一種發酵法生產赤黴素A7的方法與流程
2023-04-30 21:42:06
本發明屬於微生物發酵技術領域，涉及到利用一種原赤黴素a4生產用菌，通過改變培養基組成及工藝條件，發酵生產赤黴素a7的方法。特別的，發酵液中赤黴素a7含量佔赤黴素a4+7混合物的比例由10％提升至90％以上。
背景技術：
赤黴素(gibberellins,ga)屬四環二萜類化合物，是一類內源性植物調節物質，廣泛存在於植物中，至今已分離鑑定129種該類物質。該類物質對種子萌發、莖葉生長、抽苔座果和塊莖形成等有顯著調節作用，於糧食、蔬菜水果的種植生產上應用廣泛。
目前，赤黴素a3及赤黴素a4+7是市面上主要的赤黴素類產品，工業上常用微生物發酵生產。近年來，赤黴素a4+7在經濟作物方面的應用得到關注，如用於保花保果、打破休眠等。但是，在應用過程中赤黴素a4和赤黴素a7發揮的作用存在明顯差異，甚至起到反作用。鑑於赤黴素a4與赤黴素a7對作物的不同作用，在實際應用過程中對赤黴素a4+7混合物中兩者的比例有不同要求。目前市場上常見的ga4+7混合物劑型有ga4-rich(80％)mixtureofga4andga7，ga4-rich(65％)mixtureofga4andga7，ga4-rich(60％)mixtureofga4andga7，ga7-rich(85％)mixtureofga4andga7等，其中富含ga780％以上的ga4+7劑型市場銷售價格比同含量ga4劑型高20％以上，經濟價值顯著。
由於發酵工藝所限，目前工業上發酵法直接生產得到的都是赤黴素a4+7的混合物，且赤黴素a7所佔比例普遍在50％左右。為得到高含量赤黴素a7產品，企業一般採用在提取分離步驟破壞發酵液中赤黴素a4組份的方法來提高赤黴素a7含量。由於赤黴素a7的不穩定性，該方法使下遊分離工藝變得複雜，產品總收率低，經濟效益不明顯。而其他如高效液相色譜、薄層層析等分離方法則存在分離速度不好控制、設備昂貴、生產規模不易放大等缺點。高水平的適合於工業生產的發酵法直接生產得到高含量赤黴素a7產品的菌種及技術方法未見報導。
赤黴素a4與赤黴素a7的分子結構相近(如下式)，控制微生物發酵在不同條件下進行，可實現相互轉化。有學者研究發現，在較高的ph值下發酵，有利於赤黴素a4的積累，而在較低ph值下發酵，赤黴素a7會進一步代謝成赤黴素a3，因此在發酵各階段選擇合適的ph值是積累赤黴素a7的一個重要因素。日本學者巖崎等人發現，zn2+,al3+,cu2+等金屬離子的添加，有利於使代謝途徑向赤黴素a4合成轉變，而不利於赤黴素a7的合成。另外，也有研究表明，1,2-ga4脫氫酶是赤黴素a4轉化成赤黴素a7進而再轉化為赤黴素a3的主要酶種，nh4+能顯著影響其活性。這些結論為本發明的可行性提供了很好的理論依據。
技術實現要素：
本發明的目的在於利用現有赤黴素a4發酵生產用菌種(該菌種於2015年7月15日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：cgmccno.11101，分類命名為藤倉鐮刀菌，菌種拉丁學名為：fusariumfujikuroi；並已申請專利，專利名稱：一種新的藤倉鐮刀菌及其發酵生產赤黴素a4的方法，申請號：cn201510630480.4)，根據赤黴素a4與赤黴素a7轉化機制，通過改變培養基組成及工藝條件，使其代謝途徑由累積赤黴素a4向累積赤黴素a7轉變，使得發酵終產物中赤黴素a7含量佔赤黴素a4+7混合物的90％以上。
為了更好的闡述本發明所涉及的工藝改變，對利用上述菌種發酵生產赤黴素a4的工藝說明如下：
(1)平板培養：將菌種接至pda培養基，溫度24～30℃，培養3～6天，得到活化的赤黴菌菌落。
pda培養基組成(g/l)：土豆汁200、葡萄糖20、瓊脂15～20。
(2)種子培養：分兩級培養，兩級種子培養基組成均為(g/l)：蔗糖40、黃豆粉12、nh4no31.2、mgso4·7h2o1.5和kh2po41.5。
一級種子培養：裝液量25/250ml。滅菌後用無菌牙籤將單一的活化的菌落從平板刮下，置入裝有2ml水及約20顆直徑0.3mm無菌玻璃珠的試管中強烈震蕩10min，打散混勻，吸取0.5ml於種子培養基中，在溫度30±1℃，搖床轉速200rpm條件下，培養40～60h，得到種子液。
二級種子培養：裝液量150/300l。將種子液以2～10％的比例接種至二級種子罐，在溫度30±1℃，溶氧20～60％，ph自然條件下，培養40～60h，得到二級種子液。
(3)發酵培養：發酵培養基組成(g/l)：澱粉120，黃豆餅粉10、玉米漿乾粉30、k2hpo44.0，k2so42.0、mgso4·7h2o1.0、znso4·7h2o5×10-3、cuso4·5h2o3×10-3、al2o35×10-3，裝液量1.5/3t。將二級種子液以2～10％的比例接種至發酵罐，在30±1℃，ph6.8～7.2，溶氧40～60％條件下，培養8～10天，得到發酵液。
(4)產物檢測：取0.25ml發酵液加入4.75ml甲醇,強烈震蕩10min後,離心處理(2600rpm,10min),取上清液hplc分析。hplc條件：hypersilbdsc18反相色譜柱(150mm×4.6mm)；流動相甲醇–水(60∶40，v/v)溶液，流速0.80ml/min；紫外檢測器波長203nm；進樣體積20μl。檢測結果：赤黴素a41342mg/l，赤黴素a7149mg/l，赤黴素a4佔ga4+7總量90.0％(重量比)，赤黴素a7佔ga4+7總量10.0％(重量比)。
本發明的技術方案為：
一種利用上述原產赤黴素a4菌種，通過改變培養基組成、發酵工藝控制，使代謝途徑向累積赤黴素a7轉變的方法。其中菌種活化、種子培養及產物檢測方法同赤黴素a4，區別在於兩方面：
第一方面，發酵培養基組成不同，用於發酵生產赤黴素a7的培養基組成(g/l)：澱粉150～200、棕櫚油20～50、棉籽粉10～40、玉米漿乾粉10～40、kh2po40.8～1.2、k2hpo42～4、mgso4·7h2o0.8～1.2、feso4·7h2o5×10-3～1×10-2，ph自然。將二級種子液以8-20％的比例接種至發酵罐，分階段控制溶氧、溫度及ph，培養8～12天，得到發酵液。
第二方面，關鍵工藝控制不同：
a.對ph的控制：起始ph自然，待發酵過程中ph降至3.5～5.0，用氨水控制ph在4.0～5.0，直至發酵結束。
b.對溶氧的控制：0～60小時不低於35％，60小時至發酵結束20～60％。
c.對溫度的控制：0～30小時28±1℃，30小時至發酵結束32±1℃。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此。
實施例1：
(1)種子培養：分兩級培養，兩級種子培養基組成均為(g/l)：蔗糖40、黃豆粉12、nh4no31.2、mgso4·7h2o1.5和kh2po41.5，ph自然。
一級種子培養：裝液量25/250ml。滅菌後用無菌牙籤將單一的活化的菌落從平板刮下，置入裝有2ml水及約20顆直徑0.3mm無菌玻璃珠的試管中強烈震蕩10min，打散混勻，吸取0.5ml於種子培養基中，在溫度30±1℃，搖床轉速200rpm條件下，培養40～60h，得到種子液。
二級種子培養：裝液量150/300l。將種子液以2～10％的比例接種至二級種子罐，在溫度30±1℃，溶氧控制20～60％，ph自然條件下，培養40～60h，得到二級種子液。
(2)發酵培養：裝液量1.5/3t。發酵培養基組成(g/l)：澱粉150～200、棕櫚油20～50、棉籽粉10～40、玉米漿乾粉10～40、kh2po40.8～1.2、k2hpo42～4、mgso4·7h2o0.8～1.2、feso4·7h2o5×10-3～1×10-2，ph自然。將二級種子液以8-20％的比例接種至發酵罐，分階段控制溶氧、溫度及ph，培養8天，得到發酵液。各階段控制溶氧、溫度及ph控制如下：
a.ph。起始ph自然，待發酵過程中ph降至3.5～5.0，用氨水控制ph在4.0～5.0，直至發酵結束。
b.溶氧。0～60小時不低於35％，60小時至發酵結束20～60％。
c.溫度。0～30小時28±1℃，30小時至發酵結束32±1℃。
(3)產物檢測：取0.25ml發酵液加入4.75ml甲醇,強烈震蕩10min後,離心處理(2600rpm,10min),取上清液hplc分析。hplc條件：hypersilbdsc18反相色譜柱(150mm×4.6mm)；流動相甲醇–水(60∶40，v/v)溶液，流速0.80ml/min；紫外檢測器波長203nm；進樣體積20μl。檢測結果：赤黴素a4107mg/l，赤黴素a71039mg/l，赤黴素a7佔ga4+7總量90.7％(重量比)。
實施例2：
(1)種子培養同實施例1.
(2)發酵培養：培養基組成在實施例1的基礎上，添加znso4·7h2o5×10-3、cuso4·5h2o3×10-3、al2o35×10-3。將二級種子液以8～20％的比例接種至發酵罐，培養8天，得到發酵液。各階段控制溶氧、溫度及ph控制如下：
a.ph。同實施例1。
b.溶氧。同實施例1。
c.溫度。同實施例1。
(3)產物檢測：檢測方法同實施例1，檢測結果：赤黴素a4270mg/l，赤黴素a7829mg/l，赤黴素a7佔ga4+7總量76.8％(重量比)。
實施例3：
(1)種子培養同實施例1。
(2)發酵培養：培養基同赤黴素a4生產培養基，組成為(g/l)：澱粉120，黃豆餅粉10、玉米漿乾粉30、k2hpo44.0、k2so42.0、mgso4·7h2o1.0、znso4·7h2o5×10-3、cuso4·5h2o3×10-3、al2o35×10-3。將二級種子液以8～20％的比例接種至發酵罐，培養8天，得到發酵液。各階段控制溶氧、溫度及ph控制如下：
a.ph。同實施例1。
b.溶氧。同實施例1。
c.溫度。同實施例1。
(3)產物檢測：檢測方法同實施例1，檢測結果為：赤黴素a4331mg/l，赤黴素a7551mg/l，赤黴素a7佔ga4+7總量62.7％(重量比)。
實施例4：
(1)種子培養同實施例1。
(2)發酵培養：配方同實施例1。將二級種子液以8～20％的比例接種至發酵罐，培養8天，得到發酵液。各階段控制溶氧、溫度及ph控制如下：
a.ph。同實施例1。
b.溶氧。同實施例1。
c.溫度。發酵全程維持培養溫度30±1℃。
(3)產物檢測：檢測方法同實施例1，檢測結果：赤黴素a4170mg/l，赤黴素a7929mg/l，赤黴素a7佔ga4+7總量85.3％(重量比)。
實施例5：
(1)種子培養同實施例1。
(2)發酵培養：培養基組成及培養周期同實施例1。各階段控制溶氧、溫度及ph控制如下：
a.ph。發酵全程維持ph6.8～7.2。
b.溶氧。同實施例1。
c.溫度。同實施例1。
(3)產物檢測：檢測方法同實施例1，檢測結果為：赤黴素a4461mg/l，赤黴素a7528mg/l，赤黴素a7佔ga4+7總量53.4％(重量比)。
實施例6：
(1)種子培養同實施例1。
(2)發酵培養：培養基組成及培養周期同實施例1。各階段控制溶氧、溫度及ph控制如下：
a.ph。同實施例1。
b.溶氧。發酵全程維持溶氧40～60％。
c.溫度。同實施例1。
(3)產物檢測：檢測方法同實施例1，檢測結果為：赤黴素a4169mg/l，赤黴素a7932mg/l，赤黴素a7佔ga4+7總量84.6％(重量比)。
以上實施例改變了發酵培養中的培養基組成及ph、溫度、溶氧控制，從各實施例的結果分析，培養基組成及ph對所採用菌種的代謝途徑起到決定性作用。另外，在發酵各階段控制溫度及ph在適當範圍內，也有利於代謝途徑向累積赤黴素a7轉變。以上實施例中，實施例1是本發明的最佳實施例。
顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而並非是對本發明的實施方式的限定。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬於本發明的實質精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍屬於本發明的保護範圍。