一種可水解3-羥基丁腈的微生物菌株的製作方法

2023-05-01 08:45:51

專利名稱：一種可水解3-羥基丁腈的微生物菌株的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物領域，具體地說，涉及一種可水解3-羥基丁腈的微生物菌株。
背景技術：
3-羥基丁酸，俗稱羥基丁酸，含有兩種光學活性對映體，分別是(R)-3_羥 基丁酸和(S)-3-羥基丁酸，是重要的製藥原料及藥理學試劑；其中，(S)-(+)-3-羥基 丁酸是高血脂治療藥物(R)-4-羥基-3-羥基丁酸[(R)-GABOB]，腦新陳代謝的促進劑 (SPOxiracetam(奧拉西坦)，愛滋病藥物，安定劑以及最新一代抗菌藥物的關鍵中間體； 而(R)-3-羥基丁酸不僅具有營養功能，還能治療如神經紊亂疾病，神經退化性疾病，供氧 不足，心絞痛，心肌梗塞和糖代謝紊亂等疾病。3-羥基丁酸可以通過分子間的酯化反應生成聚3-羥基丁酸酯(PHB)，由於PHB具 有生物降解性、生物相容性、光學活性、壓電性、抗紫外性等優良性質，故PHB不僅僅用來制 備生物完全降解塑料，在電子、光學、生物醫學等其它高科技領域也有很廣的用途。有關3-羥基丁酸的化學合成方法的報導很多，主要包括以下幾種方法⑴丁 內酯的水解法；⑵利用Reformatsky反應法；(3)乙醯乙酸乙酯還原法；⑷由丁烯酸水合 製備法；(5)以乙醛和乙酸為原料、萘鋰為催化劑製備；(6)環氧丙烷水解法；(7)乙醛經羥 醛縮和生成3-羥基丁醛氧化法(山東科學，2001，14(1) :43-49)。雖然有多種3-羥基丁酸 的化學合成路線，但是化學合成工藝複雜，反應條件比較苛刻，對設備要求高，而且金屬催 化劑價格昂貴，易造成汙染，對環保不利；而且得到的產物為外消旋體，很難獲得具有光學 活性的3-羥基丁酸單體。而生物法由於方法簡單、條件溫和、反應較快，日益獲得廣泛的關注，現有使用的 生產3-羥基丁酸的生物法主要包括Ottaway TH(Biochem J，1962，84 11 12)利用微生物合成聚 D_(-) _3_ 羥基 丁酸，然後降解該聚合物得到D-(-)-3-羥基丁酸單體，如利用芽苞桿菌屬中的Bacillus megaterium和Bacillus cereu在含有適當能源的適宜介質中生長產生聚_3_羥基丁酸顆 粒，將生成的聚3-羥基丁酸再通過酶催化或酸條件下水解生成自由酸。但是此方法工藝復 雜，生產投入大，分離純化困難，使D- (-) -3-羥基丁酸的成本較高。陳國強等(CN1217001C，CN1357629C)利用基因工程手段將合成聚(R)_3_羥基 丁酸(PHB)的前體基因phbA、phbB和ptb、buk克隆到質粒載體中構建出重組質粒，再將 其轉到大腸桿菌中構建DNA重組菌株，發酵培養含這四個基因片段的重組大腸桿菌獲取 (R)-3-羥基丁酸。但是重組的大腸桿菌在生產過程中質粒容易丟失，所以將基因工程菌用 於大規模生產還處於進一步探索之中。而利用細胞或酶催化乙醯乙酸乙酯不對稱還原製備光學活性的3-羥基丁酸酯 後，將其產物水解也是獲得光學活性的3-羥基丁酸的一種方法(化學反應工程與工藝， 2007,23 (2) 173-177 ； J. Fennen. Bioeng. ，1993,76 33-37 ;J. Biosci. Bioeng. ，2001， 91(4) :368-372)。但是該方法中的底物乙醯乙酸乙酯難溶於水，在有機相中反應細胞或酶
4容易失活，限制了產物的時空產率，而且在還原過程中需要等化學計量的輔酶。現有的這些生產3-羥基丁酸的生物方法，普遍存在產量低、成本高、價格昂貴等缺點，影響了在工業上的研究，開發和應用推廣。

發明內容
本發明的發明人發現了 一種微生物菌株Arthrobacter nitrogua jacol icus，該菌 株經培養後，獲得的反應液能用於生物催化生產3-羥基丁酸。因此，本發明的目的在於，提供一種微生物菌株Arthrobacter nitroguajacolicuso本發明還有一個目的在於，提供菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的一種斜
面培養基。本發明還有一個目的在於，提供一種用於Arthrobacter nitroguajacolicus發酵
的培養基。本發明還有一個目的在於,提供菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的應用。本發明提供的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus 的 16S rDNA序列如 SEQ ID NO 1所示。根據本發明，菌株Arthrobacter nitroguajacolicus 的保藏號為 CGMCC No. 2405本發明提供的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的斜面培養基的配方如下 碳源0. 2 2. Owt % ；氮源0. 2 2. Owt % ；微量金屬離子以金屬鹽的量計為0. 01 0. 5wt% ；瓊脂粉1. O 3. Owt% ；pH 6. 4 7. 5。本發明提供的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的發酵培養基的配方如下 碳源0. 5 3. Owt % ；氮源0. 2 3. Owt % ；微量金屬離子以金屬鹽的量計為0. 01 0. 5wt% ；半胱氨酸鹽酸鹽或半胱氨酸0.01 0. Iwt % ；有機腈0.01 0. lv/v% ；pH 6. 4 7. 5。本發明提供的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的應用為用於生產腈水解 酶或用於生物催化生產3-羥基丁酸。根據本發明，催化生產3-羥基丁酸包括以下步驟A、)(寸胃_ Arthrobacter nitroguajacolicus WifRW ；B、對步驟A中獲得的發酵液進行預處理，獲得細胞濃縮液；C、利用步驟B中獲得的細胞濃縮液水解3-羥基丁腈，得到3-羥基丁酸。根據本發明的一個優選實施例，對發酵液進行的預處理包括固液分離步驟，其中 固液分離的方法為中空纖維微濾膜、中空纖維超濾膜、陶瓷膜、卷式微濾膜、卷式超濾膜、平 板Utro-flo膜系統、碟片離心分離或管式離心分離。本發明的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 的發酵產物能 夠水解3-羥基丁腈生成3-羥基丁酸，因而具有工業化生產3-羥基丁酸的潛力。使用上述 方法製備3-羥基丁酸，具有原料便宜易得，水解副產物少，反應條件溫和等優點，因此，具 有很高的工業化生產潛力。


圖1為水解產物的紅外光譜檢測結果。圖2為水解產物的紫外可見(200-500nm)吸收光譜檢測結果。圖3為水解產物的屮NMR檢測結果。圖4A為水解產物的質譜分析圖譜，圖4B為質譜圖的分析數據。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本 發明而非用於限定本發明的範圍。W^tt Arthrobacter nitroguajacolicus, BT 2008 ^ 3月17日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為 CGMCCNo. 2405。以下實施例中，採用高效液相色譜法測定水解產物3-羥基丁酸的含量，具體過程 如下檢測條件色譜柱為150mmX4. 6mm,不鏽鋼柱，內裝Kromasil 0DS C18、5u的填 充物；流動相為磷酸二氫鈉緩衝液乙腈=95 5(V/V)；流速為0. 5ml/min ；檢測波長為 210nm ；柱溫為30°C ；進樣量為20 u L。檢測方法稱取3-羥基丁酸標準品0. lg，置於50mL容量瓶中，用流動相溶解，搖 勻。稱取約含3-羥基丁酸0. lg的樣品，置於50mL容量瓶中，用流動相溶解，搖勻。在上述色譜條件下，待儀器穩定後，連續注入數針標準品溶液，待相鄰兩針標準品 溶液峰面積的響應值變化小於1.0%時，按照標樣、樣品、樣品、標樣的順序進行測定。將測 得的兩針樣品以及前後兩針標樣的峰面積進行平均。試樣的質量分數按以下公式計算
v mx X A2義=—~rx p m2 x A^其中，A,為標準品溶液中3-羥基丁酸峰面積的平均值；A2為樣品溶液中3-羥基丁酸峰面積的平均值；mi為稱取3-羥基丁酸標準品的質量，g ；m2為稱取試樣的質量，g ；P為標準品中3-羥基丁酸標準品的質量分數，％。以下實施例中，採用使用HPLC (島津公司，Shim-pack VP-0DS)分析測定產物光學 純度，具體過程如下流動相為ImM CuS04,流速為0. 8mL/min,檢測波長為254nm，柱溫為20°C ;S和R構 型的3-羥基丁酸含量利用手性柱(Chiralcel OA,日本Sumichral公司)測定，以確定產物 的對映體過量值((ee，％ ) = (CS-CE) / (CS+CE) X 100%，其中，Cs和CK分別表示S和R構型 對映體的濃度)。實施例1、斜面培養基的配製分別按照表1所示的配方配製斜面培養基，獲得斜面培養基1-5。表1、斜面培養基配方)
實施例2、發酵培養基的配製分別按照表2所示的配方配製發酵培養基，獲得發酵培養基1-5。
表2、發酵培養基配方(wt % ) 實施例3、Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 的發酵培養Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 ^^JftftM^JIM 1 制的斜面培養基1-5上，於28°C培養3 4天，獲得培養斜面1-5。然後，從培養斜面1-5 上挑取 Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 相應接種到實施例2中配製的發酵培養基1-5中，於28°C，220rpm培養4天，獲得發酵液1-5。實施例4、使用 Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 的細胞懸浮液 水解3-羥基丁腈將發酵液1-5分別進行固液分離(離心分離)，去離子水洗滌細胞。然後，用去離 子水懸浮收集的細胞，獲得細胞懸浮液1-5。分別向細胞懸浮液1-5中加入3-羥基丁腈至終濃度為(W/V)，然後於28°C反 應24h，獲得反應液1-5。反應結束後，分別將反應液1-5離心，收集離心上清。然後，取部分離心上清，送華東理工大學分析中心進行以下檢測紅外光譜檢測、 紫外可見(200-500nm)吸收光譜檢測、1HNMR檢測和低解析度EI-MS測定，以確定水解產物。檢測獲得的譜圖分別如圖1-4所示。上述譜圖與標準的3-羥基丁酸的相應譜圖 相符，因此，可確定水解產物為3-羥基丁酸。同時，取部分離心上清，進行液相色譜分析，以確定反應液1-5中3-羥基丁酸的含 量，並計算其轉化率，同時測定光學純度，結果如表3所示。表3、反應液檢測結果 表 3 的結果顯示，Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 能用於水解
3-羥基丁腈，獲得3-羥基丁酸，且其轉化率較高，可用於工業化生產。同時，根據表3的數據，以斜面培養基2和發酵培養基2培養的細胞活性最高，其 轉化率和產物3-羥基丁酸的光學純度都優於其他幾組培養基培養的細胞。斜面培養基2 和發酵培養基2為最優培養基。實施例 5、Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 的 16S rDNA序歹lj測 定測序取Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 細胞送中科院北京微生物 研究所檢測，並測定其16s rDNA，其16s rDNA序列如SEQ ID NO 1所示。實施例6、Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 的發酵產物的預處
理方法以實施例3的培養條件以及實施例4確定的最優培養基培養獲得Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405的發酵液，然後取相同量的發酵液分別以中空纖維微濾膜、中空纖維超濾膜、陶瓷膜、卷式微濾膜、卷式超濾膜、平板Utro-flo膜系統、碟片離心 分離以及管式離心分離的處理方法進行固液分離，得到相應的細胞懸浮液6-13。細胞懸浮液6-13以實施例5所述方法進行3-羥基丁腈的水解反應和數據測定， 結果如表4所示。表4、反應液檢測結果 表4的數據顯示，發酵液經上述固液分離的方法處理後，細胞的活性破壞較少，能 達到良好的分離效果。綜上所述，本發明的菌株Arthrobacternitroguajacolicus CGMCC No. 2405 的發 酵產物能夠水解3-羥基丁腈生成3-羥基丁酸，因而具有工業化生產3-羥基丁酸的潛力。 使用上述方法製備3-羥基丁酸，具有原料便宜易得，水解副產物少，反應條件溫和等優點， 因此，具有很高的工業化生產潛力。序列表上海市農藥研究所 一種可水解3-羥基丁腈的微生物菌株P50910161PatentIn version 3. 111395DNAArthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 24051ccttcgacgg ctccccccac aagggttagg ccaccggctt cgggtgttac caactttcgt 60
gacttgacgggcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcagcgt tgctgatctg120cgattactagcgactccgac ttcatggggt cgagttgcag accccaatcc gaactgagac180cggctttttgggattagctc cacctcacag tatcgcaacc ctttgtaccg gccattgtag240catgcgtgaagcccaagaca taaggggcat gatgatttga cgtcgtcccc accttcctcc300gagttgaccccggcagtctc ctatgagtcc ccgccataac gcgctggcaa catagaacga360gggttgcgctcgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat420gcaccacctgtaaaccgacc gcaagcgggg cacctgtttc caggtctttc cggttcatgt480caagccttggtaaggttctt cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc gccgcttgtg540cgggcccccgtcaattcctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcggggcac600ttaatgcgttagctacggcg cggaaaacgt ggaatgtccc ccacacctag tgcccaacgt660ttacggcatggactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccatgcttt cgctcctcag720cgtcagttacagcccagaga cctgccttcg ccatcggtgt tcctcctgat atctgcgcat780ttcaccgctacaccaggaat tccagtctcc cctactgcac tctagtctgc ccgtacccac840tgcagaaccggagttgagcc ccggtctttc acagcagacg cgacaaaccg cctacgagct900ctttacgcccaataattccg gataacgctt gcgccctacg tattaccgcg gctgctggca960cgtagttagccggcgcttct tctgcaggta ccgtcacttt cgcttcttcc ctactgaaag1020 aggtttacaacccgaaggcc gtcatccctc acgcggcgtc gctgcatcag gcttgcgccc1080attgtgcaatattccccact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag1140tgtggccggtcaccctctca ggccggctac ccgtcgtcgc cttggtaggc cattacccca1200ccaacaagctgataggccgc gagtccattc aagctttcca ccaccatgac1260atgcgccagatggtcgtatc cggtattaga cccagtttcc caggcttatc ccagagtcaa1320gggcaggttactcacgtgtt actcacccgt tcgccactaa tcccccagca agctgggatc1380atcgttcgacttgca139權利要求
一種微生物菌株Arthrobacter nitroguajacolicus，其特徵在於該菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO1所示。
2.如權利要求1所述的菌株，其特徵在於該菌株的保藏號為CGMCCNo. 2405。
3.如權利要求1或2所述的菌株Arthrobacternitroguajacolicus的斜面培養基，其 特徵在於，所述斜面培養基的配方如下碳源0. 2 2. 0wt% ； 氮源0. 2 2. 0wt% ；微量金屬離子以金屬鹽的量計為0. 01 0. 5wt% ； 瓊脂粉1.0 3. 0wt% pH 6. 4 7. 5。
4.如權利要求3所述的培養基，其特徵在於所述碳源為葡萄糖。
5.如權利要求3所述的培養基，其特徵在於所述氮源為酵母膏。
6.如權利要求3所述的培養基，其特徵在於所述金屬離子為Na+，K+和Mg2+。
7.如權利要求1或2所述的菌株Arthrobacternitroguajacolicus的發酵培養基，其 特徵在於，所述發酵培養基的配方如下碳源0. 5 3. 0wt% ； 氮源0. 2 3. 0fft% ；微量金屬離子以金屬鹽的量計為0. 01 0. 5wt% ； 半胱氨酸鹽酸鹽或半胱氨酸0. 01 0. lwt% ； 有機腈:0. 01 0. lv/v% ； pH 6. 4 7. 5。
8.如權利要求7所述的培養基，其特徵在於所述碳源為葡萄糖。
9.如權利要求7所述的培養基，其特徵在於所述氮源為蛋白腖和/或酵母膏。
10.如權利要求7所述的培養基，其特徵在於所述金屬離子為K+和Mg2+。
11.如權利要求7所述的培養基，其特徵在於所述有機腈為苯甲腈。
12.如權利要求1或2所述的菌株Arthrobacternitroguajacolicus的應用，其特徵 在於用於生產腈水解酶。
13.如權利要求12所述的應用，其特徵在於，所述腈水解酶為胞內酶。
14.如權利要求1或2所述的菌株Arthrobacternitroguajacolicus的應用，其特徵 在於用於生物催化生產3-羥基丁酸。
15.如權利要求14所述的應用，其特徵在於所述生物催化生產3-羥基丁酸包括以下 步驟A、對菌株Arthrobacter nitroguajacolicus 進行發酵；B、對步驟A中獲得的發酵液進行預處理，獲得細胞懸浮液；C、利用步驟B中獲得的細胞懸浮液水解3-羥基丁腈，得到3-羥基丁酸。
16.如權利要求15所述的應用，其特徵在於所述預處理為將細胞發酵液經固液分離， 去離子水洗滌細胞後，用去離子水懸浮收集的細胞，獲得細胞懸浮液。
17.如權利要求16所述的應用，其特徵在於所述固液分離的方法為中空纖維微濾膜、 中空纖維超濾膜、陶瓷膜、卷式微濾膜、卷式超濾膜、平板Utro-flo膜系統、碟片離心分離2或管式離心分離。
全文摘要
本發明的目的提供了一種微生物菌株Arthrobacter nitroguajacolicus及其斜面、發酵培養基及菌株的應用。本發明提供的菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO1所示。本發明提供的斜面培養基配方為碳源0.2～2.0wt％；氮源0.2～2.0wt％；微量金屬離子以金屬鹽的量計為0.01～0.5wt％；瓊脂粉1.0～3.0wt％；pH6.4～7.5。發酵培養基配方為(wt)碳源0.5～3.0％；氮源0.2～3.0％；微量金屬離子以金屬鹽的量計為0.01～0.5％；半胱氨酸鹽酸鹽或半胱氨酸0.01～0.1％；有機腈0.01～0.1％；pH6.4～7.5。本發明提供的菌株可用於生產腈水解酶，利用該菌株生產的腈水解酶可催化3-羥基丁腈生產3-羥基丁酸。使用上述方法製備3-羥基丁酸，具有原料便宜易得，水解副產物少，反應條件溫和等優點，因此，具有很高的工業化生產潛力。
文檔編號C12R1/06GK101875907SQ20091005013
公開日2010年11月3日 申請日期2009年4月28日 優先權日2009年4月28日
發明者唐璐敏, 張仙, 朱健, 李還寶, 楊巍, 薛建萍, 郝婷婷 申請人:上海市農藥研究所;薛建萍