苦碟子注射液糖類成分的含量測定方法

2023-05-01 00:22:41

苦碟子注射液糖類成分的含量測定方法
【專利摘要】本發明涉及一種中藥注射液的鑑別方法，特別是涉及一種利用GC-MS測定苦碟子注射液糖類成分的測定方法。其步驟如下：（a）樣品的製備，樣品前處理方法。（b）標準品的製備，醛糖類成分衍生化方法，酮糖類成分衍生化方法。(c)色譜條件氣質分析儀，GC-MS-QP2010SE毛細管柱。(d)測定分別精密吸取標準品與樣品，注入氣相色譜儀，用氣相色譜法測定，制定苦碟子注射液糖類成分指紋圖譜。本方法採用衍生化法使苦碟子中難以檢測的糖類成分更加準確的檢測出來。
【專利說明】苦碟子注射液糖類成分的含量測定方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種中藥注射液的鑑別方法，特別是涉及一種利用GC-MS測定苦碟子 注射液糖類成分的測定方法。

【背景技術】
[0002] 苦碟子為菊科苦蕒菜屬多年生草本植物。近年來隨著中藥越來越受重視，苦碟子 的化學成分、藥理活性和臨床研究應用等方面的研究都取得了重大進展。苦碟子注射液為 淺黃棕色至黃棕色的澄明液體，臨床上用於冠心病、心絞痛、腦血栓、腦梗塞等。
[0003] 苦碟子的化學成分比較複雜，據文獻報導其成分主要有萜類、黃酮類和香豆素類、 甾醇等。其中主要活性成分，由於受產地、氣候和生態環境等因素的影響，不同產地苦碟子 所製成的注射液所含成分詫異很大。研究報導，從各種動植物中提取的多糖具有免疫調節、 抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗病毒、抗輻射、降血脂、降血糖、美容等廣泛的作用。
[0004] 苦碟子注射液（曾用名：碟脈靈注射液）列入國家藥品標準產品（國藥準字 Z20025450)，由通化華夏藥業有限責任公司生產。
[0005] 處方：抱莖苦蕒菜lOOOg，製成1000ml。
[0006] 製法：取抱莖苦蕒菜，加水煎煮二次，第一次1小時，第二次0. 5小時，合併煎液， 濃縮至每Iml相當於原生藥0. 5g，放冷至40°C以下，在攪拌下加10%氧化I丐乳調節pH值至 10,放置12小時，離心，離心沉澱物稱重，懸浮於5. 3倍量95%乙醇中（使含醇量達80%)，力口 50%硫酸溶液調節pH值至3 - 4,充分攪拌使反應完全，離心，離心液加40%氫氧化鈉溶液 中和pH值至7. 0,濾過，濾液回收乙醇，並揮盡乙醇，用注射用水稀釋至每Iml相當於原生 藥4g，置-5°C以下放置12小時以上，濾過，濾液加0. 1 - 0. 2%藥用活性炭粉末，煮沸15分 鍾，置-5°C以下放置24小時以上，濾過，濾液加注射用水稀釋至規定量，調節pH值至7. 0 - 7. 5,濾過，灌封，滅菌即得。性狀：本品為淺黃棕色至黃棕色的澄明液體。
[0007] 含量測定：本品每IOml含總黃酮以無水蘆丁（C27H3tlO 16)計，不得少於4. Omg。含抱 莖苦蕒菜以腺苷（CltlH12N5O 4)計，不得少於0. 025mg。
[0008] 功能主治：活血止痛，清熱祛瘀。用於瘀血閉阻的胸痺，證見：胸悶、心痛，口苦，舌 暗紅或存瘀斑等。適用於冠心病、心絞痛見上述病狀者。亦可用於腦梗塞者。
[0009] 用法用量：靜脈滴注，一次10 - 40ml，一日1次；用5%葡萄糖或0. 9%氯化鈉注射 液稀釋至250 - 500ml後應用；14天為一療程；或遵醫囑。
[0010] 規格：每支裝（I) 10ml，（2) 20ml，（3) 40ml。
[0011] 據文獻報導，苦碟子中含有糖類成分，但是在現有的文獻和報導中卻並沒有有關 此物質的質量檢測方法。本發明就提供了一種苦碟子注射液中糖類物質的含量測定的方 法。


【發明內容】

[0012] 本發明的目的是針對現有技術中的現狀，提供一種苦碟子注射液中糖類成分的含 量測定方法，該方法為苦碟子注射中糖類成分的檢測提供了樣品前處理方法以及糖類成分 GC-MS的檢測方法，通過該方法的分析，不僅可以明確苦碟子注射液中糖類成分的組成，還 能對其含量進行測定，該方法的建立可為苦碟子注射液質量控制提供依據。
[0013] 本發明的技術解決方案是：苦碟子注射液糖類成分的含量測定方法，其步驟如 下： (a)樣品的製備 樣品前處理方法：取苦碟子注射液過HyperS印C18柱後，置於具塞圓底燒瓶中，IM HCl調pH為1，減壓抽真空後70°C水浴3h，冷卻後加入10% NaOH調pH至中性，精密量取 每5ml於每支離心管中，冷凍乾燥備用。而苦碟子注射液中富含有黃酮苷和核苷類成分，為 避免其中糖配基的幹擾，建立了苦碟子注射液進行前處理方法，除去其中的苷類成分，使該 方法能夠專一性的分析苦碟子注射液中的糖類成分。本方法中樣品前處理步驟簡單易於操 作，所得樣品的重複性良好，適用於成批藥物的大量檢測。
[0014] 稱取上述乾燥物置於10 ml具塞試管中，加入100 mg鹽酸羥胺和500 μ 1吡啶， 在901：水浴中振蕩反應301^11，取出冷至室溫，加入50(^1乙酸酐，於901：水浴中繼續進行 乙醯化反應30min，冷卻後即得衍生物。
[0015] 稱取冷凍乾燥物2mg定溶於IOml容量瓶中，然後稀釋到0· 04mg/ml和0· 5mg/ml， 精密移取lml，冷凍乾燥，加入0. 6ml吡啶、IOOmg鹽酸羥胺，混勻，放入90°C水浴中加熱反 應30 min，取出後冷卻至室溫，加入0. 3ml六甲基二矽胺，在90°C下繼續反應30min加入 0. Iml三甲基氯娃燒，10000r/min離心15min，取上清液直接進樣分析。
[0016] (b)標準品的製備 醛糖類成分衍生化方法：分別稱取市面上購買的阿洛糖、肌醇、甘露糖、葡萄糖、半乳 糖、阿拉伯糖標準品置於10 ml具塞試管中，加入100 mg鹽酸羥胺和500μ1吡啶，在90°C 水浴中振蕩反應30min，取出冷至室溫，加入500 μ 1乙酸酐，於90°C水浴中繼續進行乙醯化 反應30min，冷卻後即得衍生物。
[0017] 酮糖類成分衍生化方法：分別稱取果糖標準品2mg定溶於IOml容量瓶中，然後稀 釋到0. 04mg/ml和0. 5mg/ml，精密移取lml，冷凍乾燥，加入0. 6ml批陡、IOOmg鹽酸輕胺， 混勻，放入90°C水浴中加熱反應30 min，取出後冷卻至室溫，加入0. 3ml六甲基二矽胺，在 90°C下繼續反應30min加入0. Iml三甲基氯娃燒，10000r/min離心15min，取上清液直接進 樣分析。
[0018] (C)色譜條件 氣質分析儀：GC-MS-QP2010SE毛細管柱：Rtx-5 MS 0. 25 mmX30 m，0. 25 μ m ;載氣：高 純氦氣He，99. 999%;進樣口溫度：280°C ;柱流速：1.0mv/min ;進樣量：1μ I ;分流比：30:1 ; 氣化室溫度：280°C ;柱前壓73. OkPa氣-質接口溫度：270°C ;離子源：EI源；離子源溫度 200°C ;電子能量：70ev ;溶劑延遲時間5min，質量掃描範圍45 - 550amu。
[0019] (d)測定 分別精密吸取標準品與樣品，注入氣相色譜儀，用氣相色譜法測定，制定苦碟子注射液 糖類成分指紋圖譜。
[0020] 本發明優點是：1、整體性、宏觀性和模糊性。本發明克服了使用GC-MS測定苦碟 子中糖類成分難以檢測的缺點。在以往對苦碟子注射液的研究中，對其核苷類、黃酮類、以 及有機酸類成分研究較多，而這些類型成分含量只佔苦碟子注射液乾重的60%，為了更加全 面的分析苦碟子注射液中的化學成分，進一步提升苦碟子注射液的質量標準，對其中含量 高於乾重20%的糖類成分進行了分析。而苦碟子注射液中富含有黃酮苷和核苷類成分，為 避免其中糖配基的幹擾，建立了苦碟子注射液進行前處理方法，除去其中的苷類成分，使該 方法能夠專一性的分析苦碟子注射液中的糖類成分。2、本方法採用衍生化法使苦碟子中難 以檢測的糖類成分更加準確的檢測出來。3、本方法中樣品前處理步驟簡單易於操作，所得 樣品的重複性良好，適用於成批藥物的大量檢測。衍生化操作簡便、適用，衍生化產物穩定 性良好；GC-MS檢測參數的設置能夠保證該方法精密度，適用於苦碟子注射液中糖類成分 的測定。
[0021] 下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1是苦碟子注射液醛糖類成分的GC-MS指紋圖譜及色譜峰指認。
[0023] 圖2是苦碟子注射液醛糖類成分GC-MS指紋圖譜空白對照。
[0024] 圖3是苦碟子注射液酮糖類成分的GC-MS指紋圖譜及色譜峰指認。
[0025] 圖4是苦碟子注射液酮糖類成分GC-MS指紋圖譜空白對照。
[0026] 圖5是10批苦碟子注射劑醛糖類成分GC-MS指紋圖譜。
[0027]

【具體實施方式】 苦碟子注射液糖類成分的含量測定方法： 1、儀器與試藥 1. 1儀器 GC-MS-QP2010SE (SHIMADZU 公司，日本）。
[0028] HH-S8數顯恆溫水浴鍋(金坊市盛藍儀器製造有限公司）。
[0029] SHZ-95B型循環水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司）。
[0030] 冷凍乾燥機（FD5-2. 5,日本）。
[0031] BT12?型分析天平（德國Sartorius公司）。
[0032] 高速離心機（TG16-WS長沙湘儀離心機儀器有限公司）。
[0033] 1. 2 材料 D-無水葡萄糖對照品（中國藥品生物製品檢定所110833-200904)。
[0034] D-阿洛糖對照品（天津一方科技有限公司101205003)。
[0035] D-半乳糖對照品（中國藥品生物檢定所100226-200404)。
[0036] D-甘露糖對照品（中國藥品生物製品檢定所140651-200602)。
[0037] D-阿拉伯糖對照品(天津一方科技有限公司）。
[0038] 肌醇對照品(天津市光復精細化工研究所)。
[0039] D-果糖對照品(天津市元立化工有限公司）。
[0040] 吡啶(天津市光復精細化工研究所)。
[0041] 乙酸酐(天津市江天化工有限公司）。
[0042] 鹽酸羥胺(天津市光復科技發展有限公司）。
[0043] 六甲基二矽胺(天津市光復精細化工研究所)。
[0044] 三甲基氯矽烷(成都市科龍化工試劑廠)。
[0045] NaOH (分析純，天津化學試劑批發公司）。
[0046] HCl (分析純，天津化學試劑批發公司）。
[0047] pH試紙(天津市鵬達化學試劑有限公司）。
[0048] HyperSep C18 固相萃取小柱（Thermo 公司）。
[0049] 苦碟子注射液（吉林通化華夏藥業有限公司，批號：110601，111011，111105， 111218,120109,120209,120312,120438,120532,120625)。
[0050] 2、方法與結果 指紋圖譜測定 (a)樣品的製備： 樣品前處理方法：取苦碟子注射液過HyperSep C18柱（Thermo公司）後，置於具塞圓 底燒瓶中，IM HCl調pH約為1，減壓抽真空後70°C水浴3h，冷卻後加入10% NaOH調pH至 中性，精密量取每5ml於每支離心管中，冷凍乾燥備用。用C18柱除去注射液中黃酮苷等苷 類成分，避免糖配基類對糖類成分的幹擾；HCl水解多糖成為單糖，便於分析多糖的單糖組 成；取適量凍幹以便於精密量取供試品溶液保證取樣的精密度，便於樣品儲存不易變質，利 於後續衍生化反應的進行。
[0051] 稱取上述乾燥物置於10 ml具塞試管中，加入100 mg鹽酸羥胺和500 μ 1吡啶， 在901：水浴中振蕩反應301^11，取出冷至室溫，加入50(^1乙酸酐，於901：水浴中繼續進行 乙醯化反應30min，冷卻後即得衍生物。
[0052] 稱取冷凍乾燥物2mg定溶於IOml容量瓶中，然後稀釋到0· 04mg/ml和0· 5mg/ml， 精密移取lml，冷凍乾燥，加入0. 6ml吡啶、IOOmg鹽酸羥胺，混勻，放入90°C水浴中加熱反 應30 min，取出後冷卻至室溫，加入0. 3mlHMDS (六甲基二矽胺)，在90°C下繼續反應30min 加入0. ImlTMCS (三甲基氯娃燒)，10000r/min離心15min，取上清液直接進樣分析。
[0053] (b)標準品的製備 醛糖類成分衍生化方法：分別稱取市面上購買的阿洛糖、肌醇、甘露糖、葡萄糖、半乳 糖、阿拉伯糖標準品置於10 ml具塞試管中，加入100 mg鹽酸羥胺和500μ1吡啶，在90°C 水浴中振蕩反應30min，取出冷至室溫，加入500 μ 1乙酸酐，於90°C水浴中繼續進行乙醯化 反應30min，冷卻後即得衍生物。
[0054] 酮糖類成分衍生化方法：分別稱取果糖標準品2mg定溶於IOml容量瓶中，然後稀 釋到0. 04mg/ml和0. 5mg/ml，精密移取lml，冷凍乾燥，加入0. 6ml批陡、IOOmg鹽酸輕胺， 混勻，放入90°C水浴中加熱反應30 min，取出後冷卻至室溫，加入0. 3mlHMDS (六甲基二矽 胺），在90°C下繼續反應30min加入0. ImlTMCS (三甲基氯矽烷)，lOOOOr/min離心15min， 取上清液直接進樣分析。
[0055] 為增強質譜響應值，更加可靠的分析苦碟子注射液中糖類成分的含量，本方法選 用衍生化法增強單糖類成分的質譜相應。單糖分為醛糖和酮糖，由於其結構的差異，在衍生 化過程中對衍生化試劑的反應有所差異，醛糖所含種類較多，酮糖主要為果糖，因此在檢測 過程中分別對苦碟子注射液中的醛糖和酮糖進行反應，分別進行GC-MS分析及含量測定， 保證對糖類成分分析的完整性。
[0056] (C)色譜條件 氣質分析儀：GC-MS-QP2010SE (SHIMADZU)毛細管柱：Rtx-5 MS 0.25 mmX30 m，0.25 μ m (SHIMADZU);載氣：高純 He (99. 999%);進樣口溫度：280°C ;柱流速：1. Omv/min ;進樣 量：1以1;分流比：30:1 ;氣化室溫度：2801：;柱前壓73.0迚&氣-質接口溫度：2701： ;離 子源：EI源；離子源溫度200°C ;電子能量：70ev ;溶劑延遲時間5min，質量掃描範圍45 - 550amu WC-MS條件的設置適用於多種單糖類成分衍生物的分析，能夠全面反應苦碟子注射 液中糖類成分的組成。
[0057] (d)測定 分別精密吸取標準品與樣品，注入氣相色譜儀，用氣相色譜法測定，制定苦碟子注射液 糖類成分指紋圖譜。見圖1 一 4。圖1中：A表示對照品醛糖的色譜峰圖譜，B表示樣品中 醛糖成分色譜峰譜圖。圖3中：A表示對照品果糖的色譜峰譜圖，B表示樣品中果糖成分色 譜峰譜圖。
[0058] 對 10 批苦碟子注射液（110601，111011，111105,111218,120109,120209,120312， 120438,120532,120625)進行分析，得到指紋圖譜(參見圖5)，以葡萄糖為參照各個共有峰 相對保留時間和相對峰面積如表2和3所示，其相似度結果如表4所示。
[0059] 表210批苦碟子注射液醛糖類成分GC-MS指紋圖譜共有峰相對保留時間（以葡萄 糖的色譜峰作為參照）

【權利要求】
1. 一種苦碟子注射液糖類成分的含量測定方法，其特徵在於步驟如下： (a)樣品的製備 樣品前處理方法：取苦碟子注射液過HyperS印C18柱後，置於具塞圓底燒瓶中，IMHCl調pH為1，減壓抽真空後70°C水浴3h，冷卻後加入10% NaOH調pH至中性，精密量取每 5ml於每支離心管中，冷凍乾燥備用； 稱取上述乾燥物置於10 ml具塞試管中，加入100 mg鹽酸羥胺和500iil吡啶，在 90°C水浴中振蕩反應30min，取出冷至室溫，加入500 ill乙酸酐，於90°C水浴中繼續進行乙 醯化反應30min，冷卻後即得衍生物； 稱取冷凍乾燥物2mg定溶於IOml容量瓶中，然後稀釋到0. 04mg/ml和0. 5mg/ml，精密 移取lml，冷凍乾燥，加入0. 6ml吡啶、IOOmg鹽酸羥胺，混勻，放入90°C水浴中加熱反應30 min，取出後冷卻至室溫，加入0. 3ml六甲基二娃胺，在90°C下繼續反應30min加入0. Iml 三甲基氯娃燒，l〇〇〇〇r/min離心15min，取上清液直接進樣分析； (b) 標準品的製備 醛糖類成分衍生化方法：分別稱取市面上購買的阿洛糖、肌醇、甘露糖、葡萄糖、半乳 糖、阿拉伯糖標準品置於10 ml具塞試管中，加入100 mg鹽酸羥胺和500 ill吡啶，在90°C 水浴中振蕩反應30min，取出冷至室溫，加入500 乙酸酐，於90°C水浴中繼續進行乙醯化 反應30min，冷卻後即得衍生物； 酮糖類成分衍生化方法：分別稱取果糖標準品2mg定溶於IOml容量瓶中，然後稀釋到 0. 04mg/ml和0. 5mg/ml，精密移取lml，冷凍乾燥，加入0. 6ml批陡、IOOmg鹽酸輕胺，混勻， 放入90°C水浴中加熱反應30 min，取出後冷卻至室溫，加入0. 3ml六甲基二矽胺，在90°C下 繼續反應30min加入0. Iml三甲基氯娃燒，10000r/min離心15min，取上清液直接進樣分 析； (c) 色譜條件 氣質分析儀：GC-MS-QP2010SE毛細管柱：Rtx-5 MS 0. 25 mmX30 m，0. 25 ii m ;載氣：高 純氦氣He，99. 999%;進樣口溫度：280°C ;柱流速：1.0mv/min ;進樣量：liil ;分流比：30:1 ; 氣化室溫度：280°C ;柱前壓73. OkPa氣-質接口溫度：270°C ;離子源：EI源；離子源溫度 200°C ;電子能量：70ev ;溶劑延遲時間5min，質量掃描範圍45 - 550amu ; (d) 測定 分別精密吸取標準品與樣品，注入氣相色譜儀，用氣相色譜法測定，制定苦碟子注射液 糖類成分指紋圖譜。
【文檔編號】G01N30/88GK104316630SQ201410021654
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】王暉, 張豔君, 李遇伯, 劉東輝, 陳 峰 申請人:通化華夏藥業有限責任公司