一種組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架及其製備方法
2023-05-01 04:21:51
一種組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架，包括軟骨層和軟骨下骨層，所述軟骨層與軟骨下骨層通過光聚合的改性透明質酸凝膠結合為一體，所述軟骨層的材料為載有轉化軟骨細胞的光聚合的改性透明質酸凝膠，所述軟骨下骨層的材料為多孔生物玻璃支架。本發明還公開了一種上述組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架的製備方法：將具有光聚合的改性透明質酸凝膠與體外誘導轉化軟骨細胞混合均勻後，經紫外聚合形成混合凝膠；將多孔生物玻璃支架放置在混合凝膠上，加入具有光聚合的改性透明質酸凝膠，光照交聯後得到組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架。該產品具有良好的生物相容性，可以降解，製備方法簡單。
【專利說明】一種組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於骨軟骨組織工程支架【技術領域】，尤其涉及一種用於骨軟骨修復的支架結構及其製備方法。
【背景技術】[0002]61%的成人膝蓋存在關節軟骨缺損；其中，19%是骨軟骨缺損。關節軟骨自身修復能力有限，一旦受損便難於恢復。目前常規的治療方式包括自體軟骨移植，自體或異體骨軟骨移植。這些治療手段存在一定的局限性，例如軟骨移植來源有限，供區功能受損，免疫排斥，植入體鬆動等。隨著組織工程技術的出現，骨軟骨修復的研究得到了很大的發展。構建骨軟骨組織工程支架需要細胞，軟骨細胞外基質和軟骨下骨。從自體或異體提取的軟骨細胞廣泛應用於組織工程軟骨修復中，但是軟骨數量有限，只佔軟骨組織的5~10%，因此使用前需要體外繁殖。但是，軟骨細胞在體外單層培養時會出現去分化。目前有較多人工合成的高分子材料用作軟骨細胞外基質，如聚乙二醇(PEG)，聚-α -羥基酯、聚NiPAAm、聚丙烯-反丁烯二酸、聚丙烯反丁烯二酸、聚氨酯聚氨基甲酸酯等，他們的主要特點是具有可塑性，有一定的強度，但在生物相容性、理化性能、降解速率的控制方面上有許多問題有待解決。軟骨下骨層多用多孔鈦合金支架，它具有較高的強度，良好的生物相容性，但是在體內不能降解。
【發明內容】
[0003]為了克服現有技術中軟骨修復材料生物相容性差、難以降解的缺陷，本發明的目的是提供一種組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架；具有良好的生物相容性，其中的改性透明質酸具有光聚合性，同時在體內透明質酸分解酶的作用下可以降解，降解產物也不具有生物毒性。改性透明質酸水凝膠可與細胞均勻混合，經紫外光聚合後，形成透明質酸與細胞的混合凝膠；軟骨層中的軟骨細胞來源廣泛。軟骨下骨層材料為三維列印的具有高強度的多孔生物玻璃支架，其強度高可用於承重部位的軟骨下骨修復。生物玻璃可在體內降解，轉化為類骨質羥基磷灰石，具有良好的骨傳導性，在骨修復領域已被廣泛研究；生物玻璃在降解過程中，釋放玻璃組分中的各種元素，可刺激骨軟骨修復。
[0004]本發明的另一個目的是提供一種上述組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架的製備方法，該方法簡單，支架可根據具體尺寸結構要求進行製作。
[0005]為了實現上述目的，本發明的技術方案如下:
[0006]本發明提供了一種組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架，包括軟骨層和軟骨下骨層，所述軟骨層與軟骨下骨層通過光聚合的改性透明質酸凝膠結合為一體，所述軟骨層的材料為載有轉化軟骨細胞的光聚合的改性透明質酸凝膠，所述軟骨下骨層的材料為多孔生物玻璃支架。
[0007]其中，所述轉化軟骨細胞的密度較佳地為5 X IO6~IX 108/mL。
[0008]其中，所述轉化軟骨細胞較佳地是由骨髓間充質幹細胞、胚胎幹細胞、脂肪幹細胞或成纖維細胞誘導轉化而得。
[0009]所述轉化軟骨細胞更佳地為體外培養原代至第四代的自體或同種異體骨髓間充質幹細胞誘導轉化的軟骨細胞。
[0010]在本發明的一較佳實施方式中，所述軟骨層還可添加或複合骨髓間充質幹細胞、胚胎幹細胞、脂肪幹細胞、生長因子或轉基因成分中的一種或一種以上，以保持軟骨細胞和基質合成能力。
[0011]其中，所述多孔生物玻璃支架較佳地包括多孔矽酸鹽生物玻璃支架、多孔硼矽酸鹽生物玻璃支架或多孔硼酸鹽生物玻璃支架；所述多孔生物玻璃支架中更佳地還含有添加微量的Cu、Zn、Ba、Sr、Ag、Fe、F或Mn中的一種或一種以上。所述的多孔生物玻璃支架的強度較佳地為50~lOOMPa，孔隙率較佳地為45~75%，孔徑較佳地為100~300 μ m。
[0012]本發明還提供了一種上述組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架的製備方法，包括以下步驟:將具有光聚合的改性透明質酸凝膠與體外誘導轉化軟骨細胞混合均勻後，經紫外聚合形成混合凝膠；將多孔生物玻璃支架放置在混合凝膠上，加入具有光聚合的改性透明質酸凝膠，光照交聯後得到組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架。
[0013]其中，所述光聚合的改性透明質酸凝膠較佳地由下述製備方法製得:將質量濃度為I~5%的透明質酸鈉水溶液在冰點進行攪拌溶解後再與甲基丙烯酸酐混合，所述甲基丙烯酸酐的濃度為透明質酸鈉摩爾濃度的20倍，調節pH使pH值始終大於8，冰點攪拌反應24小時，放入透析膜內用50倍體積的去離子水透析3天，冷凍乾燥48小時後再與生理鹽水和交聯劑12959混合得到光聚合的改性透明質酸凝膠。
[0014]其中，所述透明 質酸鈉的濃度較佳地為2wt%。
[0015]其中，所述透明質酸鈉的分子量較佳地為66~90千道爾頓。
[0016]其中，所述具有光聚合的改性透明質酸凝膠中改性透明質酸的濃度較佳地為
0.05wt%o
[0017]其中，所述交聯劑12959的濃度較佳地為0.05wt%。
[0018]其中，所述轉化軟骨細胞或所述光聚合的改性透明質酸凝膠的個數體積比例較佳地為 40X107mL。
[0019]其中，所述紫外聚合的方法較佳地為紫外燈照射，波長較佳地為320~400nm，強度較佳地為8900 μ W / cm2~21700 yff / cm2,照射高度較佳地為5~25cm，時間較佳地為5~15分鐘。
[0020]其中，所述光照交聯的方法較佳地為紫外燈照射，波長較佳地為320~400nm，強度較佳地為8900 μ W / cm2~21700 yff / cm2,照射高度較佳地為5~25cm，時間較佳地為5~15分鐘。
[0021]本發明同現有技術相比，具有以下優點和有益效果:
[0022]本發明的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架具有良好的生物相容性，其中的改性透明質酸具有光聚合性，同時在體內透明質酸分解酶的作用下可以降解，降解產物也不具有生物毒性；改性透明質酸凝膠可與細胞均勻混合，經紫外光聚合後，形成透明質酸與細胞的混合凝膠；軟骨層中的軟骨細胞來源廣泛；軟骨下骨層材料為三維列印的具有高強度的多孔生物玻璃支架，其強度高可用於承重部位的軟骨下骨修復；生物玻璃可在體內降解，轉化為類骨質羥基磷灰石，具有良好的骨傳導性，在骨修復領域已被廣泛研究；生物玻璃在降解過程中，釋放玻璃組分中的各種元素，可刺激骨軟骨修復。
[0023]本發明製備組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架的方法簡單，支架可根據具體尺寸結構要求進行製作。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為實施例1所示的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架的結構示意圖。
[0025]圖2為實施例4所示的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架體外培養4周後的死活細胞圖。
[0026]圖3為實施例4所示的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架體外培養4周後的Safranin O 染色圖。
[0027]圖4為實施例4所示的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架體外培養4周後的Picrosirius red 染色圖。
[0028]圖5為實施例7所示的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架在體內12周後的甲苯胺藍染色照片。
【具體實施方式】
[0029]下面結合附圖所示實施例對本發明作進一步詳細的說明。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。下述實施例中，所用的交聯劑 12959 購自於 Ciba, Tarrytown, NY。
[0030]下述實施例中，矽酸鹽生物玻璃，硼矽酸鹽玻璃生物玻璃，硼酸鹽生物玻璃，微量元素添加的矽酸鹽生物玻璃，微量元素添加的硼矽酸鹽生物玻璃和微量元素添加的硼酸鹽生物玻璃均可通過傳統熔融法製備獲得。多孔生物玻璃支架可選用利用現有多孔支架製備技術製備獲得的多孔生物玻璃支架，矽酸鹽生物玻璃多孔支架更優選製備步驟可參考文獻「Fu, Q.，E.Saiz, and A.P.Tomsia, Direct ink writing of highly porous and strongglass scaffolds for load-bearing bone defects repair and regeneration.ACTA BIOMATERIALIA, 2011.7(10):p.3547-3554.」。具體步驟如下:用溼磨法將矽酸鹽生物玻璃顆粒磨成粒徑為I~3 μ m的玻璃粉末。將40% (體積百分比)的玻璃粉末充分分散在20% (重量百分比)的Pluronic F-127溶膠中，形成玻璃粉混料。將玻璃粉混料裝入3mL針筒中，安裝入三維印表機中(3D Inks，A3200-Npaq, Sti I lwater, OK)，在電腦軟體(RoboCAD3.0 )中設計好支架的三維尺寸、孔徑大小後進行列印。
[0031]硼酸鹽生物玻璃和硼矽酸鹽生物玻璃支架優選採用如下方法製備得到:將30~50% (體積百分比)的玻璃粉末充分分散在含5%~6% (體積百分比)乙基纖維素和8%~10% (體積百分比)PEG300的乙醇混合液中，混合均勻形成玻璃粉混料。將玻璃粉混料裝入3mL針筒中，安裝入三維印表機中(3D Inks, A3200-Npaq, Stillwater, OK),在電腦軟體(RoboCAD3.0)中設計好支架的三維尺寸、孔徑大小後進行列印。
[0032]列印的支架在60°C乾燥過夜，依據表1的升溫制度在空氣爐進行預燒，隨後在560~710°C燒結I小時，得到多孔生物玻璃支架。
[0033]表1升溫制度
[0034]
【權利要求】
1.一種組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架，其特徵在於:包括軟骨層和軟骨下骨層，所述軟骨層與軟骨下骨層通過光聚合的改性透明質酸凝膠結合為一體，所述軟骨層的材料為載有轉化軟骨細胞的光聚合的改性透明質酸凝膠，所述軟骨下骨層的材料為多孔生物玻璃支架。
2.根據權利要求1所述的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架，其特徵在於:所述轉化軟骨細胞的密度為5 X IO6~I X 108/mL。
3.根據權利要求1所述的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架，其特徵在於:所述轉化軟骨細胞是由骨髓間充質幹細胞、胚胎幹細胞、脂肪幹細胞和/或成纖維細胞誘導轉化而得。
4.根據權利要求1所述的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架，其特徵在於:所述轉化軟骨細胞為體外培養原代至第四代的自體和/或同種異體骨髓間充質幹細胞誘導轉化的軟骨細胞。
5.根據權利要求1所述的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架，其特徵在於:所述軟骨層可添加或複合骨髓間充質幹細胞、胚胎幹細胞、脂肪幹細胞、生長因子或轉基因成分中的一種或一種以上。
6.根據權利要求1所述的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架，其特徵在於:所述多孔生物玻璃支架包括多孔矽酸鹽生物玻璃支架、多孔硼矽酸鹽生物玻璃支架或多孔硼酸鹽生物玻璃支架；在組成中添加微量的Cu、Zn、Ba、Sr、Ag、Fe、F或Mn中的一種或一種以上； 或所述多孔生物玻璃支架採用水基和/或有機相進行製備； 或所述多孔生物玻璃支架的強度為10~lOOMPa，孔隙率為45~75%，孔徑為100~500 μ m。`
7.—種權利要求1至6任一所述的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架的製備方法，其特徵在於:包括以下步驟:將具有光聚合的改性透明質酸凝膠與體外誘導轉化軟骨細胞混合均勻後，經紫外聚合形成混合凝膠；將多孔生物玻璃支架放置在混合凝膠上，加入具有光聚合的改性透明質酸凝膠，光照交聯後得到組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架。
8.根據權利要求7所述的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架的製備方法，其特徵在於:所述光聚合的改性透明質酸凝膠的製備方法包括以下步驟:將質量濃度為I~5%的透明質酸鈉水溶液在冰點進行攪拌溶解後再與甲基丙烯酸酐混合，所述甲基丙烯酸酐的濃度為透明質酸鈉摩爾濃度的20倍，調節pH使pH值始終大於8，冰點攪拌反應24小時，放入透析膜內用50倍體積的去離子水透析3天，冷凍乾燥48小時後再與生理鹽水和交聯劑12959混合得到光聚合的改性透明質酸凝膠。
9.根據權利要求8所述的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架的製備方法，其特徵在於:所述透明質酸鈉的濃度為2wt%。
10.根據權利要求8所述的組織工程骨軟骨修復的雙層複合支架的製備方法，其特徵在於:所述透明質酸鈉的分子量為66~90千道爾頓； 或所述具有光聚合的改性透明質酸凝膠中改性透明質酸的濃度為0.05wt% ； 或所述交聯劑12959的濃度為0.05wt% ； 或所述轉化軟骨細胞或所述光聚合的改性透明質酸凝膠的個數體積比例為40X IO6/mL ；或所述紫外聚合的方法為紫外燈照射，波長320~400nm，強度為8900 μ W / cm2~.21700 μ W / cm2,照射高度5~25cm，時間為5~15分鐘； 或所述光照交聯的方法為紫外燈照射，波長320~400nm，強度為8900 μ W / cm2~.21700 μ W / cm2,照射高度5~25cm，時間為5~15分鐘。
【文檔編號】A61L27/38GK103877614SQ201410066627
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月26日 優先權日:2014年2月26日
【發明者】黃文旵, 顧刈非, 周萘, 王德平 申請人:同濟大學