一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器的製備方法及應用與流程

2023-05-01 14:49:11

本發明涉及一種用於檢測雌二醇的傳感器的製備方法，屬於新型納米功能材料與電化學生物傳感分析技術領域。

背景技術：
環境雌激素是指一類進入機體後，具有幹擾體內正常內分泌物質的合成、釋放、運輸、結合、代謝等過程，激活或抑制內分泌系統的功能，從而破壞維持機體穩定性和調控作用的化合物，環境雌激素種類繁多，包括人工合成化合物及植物天然雌激素，廣泛分布於自然界中。雌二醇便是一種類固醇類合成雌激素。目前，檢測雌二醇的方法主要有色譜法、質譜法等。此類方法儀器貴重、操作複雜，化驗人員需要專業培訓後才能進行檢測。因此，研發成本低、檢測快、靈敏度高、特異性強的雌二醇傳感器具有重要意義。電化學生物傳感分析技術由於操作簡便、檢測速度快等優勢，日益得到人們的重視。目前，用於檢測雌二醇的電化學生物傳感分析技術按照檢測手段來分主要有電化學傳感器、電致化學發光傳感器和光電化學傳感器三種。其中，電致化學發光傳感器和光電化學傳感器相對於電化學傳感器，具有背景信號噪音少、靈敏度高、檢測成本低等特點，近幾年被越來越多的研究者所關注。電致化學發光也稱為電化學發光，是指通過電化學方法在電極表面產生一些特殊的物質，這些物質之間或與體系中其他組分之間通過電子傳遞形成激發態，由激發態返回到基態產生發光現象。電致化學發光傳感器即通過改變電極表面的修飾材料，與分析物產生電化學發光，在最優條件下，根據分析物濃度與電化學發光強度的相關變化實現對分析物的定性定量分析。光電化學傳感器是基於外加光源激發光電敏感材料導致電子-空穴對進行分離，在合適的偏電位條件下，實現電子在電極、半導體及修飾物和分析物上的快速傳遞，並形成光電流。在最優條件下，分析物濃度的變化會直接影響光電流的大小，可以根據光電流的變化實現對分析物的定性定量分析。但是，由於電致化學發光傳感器需要外置光信號捕捉設備如光電二極體等，而光電化學傳感器需要外設光源來激發光電敏感材料，這在一定程度上影響了二者操作的便捷性，限制了他們在實際生產、生活中更為廣泛的應用。因此，設計、製備更為簡便、快捷的檢測雌二醇的電化學生物傳感分析技術具有十分重要的實用價值。

技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種操作簡單、攜帶方便、檢測快、成本低的雌二醇傳感器的製備方法，所製備的傳感器，可用於日常生產、生活等領域的對雌二醇的快速、靈敏檢測。基於此目的，本發明在同一電解池中，採用四電極系統，即兩個工作電極、一個對電極和一個參比電極，其中工作電極1採用磷酸鎳銨微納材料NH4NiPO4和電聚合的魯米諾進行修飾，作為電致化學發光工作電極W1，也作為自發光光源，工作電極2採用二氧化鈦納米粒子溶膠TiO2NPs和雌二醇抗體共同進行修飾，作為光電化學工作電極W2。進行檢測時，在電解池中加入固定濃度過氧化氫後，在W1上施加階躍電壓，由於NH4NiPO4的穩定發光的作用，魯米諾與過氧化氫反應，產生電致化學發光，這便相當於「開燈」，當階躍電壓為0時，電致化學發光消失，這便相當於「關燈」，與此同時在W2上一直施加恆定電壓，由於TiO2NPs會因為電致化學發光產生的發光激發導致電子-空穴對進行分離，標記在雌二醇二抗上的辣根過氧化物酶HRP催化過氧化氫產生氧氣，使過氧化氫成為空穴「給體」，從而在W2上得到光電流，當電致化學發光消失，即「關燈」時，光電流隨即消失。由於在固定過氧化氫濃度的前提下，光電流大小與HRP濃度正相關，當被測物中雌二醇濃度越大，當與一抗免疫結合到W2上時，再免疫結合標記有HRP的雌二醇二抗的濃度就會越大，產生的光電流也就越大，因此通過記錄光電流的大小即可實現對雌二醇的檢測。基於以上發明原理，本發明採用的技術方案如下：1.一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器的製備方法，其特徵在於，製備步驟為：（1）電致化學發光工作電極W1的製備：1）以ITO導電玻璃為工作電極，在電極表面滴塗磷酸鎳銨微納材料NH4NiPO4溶液，覆蓋面積為1cm×1cm，室溫下晾乾；2）將1）得到的工作電極，浸入電解液中，浸入面積為NH4NiPO4溶液所覆蓋的面積，利用三電極系統對工作電極進行電化學沉積，沉積後取出工作電極，使用超純水清洗，4℃下避光乾燥，製得電致化學發光工作電極W1；所述的NH4NiPO4溶液為磷酸鎳銨微納材料水溶液，所述磷酸鎳銨微納材料的製備步驟為：在40mL水中加入2.0~4.0g銨鹽和0.15~0.25g磷酸鹽，完全溶解後，加入0.15~0.25g二氯化鎳，在30~45℃下攪拌10~14h，離心分離，將產品置於50℃下乾燥，即得到NH4NiPO4；所述的銨鹽選自下列之一：氯化銨、溴化銨、磷酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨；所述的磷酸鹽選自下列之一：磷酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨；所述的電解液為含有魯米諾的硫酸溶液，所述的電解液中魯米諾的濃度為1~10mmol/L，硫酸濃度為0.1~1.0mol/L；所述的三電極系統，包括工作電極、參比電極和對電極，所述的參比電極為飽和甘汞電極，所述的對電極為鉑絲電極；所述的電化學沉積過程，採用的電化學方法為循環伏安法，起始電壓為-0.2V，終止電壓為1.5V，掃速為100mv/s，循環20~30圈；（2）光電化學工作電極W2的製備：1）以ITO導電玻璃為工作電極，在電極表面滴塗8~12µL二氧化鈦納米粒子溶膠TiO2NPs，室溫下晾乾；2）將1）中得到的工作電極放入馬弗爐中，在450℃下進行退火處理，處理後冷卻至室溫；3）將2）中得到的工作電極表面滴塗8~12µL雌二醇抗體溶液，4℃下乾燥，乾燥後用超純水清洗，4℃下乾燥，製得光電化學工作電極W2；所述的TiO2NPs為1mg/mL的二氧化鈦納米粒子水溶液；所述的雌二醇抗體溶液的濃度為300µg/mL；（3）基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器的製備方法：1）將W1和W2面面相對插入電解池中，W1與W2間距為0.5cm~1.5cm；2）以Ag/AgCl為參比電極RE、鉑絲電極為對電極CE，插入電解池中，與W1和W2共同組成四電極系統；3）在電解池中加入10mLpH值為11~13的NaOH溶液和0.2mL濃度為1mmol/L的過氧化氫溶液；4）將1）~3）所製得四電極系統以及電解池置於暗盒中，即製得基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器。2.根據技術方案1所述的製備方法所製備的傳感器，應用於雌二醇的檢測，其檢測步驟為：（1）在W2上滴加待測雌二醇溶液，在待測雌二醇溶液中的雌二醇與W2上的雌二醇抗體免疫結合後，衝洗掉其餘物質，再滴加辣根過氧化物酶HRP標記的雌二醇二抗進行免疫結合，結合後衝洗掉多餘的HRP標記的雌二醇二抗，製得待測W2；（2）利用電化學工作站，在含有固定濃度過氧化氫的電解液中，在W1上採用階躍電壓的方法對W1施加階躍電壓，初始電壓為0v，階躍電壓為0.7~0.9v，階躍時間為10~30s；同時，在待測W2上採用時間-電流方法對待測W2施加恆定電壓，電壓為0~0.6v；待測W2上的電流會隨著待測雌二醇溶液中雌二醇的濃度增大而相應增大，根據所得電流增大值得出待測雌二醇溶液中雌二醇的濃度；所述的HRP標記的雌二醇二抗的濃度為300µg/mL。本發明的有益成果（1）本發明所述的雌二醇傳感器製備簡單，操作方便，無需外部輔助設備，利用檢測設備的微型化、便攜化，並實現了對雌二醇的快速、靈敏、高選擇性檢測，具有廣闊的市場發展前景；（2）本發明首次在同一電解池中採用四電極系統檢測雌二醇，並實現了電致化學發光與光電化學雙功能信號放大策略。在電解池中隨著雌二醇濃度的增加，修飾在W2上的HRP標記的雌二醇二抗就會增加，也就意味著HRP對過氧化氫催化的提高。如此一來，一方面，使得電致化學發光強度線性增加，所激發的光電流線性增大；另一方面，過氧化氫作為電子給體，使得光電化學反應中光電流線性增大。因此，電致化學發光和光電化學兩種方法在同一電解池中、同一電化學工作站下共同反應、相互作用，實現了對雌二醇檢測電信號的雙重放大，極大地提高了檢測靈敏度和檢出限，具有重要的科學意義和應用價值。具體實施方式實施例1一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器的製備方法，具體的製備步驟為：（1）電致化學發光工作電極W1的製備：1）以ITO導電玻璃為工作電極，在電極表面滴塗NH4NiPO4溶液，覆蓋面積為1cm×1cm，室溫下晾乾；2）將1）得到的工作電極，浸入電解液中，浸入面積為NH4NiPO4溶液所覆蓋的面積，利用三電極系統對工作電極進行電化學沉積，沉積後取出工作電極，使用超純水清洗，4℃下避光乾燥，製得電致化學發光工作電極W1；所述的NH4NiPO4溶液為磷酸鎳銨微納材料水溶液，所述磷酸鎳銨微納材料的製備步驟為：在40mL水中加入2.0~4.0g銨鹽和0.15~0.25g磷酸鹽，完全溶解後，加入0.15~0.25g二氯化鎳，在30~45℃下攪拌10~14h，離心分離，將產品置於50℃下乾燥，即得到NH4NiPO4；所述的銨鹽選自下列之一：氯化銨、溴化銨、磷酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨；所述的磷酸鹽選自下列之一：磷酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨；所述的電解液為含有魯米諾的硫酸溶液，所述的電解液中魯米諾的濃度為1mmol/L，硫酸濃度為0.1mol/L；所述的三電極系統，包括工作電極、參比電極和對電極，所述的參比電極為飽和甘汞電極，所述的對電極為鉑絲電極；所述的電化學沉積過程，採用的電化學方法為循環伏安法，起始電壓為-0.2V，終止電壓為1.5V，掃速為100mv/s，循環20圈。（2）光電化學工作電極W2的製備：1）以ITO導電玻璃為工作電極，在電極表面滴塗8µL二氧化鈦納米粒子溶膠TiO2NPs，室溫下晾乾；2）將1）中得到的工作電極放入馬弗爐中，在450℃下進行退火處理，處理後冷卻至室溫；3）將2）中得到的工作電極表面滴塗8µL雌二醇抗體溶液，4℃下乾燥，乾燥後用超純水清洗，4℃下乾燥，製得光電化學工作電極W2；所述的TiO2NPs為1mg/mL的二氧化鈦納米粒子水溶液；所述的雌二醇抗體溶液的濃度為300µg/mL；（3）基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器的製備方法：1）將（1）中製備的W1和（2）中製備的W2面面相對插入電解池中，W1與W2間距為0.5cm；2）以Ag/AgCl為參比電極RE、鉑絲電極為對電極CE，插入電解池中，與W1和W2共同組成四電極系統；3）在電解池中加入10mLpH值為11的NaOH溶液和0.2mL濃度為1mmol/L的過氧化氫溶液；4）將1）~3）所製得四電極系統以及電解池置於暗盒中，即製得基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器。實施例2一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器的製備方法，具體的製備步驟為：（1）電致化學發光工作電極W1的製備：製備步驟同實施例1中W1的製備步驟，不同之處為：磷酸鎳銨微納材料的製備步驟中銨鹽加入量為0.3g，磷酸鹽加入量為0.20g，二氯化鎳加入量為0.20g，攪拌溫度和時間分別為38℃和12h；電解液中魯米諾的濃度為5mmol/L，硫酸濃度為0.5mol/L；循環伏安法進行電化學沉積時，循環25圈。（2）光電化學工作電極W2的製備：1）以ITO導電玻璃為工作電極，在電極表面滴塗10µL二氧化鈦納米粒子溶膠TiO2NPs，室溫下晾乾；2）將1）中得到的工作電極放入馬弗爐中，在450℃下進行退火處理，處理後冷卻至室溫；3）將2）中得到的工作電極表面滴塗10µL雌二醇抗體溶液，4℃下乾燥，乾燥後用超純水清洗，4℃下乾燥，製得光電化學工作電極W2；其餘同實施例1中W2的製備步驟。（3）基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器的製備方法：製備步驟同實施例1，不同之處為W1與W2間距為1.0cm，在電解池中加入的NaOH溶液的pH值為12。實施例3一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器的製備方法，具體的製備步驟為：（1）電致化學發光工作電極W1的製備：製備步驟同實施例1中W1的製備步驟，不同之處為：磷酸鎳銨微納材料的製備步驟中銨鹽加入量為0.4g，磷酸鹽加入量為0.25g，二氯化鎳加入量為0.25g，攪拌溫度和時間分別為45℃和14h；電解液中魯米諾的濃度為10mmol/L，硫酸濃度為1.0mol/L；循環伏安法進行電化學沉積時，循環30圈。（2）光電化學工作電極W2的製備：1）以ITO導電玻璃為工作電極，在電極表面滴塗12µL二氧化鈦納米粒子溶膠TiO2NPs，室溫下晾乾；2）將1）中得到的工作電極放入馬弗爐中，在450℃下進行退火處理，處理後冷卻至室溫；3）將2）中得到的工作電極表面滴塗12µL雌二醇抗體溶液，4℃下乾燥，乾燥後用超純水清洗，4℃下乾燥，製得光電化學工作電極W2；其餘同實施例1中W2的製備步驟。（3）基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器的製備方法：製備步驟同實施例1，不同之處為W1與W2間距為1.5cm，在電解池中加入的NaOH溶液的pH值為13。實施例4一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器的應用實施例1製備的一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器應用於雌二醇的檢測，其檢測步驟為：（1）在W2上滴加10µL不同濃度的雌二醇標準溶液，孵化30min後，雌二醇與W2上的雌二醇抗體進行免疫結合，衝洗後，再滴加10µL辣根過氧化物酶HRP標記的雌二醇二抗，孵化30min後，HRP標記的雌二醇二抗與雌二醇進行免疫結合，衝洗後，製得待測W2；（2）利用電化學工作站，在W1上採用階躍電壓的方法對W1施加階躍電壓，初始電壓為0v，階躍電壓為0.7v，階躍時間為10s；同時，在待測W2上採用時間-電流方法對待測W2施加恆定電壓，電壓為0v；待測W2上的電流會隨著雌二醇濃度的增大而相應增大，根據所得電流增大值與雌二醇濃度之間的關係，繪製工作曲線；（3）將待測雌二醇溶液代替雌二醇的標準溶液，按照（1）和（2）所述的雌二醇檢測方法進行檢測，根據所得到的電流增大值與所繪製的工作曲線得出待測雌二醇溶液的濃度；所述的HRP標記的雌二醇二抗的濃度為300µg/mL。實施例5一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器的應用實施例2製備的一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器應用於雌二醇的檢測，其檢測步驟除以下步驟外，其餘步驟同實施例4：步驟（2）利用電化學工作站，在W1上採用階躍電壓的方法對W1施加階躍電壓，初始電壓為0v，階躍電壓為0.8v，階躍時間為20s；同時，在待測W2上採用時間-電流方法對待測W2施加恆定電壓，電壓為0.3v；待測W2上的電流會隨著雌二醇濃度的增大而相應增大，根據所得電流增大值與雌二醇濃度之間的關係，繪製工作曲線。實施例6一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器的應用實施例3製備的一種基於自發光激發的雌二醇光電化學傳感器應用於雌二醇的檢測，其檢測步驟除以下步驟外，其餘步驟同實施例4：步驟（2）利用電化學工作站，在W1上採用階躍電壓的方法對W1施加階躍電壓，初始電壓為0v，階躍電壓為0.9v，階躍時間為30s；同時，在待測W2上採用時間-電流方法對待測W2施加恆定電壓，電壓為0.6v；待測W2上的電流會隨著雌二醇濃度的增大而相應增大，根據所得電流增大值與雌二醇濃度之間的關係，繪製工作曲線。實施例7實施例1-3所製備的雌二醇傳感器，按照實施例4-6的檢測步驟應用於雌二醇的檢測，具有優良的檢測效果，檢測限為12pmol/L。