細胞， (b)培養所述細胞一段足以表達一種或一種以上選自由以下各物組成的群組的標記物的時間0ct4、nanog、Zfp296、cripto、Gdf3、UtFl、Ecatl、Esgl、Sox2、Pax6、巢蛋白、SCA-1>CD29、CD34、CD90、B1 整合素、cKit、SP-C、CC10、SF1、DAXl 和 SCG10,以及 (c)鑑別並分離表達所述一種或一種以上標記物的細胞。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述細胞是使用所述標記物特異性抗體分離。
8.根據權利要求7所述的方法，其包含以下步驟(a)使所述細胞群與標記物特異性結合搭配物在足以使所述結合搭配物與其在所述類孢子細胞群每一細胞上可能存在的目標結合的條件下接觸；和(b)分離所述標記物陽性子群。
9.根據權利要求8所述的方法其中，所述細胞是使用螢光活化細胞分選法分離。
全文摘要
本發明提供表達特定細胞表面和基因表達標記物的類孢子細胞子群。在一個實施例中，所述細胞表達選自由以下各物組成的群組的至少一種細胞表面或基因表達標記物Oct4、nanog、Zfp296、cripto、Gdf3、UtF1、Ecat1、Esg1、Sox2、Pax6、巢蛋白、SCA-1、CD29、CD34、CD90、B1整合素、cKit、SP-C、CC10、SF1、DAX1和SCG10。本發明還提供從類孢子細胞群中純化出相關類孢子細胞子群的方法，以及誘導類孢子細胞分化成內胚層、中胚層或外胚層來源的細胞的方法。所述類孢子細胞可用於產生源自於全部三種胚層的細胞，並且可用於治療在包括視網膜、腸、膀胱、腎臟、肝臟、肺、神經系統或內分泌系統在內的多種組織中的任一種中具有功能細胞缺陷的患者。
文檔編號C12N5/071GK102762720SQ201080059186
公開日2012年10月31日 申請日期2010年11月11日 優先權日2009年11月12日
發明者C·A·瓦森提, M·P·瓦森提 申請人:Vbi技術有限責任公司