一種體外培養人體黏膜活組織模型及其建立方法和應用的製作方法
2023-05-01 03:18:51 2
專利名稱：一種體外培養人體黏膜活組織模型及其建立方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬生物醫學技術領域，涉及傳染性疾病的體外感染模型，具體涉及性傳播 疾病預防、以及黏膜免疫中感染模型及其建立方法，尤其涉及一種體外培養人體黏膜活組 織模型及其建立方法和應用
背景技術：
據報導，我國男性接觸人群(Men who have sex with men, MSM)愛滋病病毒 (Human immunodeficiency virus type 1，HIV_1)感染的比例迅速地增長。2009 年新發感 染者中，MSM感染者的比例已高達30%。諸多研究顯示，MSM間無保護的肛腸性行為發生感 染HIV的風險是生殖道性行為的十幾倍甚至數十倍之多。此外，異性之間也有採用直腸性 接觸的報告，該種行為方式，明顯促進了 HIV的黏膜感染與傳播。因此，阻斷HIV黏膜的傳 播和局部生殖道播撒是預防感染和最終遏制HIV流行的關鍵。目前，完成這個目標的最佳 策略是通過設計和實施有效的疫苗與局部微生物殺菌劑，抑或暴露後預防用藥的時機與時 效的研究，而這些均要求深刻理解HIV黏膜感染的機制，準確評價生物預防技術的安全性。目前，國內外黏膜感染研究所採用的動物模型絕大多數是HIV和猴免疫缺陷病毒 SIV的嵌和病毒SHIV/非人類靈長類(猴子)模型，實驗需要在大動物生物安全三級實驗 室(P3)進行，成本較高，而且動物的來源與實驗設施的可及性均受到很大限制。近年來，有 學者開始探索建立新型黏膜活組織模型如女性生殖道組織以及腸道黏膜活組織模型等，但 是培養組織結構完整性與高活性一般維持3-7天，時間較短，無法滿足模擬HIV感染生物軌 跡需求(一般細胞培養7-10天以上，才會觀察到明顯的病毒複製增加)。此外，國外在研 究中採用的病毒株絕大多數具有多重複制周期(包括HIV-1病毒臨床分離株或實驗室構建 的感染性克隆)，相關實驗需要在普通的P3實驗室中完成，實驗仍然受到一定限制。假病 毒感染體系由編碼病毒包膜蛋白的質粒與病毒骨架質粒共同轉染哺乳動物細胞系而製備 的單一感染周期的病毒，感染靶細胞之後不具有複製能力，不形成子代感染性病毒顆粒，因 此，相關實驗可以在生物安全二級實驗室(P2)中進行。迄今為止，國內尚無有關採用假病 毒感染體系進行此類研究的報告。
發明內容
本發明的目的在於針對HIV-1感染宿主研究的適宜動物模型的局限性，提供一種 體外培養人體黏膜活組織模型，尤其是建立一種HIV黏膜感染活組織模型及其建立方法和 應用本發明建立的HIV黏膜感染活組織模型可再現HIV-1感染人體靶細胞的真實軌 跡，為HIV-1黏膜感染機制研究、以及阻斷黏膜感染的新型生物預防技術和黏膜局部應用 的抗病毒藥物的安全性和有效性的臨床前評價研究提供技術平臺。本發明的一種體外培養人體黏膜活組織模型，其特徵在於，通過病毒感染離體後 體外培養的黏膜組織，模擬病毒黏膜感染的生物學軌跡，建立了體外培養人體黏膜活組織模型。該模型可作為研究愛滋病病毒(HIV)黏膜免疫的體外模型。本發明中，所述的離體黏膜組織包括但不限於HIV性傳播途徑的生殖道/器或消 化道組織如腸道黏膜等；本發明中，所述的病毒包括但不限於HIV的單一感染周期的假病毒、感染性克隆、 實驗室株、臨床分離株或其他種類病毒。具體而言，本發明的體外培養人體黏膜活組織模型，通過下述方法和步驟製備1、對離體組織樣本預處理
對離體的臨床手術標本組織進行預處理，本發明中(以腸黏膜為例)，腸道手術男 性患者控制年齡範圍在40-60歲之間(與MSM的HIV性傳播高危人群年齡段之一近似)，如 為腫瘤患者則選取行mills術且病理診斷所取標本無癌細胞轉移及其他異常病變的癌旁 組織；非腫瘤患者(如直腸脫垂、腸梗阻等)則取離體標本病灶遠端的正常組織；標本離體 後儘快取下組織塊，浸入器官移植保護液，1-2小時內運至實驗室。用含高劑量抗生素(青 鏈黴素2000U/ml)的DMEM培養基衝擊並清除組織塊中附著的細菌、真菌等汙染物，保證培 養期間無汙染現象發生。以上取材要求及培養環節均是延長組織高活性培養時間並保持組 織結構完整的重要條件。2、組織培養採用下述培養方式(I)TransweIl小室培養(如圖1所示)將預處理的組織鑽取成塊，黏膜面向上置 於transwell上室中孔徑為3.0 μ m的濾膜上，用含3%瓊脂糖的培養基將組織四周封閉，露 出黏膜面，使之形成上下相對獨立的空間(即當向上室內加入病毒液時，HIV-I只能通過粘 膜層進入下室)，上室加入50-100ulDMEM培養液，下室中液面高於上室底部濾膜，使黏膜底 部與培養基能充分接觸。37°C，5% C02培養；或，(2)海綿筏支撐培養將預處理的組織鑽取成塊，黏膜面向上置於預先在DMEM培 養基中浸泡的海綿筏上，放入12孔板中，培養基液面不超過海綿筏。37°C，5% C02培養；或，(3)浸入培養將預處理的組織鑽取成塊，直接浸入DMEM培養基中培養。以上方法，均每2-3天更換半量新鮮DMEM培養基。或，採用本領域公知組織培養方法。
3、觀察組織形態變化取培養後不同天數的組織塊，經甲醛固定，石蠟包埋，通過蘇木精一伊紅(HE)染 色法，在顯微鏡下觀察組織結構。4、噻唑藍(MTT)法檢測組織存活力.取培養不同天數的組織塊置於乾淨的48孔板中，每孔含一個組織塊，並加入 400ul含0. 5mg/ml MTT的DMEM培養基，37°C ,5% C02培養3小時，棄去上清液，用PBS衝洗 組織塊，加入等體積的溶解液過夜浸泡，將組織塊中的甲瓚溶出，570nm波長處測定吸光度 值，以新鮮組織的MTT值為基數，計算組織活力百分數。5、病毒感染黏膜組織本發明中，採用的感染病毒株包括HIV-I病毒株(多複製周期)與假病毒株(單病毒，37°C,5% C02孵育過夜，次日用PBS清洗黏膜組 織，充分去除游離病毒，換新鮮培養基繼續培養，假病毒株感染者在實驗結束時收集組織進 行P24核酸檢測；HIV病毒株感染者在實驗中定期收集培養上清，ELISA法檢測p24含量。6.評價組織對藥物濃度變化的敏感性.取離體的直徑6mm新鮮的組織塊，分別放入48孔培養板中，對照組和每個藥物濃 度均設3復孔，將待測藥物(以阻斷HIV黏膜感染的第一代微生物殺菌劑N-9為例)10倍 梯度稀釋，加入孔中，與組織塊孵育過夜。次日用PBS洗去黏膜上殘留藥物，換乾淨培養板 及新鮮400ul含0. 5mg/ml MTT的培養基，37°C,5% C02培養3小時，棄去上清液，用PBS衝 洗組織塊，更換成等體積的溶解液將組織塊中的甲瓚溶出，570nm波長處測定吸光度值，以 不加藥物的孔作為對照，計算組織活力百分數。結果顯示，本發明的體外黏膜感染模型能成功培養人腸黏膜組織，並保持完整結 構和高活性近14天。本發明的模型可被HIV病毒株及其假病毒感染，其中浸入法較海綿筏 支撐培養法更為易感。同時，該模型可敏感的反映出黏膜用藥物濃度的變化；已知N-9臨床 實驗評價濃度為4%，本模型實驗結果顯示，當使用的藥物濃度為0. 5%時，本發明所建立 的活組織模型的活性已降到10%以下，能靈敏地反映出N-9對組織的毒性，提示N9不是一 種安全的黏膜用藥物，該一結論與N-9臨床實驗結果一致。證明本發明的體外培養人體黏 膜活組織模型可以作為黏膜用藥的安全評價技術平臺之一。本發明所建立的模型其應用範圍包括但不限於HIV黏膜感染機制的研究、待測藥 物臨床前安全性與有效性評價、黏膜局部免疫學研究等。本發明中，所述的待測藥物包括但不局限於化學合成藥物、生物藥物、微生物殺菌 劑與黏膜疫苗等。本發明中，所述的待測藥物臨床前安全性包括但不限於藥物對直接施用部位黏膜 以及非直接施用部位的毒性、對黏膜免疫系統的激活與致病作用、以及黏膜被致病原感染 的敏感性增加作用等。本發明所採用的離體組織可在普通的P3實驗室中開展感染實驗，明顯降低了實 驗成本。當感染的病毒採用假病毒體系時，可顯著降低實驗的生物安全風險，在P2實驗室 即可完成。同時，採用單一感染周期的假病毒，病毒進入首感細胞後不再擴散，有利於HIV 黏膜感染機制的研究；本發明在維持活組織的結構完整性與組織活性的前提下，顯著延長了人體黏膜組 織體外培養的時間。本發明克服了現有技術的不足，解決下述技術問題1)活組織體外培養模型的建立控制組織內源性或外源性汙染並在體外培養過 程中保持較為完整的組織結構，儘可能維持較高的組織活性；2)活組織模型對再現HIV黏膜感染的適用性採用HIV-1病毒株(多複製周期) 與假病毒株(單一感染周期)，接種活組織模型；在感染後不同培養時間，或通過報告基因 或直接檢測病毒P24蛋白/核酸水平的增長變化。提供一種HIV體外黏膜感染模型的建立 方法；3)所建立的組織模型對黏膜外用藥物的敏感性系列藥物濃度下，MTT法檢測組 織活力的變化，可提供一種黏膜局部用藥的安全性評價方法；
若同時結合2)和3)中提供的黏膜感染方法和黏膜局部用藥的方法，還可提供一種黏膜局部用藥的有效性的評價方法。本發明的有益效果在於1、與現有技術的細胞模型相比本活組織模型具有局部組織完整的黏膜表皮及 下層複雜的細胞構成，可從多細胞綜合作用的角度來觀測病毒感染軌跡以及對藥物的敏感 性，彌補了細胞系種類單一的不足；2、與現有技術的動物模型相比由於HIV-I對小動物不敏感的特殊情況，目前常 用動物模型僅限於非人靈長類猴子模型，成本昂貴，來源有限，同時必須在大動物P3實驗 室中進行。本發明的離體組織直接來源於人體，可更為真實的反映病毒感染的體內情況；同 時實驗可在普通的P3實驗室進行，有效降低了實驗的成本；3、同時模型採用的假病毒體系進行感染，在P2實驗室中即可進行，操作更加便 禾IJ，成本也大幅降低；假病毒具有單輪感染周期特性，當其進入首個靶細胞後不會發生進一 步的傳播，因此，利用假病毒來定位HIV黏膜感染的首感靶細胞較病毒株更為可信。為了便於理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明的HIV體外感染模型的 建立方法進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域 的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的範圍內對本發明做出各種各樣的修正和改 變，這些修正和改變也納入本發明的範圍內。
圖1 不同培養天數的結腸黏膜(HE染色，IOOx)，其中，D0-D13分別代表培養第0天至第13天。圖2 =MTT法檢測結腸黏膜組織活性。圖3 結直腸黏膜活組織模型的N9反應性。(A)為10倍濃度稀釋的初篩；(B)為 精細分析。圖4 =ELISA檢測培養上清中p24含量，其中，A兩種培養方式的比較，B同一方式不同劑量的比較，T為TCID50。
具體實施例方式實施例1採用本發明所述方法和步驟，以腸道黏膜組織培養為例，採用海綿筏支撐培養 方式；藥物敏感性實驗中選擇藥物為第一代微生物殺菌劑黏膜微生物殺菌劑壬苯醇醚 (N-9)；感染實驗採用CCR5嗜性包膜的假病毒，同上述步驟操作取離體的腸道手術腸黏膜標本組織取下組織塊，浸入器官移植保護液，1-2小時內 用含青鏈黴素2000U/ml的DMEM培養基衝擊並清除組織塊中附著的細菌、真菌等汙染物， 保證無汙染發生；將預處理的組織鑽取成塊，黏膜面向上置於預先在DMEM培養基中浸泡的海綿筏 上，放入12孔板中，培養基液面不超過海綿筏。37°C，5% C02培養；取培養後不同天數的組織塊，經甲醛固定，石蠟包埋，通過蘇木精一伊紅(HE)染 色法，在顯微鏡下觀察組織結構形態變化；
噻唑藍(MTT)法檢測組織存活力取培養不同天數的組織塊置於乾淨的48孔板 中，每孔含一個組織塊，並加入400ul含0. 5mg/ml MTT的DMEM培養基，37°C,5% C02培養 3小時，棄去上清液，用PBS衝洗組織塊，加入等體積的溶解液過夜浸泡，將組織塊中的甲瓚 溶出，570nm波長處測定吸光度值，以新鮮組織的MTT值為基數，計算組織活力百分數；向黏膜培養孔中接種CCR5嗜性包膜的假病毒，37V,5% C02孵育過夜，次日用PBS 清洗黏膜組織，充分去除游離病毒，換新鮮培養基繼續培養，實驗結束時收集組織進行P24 核酸檢測；取離體的直徑6mm新鮮的組織塊，分別放入48孔培養板中，對照組和每個藥物濃 度均設3復孔，將待測藥物第一代微生物殺菌劑黏膜微生物殺菌劑壬苯醇醚(N-9) 10倍梯 度稀釋，加入孔中，與組織塊孵育過夜。次日用PBS洗去黏膜上殘留藥物，換乾淨培養板及 新鮮400ul含0. 5mg/ml MTT的培養基，37°C,5% C02培養3小時，棄去上清液，用PBS衝洗 組織塊，更換成等體積的溶解液將組織塊中的甲瓚溶出，570nm波長處測定吸光度值，以不 加藥物的孔作為對照，計算組織活力百分數，評價組織對藥物濃度變化的敏感性。結果顯示1)培養中結腸黏膜的組織形態與活力通過HE染色觀察培養第0天可見清晰腸黏膜上皮腺體及黏膜固有層結構，培養5 天時組織結構依然良好，13天時黏膜組織結構依然可見(如圖1所示)。經MTT法檢測黏膜 培養10天內組織活性，結果顯示培養4天時組織活性高於80%，7天的活性可保持在50% 左右(如圖2所示)。2)結腸黏膜模型對不同濃度藥物的毒性反應以第一代黏膜微生物殺菌劑壬苯醇醚(N-9)為例，本發明檢測了黏膜活組織模型 對外用藥物的濃度依賴性反應。如圖3A所示，採用10倍稀釋藥物濃度梯度(從0.5%開始 稀釋，計5個濃度點)，對本發明模型的藥物反應性進行分析。結果顯示，隨著N-9的濃度變 化，組織模型的活性也呈現明顯的變化。N-9濃度在0. 005%以下時，組織模型維持良好的 活性(90%以上)，高於該濃度時，對組織模型產生毒性。當N-9濃度超過0. 05%時，黏膜組 織的活性急劇降低，N-9濃度為0.5%時，組織活性降至10%以下。本發明在組織活性急劇 下降的濃度區間(0.005%至0.05% )，進一步稀釋了 3個藥物濃度(0. 01625%/0. 0275% /0. 03875%)以探索N-9影響該模型組織活性的精細濃度範圍(圖3B)，結果顯示，所培養 的結腸黏膜組織的安全性(維持90-100%的組織活性)N-9藥物濃度上限為0. 01625%, 50%的組織活性濃度點為0. 03875%。3)結腸黏膜模型對HIV病毒的易感性本發明檢測了浸入法和海綿筏法培養方式建立的模型的HIV-1病毒的易感性。因 為HIV-1性途徑感染的病毒多為輔助受體CCR5嗜性的病毒(R5病毒)，故本實驗所採用 的病毒株亦為R5病毒包膜蛋白構建的單一感染周期的假病毒。初始感染劑量為4500個 TCID50，通過檢測感染後第1，4和8天的培養上清中p24的含量，監測黏膜活組織模型感 染的建立。如圖4A所示，採用浸入法培養的黏膜活組織在第一天的培養上清中即可檢測到 P24的濃度在80pg/ml以上，隨著培養天數的增加，一直維持在100pg/ml的水平。而採用海 綿伐的培養方法，在4500個TCID50的感染劑量下，直至至第8天時培養基中p24含量僅為 10pg/ml以下。當增加感染劑量10倍(45000個TCID50)對海綿伐培養法的活組織進行感
7染(如圖4B所示)，結果顯示，在感染後第一天的培養上清 中即檢測到較高的P24表達(約 75pg/ml以上)，其後一直保持與浸入法培養的活組織在4500個TCID50感染劑量下相似的 趨勢。上述結果提示，活組織模型培養的浸入法比海綿筏法相對易感。
權利要求
1.一種體外培養人體黏膜活組織模型，其特徵在於，通過病毒感染離體後體外培養的 黏膜組織，模擬病毒黏膜感染的生物學軌跡，建立體外培養人體黏膜活組織模型。
2.按權利要求1所述的體外培養人體黏膜活組織模型，其特徵在於，所述的離體黏膜 組織包括但不限於涉及HIV性傳播途徑的生殖道/器或消化道組織黏膜。
3.按權利要求1或2所述的體外培養人體黏膜活組織模型，其特徵在於，所述的離體粘 膜組織是離體腸道黏膜。
4.按權利要求1所述的體外培養人體黏膜活組織模型，其特徵在於，所述的病毒包括 但不限 於HIV的單一感染周期的假病毒、感染性克隆、實驗室株、臨床分離株或其他種類病
5.權利要求1的體外培養人體黏膜活組織模型的建立方法，其特徵在於，其包括步驟1)對離體組織樣本預處理離體後組織塊，浸入器官移植保護液，1-2小時內用含高劑量抗生素的DMEM培養基衝 擊並清除組織塊中附著的細菌、真菌汙染物，保證無汙染發生；2)組織培養採用Transwell小室培養，或海綿筏支撐培養，或浸入培養方式，37°C，5% C02培養培 養上述預處理的組織塊；3)觀察組織形態變化取培養後不同天數的組織塊，經甲醛固定，石蠟包埋，通過蘇木精一伊紅(HE)染色法， 在顯微鏡下觀察組織結構。4)噻唑藍法檢測組織存活力.取培養不同天數的組織塊分別置48孔板中，加入含0. 5mg/ml MTT的DMEM培養基， 37°C,5% C02培養3小時，棄上清，PBS衝洗組織塊，加溶解液過夜浸泡，溶出甲瓚，570nm波 長處測定吸光度值，，計算組織活力百分數；5)病毒感染黏膜組織採用HIV-I病毒株與假病毒株，接種於黏膜培養孔，37V,5% C02孵育過夜，次日用PBS 清洗黏膜組織，去除游離病毒，換培養基培養，實驗結束時收集組織進行P24核酸檢測；HIV 病毒株實驗中定期收集培養上清，ELISA法檢測p24含量。
6.權利要求1的體外培養人體黏膜活組織模型在製備HIV黏膜感染機制研究、待測藥 物臨床前安全性與有效性評價或黏膜局部免疫學研究平臺中的用途。
7.按權利要求6所述的用途，其特徵在於所述的待測藥物包括但不局限於化學合成藥 物、生物藥物或微生物殺菌劑與黏膜疫苗。
8.按權利要求6所述的用途，其特徵在於所述的待測藥物臨床前安全性包括但不限 於藥物對直接施用部位黏膜以及非直接施用部位的毒性、對黏膜免疫系統的激活與致病作 用、以及黏膜被致病原感染的敏感性增加作用。
全文摘要
本發明屬生物醫學技術領域，涉及傳染性疾病的體外感染模型，具體涉及性傳播疾病預防、以及黏膜免疫中感染模型及其建立方法，尤其涉及一種體外培養人體黏膜活組織模型及其建立方法和應用。本發明通過對離體組織樣本預處理，採用不同組織培養方式及觀察不同培養天數的組織形態變化、檢測組織存活力、評價組織對藥物濃度變化的敏感性和採用假病毒感染黏膜組織提供一種體外培養人體黏膜活組織模型。本發明模型適用於離體人體活組織的體外感染，為探索高活性長期體外培養，再現HIV-1感染人體靶細胞的真實軌跡，為HIV-1黏膜感染機制研究以及新型生物預防技術的安全性和有效性的臨床前評價研究提供技術平臺。本發明方法可在生物安全二級實驗室中開展。
文檔編號C12Q1/02GK102002476SQ201010260159
公開日2011年4月6日 申請日期2010年8月20日 優先權日2010年8月20日
發明者劉愛平, 張曉燕, 徐建青, 楊瑜 申請人:上海市公共衛生臨床中心