一種幹細胞、其製備方法及其用途的製作方法
2023-05-01 13:53:21 1
專利名稱：一種幹細胞、其製備方法及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種幹細胞、其製備方法及其用途，特別是從人或其他哺乳動物的胚胎、臍帶血、脊髓、軟骨等組織中製備的幹細胞、其製備方法及其在治療、修復失去功能的病變組織或器官中的應用。
幹細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞原始細胞。它包括胚胎幹細胞和成體幹細胞。胚胎幹細胞是全能的，具有分化為幾乎全部組織和器官的能力，例如在胚胎的發生發育中，單個受精卵可以分裂發育為多細胞的組織或器官。最新研究發現，成體幹細胞可以橫向分化為其他類型的細胞和組織，例如，在成年動物中，正常的生理代謝或病理損傷也會引起組織或器官的修復再生。由於胚胎的分化形成和成年組織的再生是幹細胞進一步分化的結果，為幹細胞的廣泛應用提供了基礎。
幹細胞具有自我更新能力，能夠產生高度分化的功能細胞。組織特異性幹細胞同樣具有分化成其他細胞或組織的潛能，這為幹細胞的應用開創了更廣泛的空間。通過定向誘導，幹細胞可以分化成不同組織細胞，包括角膜、神經及其他器官細胞、因此被稱為「源泉細胞」。因此通過幹細胞技術培育出來的細胞、組織，可以移植到失去功能的病變組織或器官中，使其恢復正常功能。
目前許多研究工作都是以小鼠畸胎瘤幹細胞(EC細胞)為研究對象展開的，如德美醫學小組在去年成功的向試驗鼠體內移植了由ES細胞培養出的神經膠質細胞。此後，密蘇裡的研究人員通過鼠胚細胞移植技術，使癱瘓的貓恢復了部分肢體活動能力。隨著ES細胞的研究日益深入，生命科學家對人類ES細胞的了解邁入了一個新的階段。在1998年末，美國兩個研究小組成功地培養出人類ES細胞，保持了ES細胞分化為各種體細胞的全能性。這樣就使科學家利用人類ES細胞治療各種疾病成為可能。
但由於哺乳動物胚胎植入子宮後的不可接近性，ES細胞的研究一直徘徊不前。1995年Thomson從恆河猴的胚泡分離並建立了ES細胞系，這是第一個建系的靈長類動物的胚胎幹細胞。這種具有正常XY核型的ES細胞，在持續傳代中保持未分化狀態達一年以上，而且它表達某些人畸胎瘤細胞的表面標誌。在恆河猴ES細胞的培養中發現了飼養細胞及LIF(leukemia inhibitory factor)的重要作用，這為人類ES細胞系的建立奠定了基礎，並為探討人胚胎發育、組織分化的體外模型提供了相對可靠的參照。
在人ES細胞研究過程中，畸胎瘤一直是主要研究素材。但這種人的胚胎腫瘤細胞系的分化範圍非常有限，細胞系之間變異大，更關鍵的是它並不能完全精確地代表正常分化的特點；研究對象來源的匱乏以及倫理道德的約束，使人胚胎幹細胞的體外研究一直是空白。這種狀況在1998年被打破，Thomson再創先河，他藉助Gardner，DK發明的G1.2和G2.2培養基，解決了早期胚胎對輸卵管環境的依賴性問題，從而將新鮮或冰凍的人體外受精卵(IVF，in vitro fertilization)由4-8細胞階段培養至胚泡期，分離內細胞團(ICM，inner cell mass)後逐漸傳代建係為ES細胞系；同期，John.D Gearheart從人原始生殖細胞(primordial germ cell)中建立了與ES細胞功能相似的多能幹細胞系——胚胎生殖細胞系(EG細胞，embryonic germ cell)，這兩個實驗小組的結果在《Science》和《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》上一經刊出，立即引起了研究者們的極大興趣。這不僅掀起了新一輪的胚胎幹細胞研究熱潮，還由於人類胚胎幹細胞建系及誘導胚胎幹細胞分化為神經幹細胞和心肌幹細胞獲得成功，使得胚胎幹細胞應用於臨床的研究產生了突破性的進展。
ES細胞可作為評價新藥及化學產品的毒性及效能的檢測系統。ES細胞系具有組織、細胞的廣譜性，它發展為胚體後的生物系統，可模似體內細胞間複雜的相互作用，這在藥物和農用化學品工業上有廣泛的用途，可減少動物檢測，降低成本，有重要的商業價值。ES細胞最引人注目之處在於它有重要的臨床意義，即ES細胞有可能成為今後細胞替代療法的主角。ES細胞作為個體發育之初的原始幹細胞，遵循著細胞分化的普遍規律，這是發育潛能逐漸局限、細胞功能專一化的過程，內涵不斷增加，外延逐漸縮小，最後的命運是某種組織細胞。從理論上講，ES細胞可以無限地提供可為移植所有的特異性的細胞類型，置換疾病組織和放化療損傷後的造血系統，這為遺傳病、腫瘤和衰老等疾病的解決提供了新的思路，許多醫療分支的研究均可受益於此項創舉。
在特定條件下，成體幹細胞或者產生新的幹細胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態平衡。過去認為成體幹細胞主要包括上皮幹細胞和造血幹細胞。最近研究表明，以往認為不能再生的神經組織仍然包含神經幹細胞，說明成體幹細胞普遍存在，問題是如何尋找和分離各種組織特異性幹細胞。成體幹細胞經常位於特定的微環境中。微環境中的間質細胞能夠產生一系列生長因子或配體，與幹細胞相互作用，控制幹細胞的更新和分化。
造血幹細胞是體內各種血細胞的唯一來源，它主要存在於骨髓、外周血、臍帶血中。2000年科學家又在肌肉組織中發現了具有造血潛能的幹細胞。造血幹細胞的移植是治療血液系統疾病、先天性遺傳疾病以及多發性和轉移性惡性腫瘤疾病的最有效方法。
在臨床治療中，造血幹細胞應用較早，在20世紀五十年代，臨床上就開始應用骨髓移植(BMT)方法來治療血液系統疾病。到八十年代末，外周血幹細胞移植(PBSCT)技術逐漸推廣開來，絕大多數為自體外周血幹細胞移植(APBSCT)，在提高治療有效率和縮短療程方面優於常規治療，且效果令人滿意。
與兩者相比，臍血幹細胞移植的長處在於無來源的限制，對HLA配型要求不高，不易受病毒或腫瘤的汙染。在2000年年初，東北地區首例臍血幹細胞移植成功，又為中國造血幹細胞移植技術注入新的活力。隨著臍血幹細胞移植技術的不斷完善，它可能會代替目前APBSCT的地位，為全世界更多的血液病及惡性腫瘤的患者帶來福音。
關於神經幹細胞研究起步較晚，由於分離神經幹細胞所需的胎兒腦組織較難取材，加之胚胎細胞研究的爭議尚未平息，神經幹細胞的研究仍處於初級階段。理論上講，任何一種中樞神經系統疾病都可歸結為神經幹細胞功能的紊亂。腦和脊髓由於血腦屏障的存在使之在幹細胞移植到中樞神經系統後不會產生免疫排斥反應，如給帕金森氏綜合症患者的腦內移植含有多巴胺生成細胞的神經幹細胞，可治癒部分患者症狀。除此之外，神經幹細胞的功能還可延伸到藥物檢測方面，對判斷藥物有效性、毒性有一定的作用。
基於組織工程和基因工程技術發展起來的細胞(或組織)替代治療和基因治療是近年來醫學領域乃至整個生命科學領域中的研究熱點和前沿，為人類徵服多種疾病提供了新的途徑和希望。其中一個關鍵問題是選擇滿足要求和易於操作的耙細胞，幹細胞因其具有高度自我更新能力和多向分化潛能，是細胞治療和基因治療的首選靶細胞。
間充質幹細胞是骨髓中除造血幹細胞外的另一類中胚層發育的早期細胞，這類細胞可以通過體外貼壁培養加以分離，不僅可分化為造血實質和基質細胞，還可分化為多種造血以外的組織，特別是中胚層和神經外胚層來源組織的細胞，並易於外源基因的轉染和表達，因而可能是細胞治療和基因治療理想的靶細胞。近年來，這類幹細胞開始受到學者的廣泛關注。
本世紀70年代，Friedenstech等發現在塑料培養皿中培養的貼壁的骨髓單個核細胞在一定條件下可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞和成肌細胞，而且這些細胞經過20～30個培養周期，仍能保持其多向分化潛能，這類細胞被稱為骨髓間充質幹細胞(MSCs)。將這些細胞植入小鼠的肝臟或腎臟包膜發現可以形成骨樣和軟骨樣細胞。骨髓間充質幹細胞的多向分化能力具有高度的進化保守性。近年來還證實骨髓間充質幹細胞在動物體內可以參與損傷肌組織的再生和形成星形神經膠質細胞，從而為這些細胞、器官、系統相關疾病的治療提供了新的極有價值的線索，引起更廣泛的關注。
骨髓間質來源的細胞，形態成纖維樣，可聚集成均勻的集落，細胞表面蛋白如SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等呈陽性，但CD14、CD34和CD45造血譜系標記則呈陰性。目前，MSCs鑑定的方法都是通過在培養過程中出現分化表型，然後逆推得知是否為間質幹細胞，尚無直接方法可鑑定得到MSCs。
在體外MSCs向多種類型的細胞分化。MSCs在體外培養時，保持幹細胞的特性自身不斷地增殖，在不同誘導條件下能夠向不同譜系分化。通過密度梯度離心從狗或成人骨髓分離的MSCs，用地塞米松、β-磷酸甘油和抗壞血酸等單獨或聯合誘導，可以形成聚集體或結節，鹼性磷酸酶活性增高，基質明顯鈣化，可分化為成骨細胞。一些生長因子如BMP、TGFβ、bFGF等也可以誘導MSCs成骨分化。對鼠顱骨來源的永生化間質前體細胞株2T3分化的分析表明，配體與BMP受體IB結合，可導致成骨分化；配體與BMP受體IA結合，可導致成脂肪分化。可能因為BMPR IA或BMPR IB與BMP受體II形成複合體之後，激活不同的信號轉導途徑，引起不同基因的表達。對於成軟骨細胞分化的機制目前尚不清楚，但MSCs在體外培養過程中，可以自動或經誘導分化成為軟骨細胞。Fortier等(1998)從馬的胸骨骨髓離心得到的MSCs，單層培養，其形態從紡錘狀成纖維細胞樣外形逐漸變為圓形，形成集落斑，並且經歷從I型膠原的表達向II型膠原表達的轉變，蛋白聚糖的合成也不斷增加，表明來自成年馬骨髓的MSCs在單層培養時成軟骨分化。Johnstone等(1998)通過單層培養分離得到的兔MSCs，轉入試管中形成聚集體，在含10-7mol/L地塞米松的培養基中培養，經組織染色和免疫組化檢測，有II、X型膠原表達，表明誘導成軟骨分化；用TGFβ1處理，有或無地塞米松，均可誘導所有細胞進行分化，並伴隨聚集體細胞鹼性磷酸酶活性的提高。Mackay等(1998)將成人骨髓來源的MSCs在地塞米松和TGFβ3的誘導下，第14天，在細胞外基質中檢測到II型膠原、aggrecan；用地塞米松和甲狀腺素處理，MSCs可以進一步向肥大軟骨細胞分化。另有很多實驗證明，將MSCs形成聚集體後，可能有利於成軟骨分化，這與體內軟骨發育的情形類似。在聚集體內部細胞缺乏血管提供養分，依靠細胞與細胞之間的相互作用，也許是成軟骨分化的一個有利條件。MSCs在體外誘導因素的作用下，也可定向分化形成脂肪細胞和肌細胞。Pittenger等(1999)用1-甲基-3異丁基黃嘌呤、地塞米松、胰島素和茚甲新誘導人的MSCs，在細胞內逐漸聚集含脂豐富的小泡，這些細胞表達過氧化物酶體增殖激活受體2(PPAR2)、脂蛋白脂酶(LPL)和脂肪酸結合蛋白αP2。多種誘導處理導致95％以上的細胞定向分化為脂肪細胞，並且脂肪泡不斷地長大、融合，最終充滿細胞。這些脂肪細胞在體外培養可健康生長至少3個月。Wakitani等(1995)將大鼠骨髓來源的第二代MSCs在培養皿中經5氮胞苷處理24小時，7～11天後，在某些培養皿中可以觀察到長的多核肌管，也可在細胞的細胞質中觀察到蘇丹黑陽性小滴。這些觀察說明出生後有機體骨髓中的MSCs可以成為肌祖細胞的來源，可為肌肉再生的臨床研究提供基礎。
近年來，人們不斷地探索利用MSCs進行細胞治療和基因治療。首先，可以用體外培養擴增的MSCs，作為組織工程的種子細胞，修復各種組織。前述的動物實驗中已提及用體外培養擴增的MSCs來修復各種損傷，並且具有良好的效果。儘管人們已成功地利用自身的成骨細胞或軟骨細胞修復骨或軟骨的損傷，但MSCs與這些分化細胞相比，具有更大的優勢。因為在體外培養過程中，MSCs可以保持未分化表型不斷增殖，達到所需的數目，然後經誘導可定向分化為所需表型；而已分化的細胞來源有限，在體外培養時，增殖速度較慢，而且還存在去分化的問題。第二，可通過轉基因的方法，將外源基因導入MSCs。可以將利於定向分化的生長因子基因轉入MSCs，促進定向分化，加快體內組織修復的進程。Lou等將人的BMP2基因通過腺病毒轉染，間質祖細胞能定向進行骨分化，並且在注射到裸鼠肌肉後，可以發育成具有骨小梁、骨髓和軟骨組織的骨。Guinn等證實，轉染了IX因子基因的MSCs，在有序地注入SDID小鼠後，可以分泌蛋白至少達8周。所以，基因工程MSCs可以作為一個有效的載體來治療諸如血友病B和其它由於缺乏循環蛋白引起的遺傳疾病。第三，在一定的條件下有序地植入MSCs，替代有缺陷的骨髓，為其它組織提供MSCs的後代。表達突變膠原基因而衰弱的幼鼠，在將正常鼠的MSCs大量植入後，經過發育，在成鼠的骨、軟骨和腦中正常供體細胞替代率可達30％。在人類也存在由於I型膠原基因的突變，小孩的骨形成不完善，那麼這些結果為臨床治療此類疾病提供了試驗基礎，可給年幼病人移植正常的人白細胞抗原(HLA)匹配的供體骨髓，緩解重度骨缺陷症狀。將來可能的策略是從病人身上分離MSCs，在體外培養時，通過同源重組替代突變的I型膠原基因，然後再回植到病人身上。I期臨床試驗證明，有序地植入自體MSCs是安全的。所以，能夠利用病人自身的基因工程MSCs，治療諸如骨質疏鬆症等疾病。
總之，骨髓來源的間質幹細胞，在體外可以定向分化為不同類型的細胞，能夠作為組織工程中不同細胞的來源；在體內正常循環中能夠分布於多種組織和器官，可以用於細胞和基因治療。
曾有人報導從軟骨中可以分離出形態較為均一的成纖維形的細胞，但未有人對這類的細胞進行鑑定過，也未對該種細胞是否具有多向分化能力進行探討。而且軟骨組織成分單一，不象骨髓、臍血、肝臟有多種成分，所以利用軟骨來源的間充質幹細胞來研究間充質幹細胞的生物學特徵、定向分化條件、分化的分子機制以及細胞治療、基因治療的應用將具有更廣泛的前景。由於軟骨成分單一，如能從軟骨中建立間充質幹細胞系，將比從其他來源的組織中建立間充質幹細胞系更為純化、更具有前景。
可見，獲取幹細胞，並進一步檢測其活性及在治療、修復失去功能的病變組織或器官中的應用，可以為遺傳病、腫瘤和衰老等疾病提供新的解決思路。
本發明的目的在於公開一種從人或其他哺乳動物的胚胎、臍帶血、脊髓、軟骨等組織中製備的幹細胞，所述幹細胞具有生物學活性，能夠分化為細胞或組織。
本發明的另一目的在於公開一種從人或其他哺乳動物的胚胎、臍帶血、脊髓、軟骨等組織中獲取幹細胞的方法，該方法簡便快捷、特異性強、實用有效。
本發明的次一目的在於公開幹細胞在用於製備治療各種疾病藥物中的用途。
為了實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種幹細胞，是以人或其他哺乳動物的胚胎、臍帶血、脊髓等組織為原料，通過免疫磁珠陽性篩選製備的。
具體地說，本發明幹細胞的製備方法包括如下步驟4)將原料稀釋得到稀釋液；5)單核細胞的獲得；6)免疫磁珠陽性篩選。
其中步驟1)中的原料稀釋是採用以20ml枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩衝溶液稀釋臍帶血或脊髓塊等，得到臍帶血或脊髓稀釋液；緩衝溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
或將人或其他哺乳動物的胚胎勻漿。
步驟2)中通過下述方法獲得單核細胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll分層，，4℃ 800g離心30分鐘，收集界面層後，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，得到脊髓單核細胞收集界面層。
上述製備方法中還包括採用流式細胞儀分選幹細胞。
當採用臍帶血為原料時，還包括將棄上清後的沉澱物用紅細胞裂解液4℃下裂解10分鐘。用PBS緩衝液洗滌細胞，300g離心20分鐘，採用流式細胞儀分選幹細胞，得到臍帶血的單核細胞(MNC)。
步驟3)中的免疫磁珠陽性篩選為採用MNC∶Dynabeads M-450CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。Dynabeads M-450 CD34洗滌，置於磁板(MPC)1分鐘，棄清液，PBS緩衝液洗滌2次。混合磁珠(MACS，Miltenyi公司產品)和臍帶血的單核細胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分鐘，陽性篩選CD34+細胞。
玫瑰花環狀細胞—磁珠重新懸起，置於磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重複3次，得玫瑰花環狀細胞—磁珠，懸於100μl PBS緩衝液。Detachabead CD34解離細胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩衝液，混勻，置於磁板(MPC)2分鐘，收集細胞清液，重複3次，匯集細胞清液，置於MPC 2分鐘，除去殘留磁珠，將細胞清液移入錐形試管。離心、洗滌2次，細胞計數，流式細胞儀FACS檢測。
為避免胞內冰晶損傷和溶液損傷，採用人胚胎細胞較多應用的玻璃化凍存方法。首先冰浴預冷凍存液，細胞離心管置於冰水浴操作，沿離心管壁緩加凍存液(何種凍存液)，至細胞終濃度為1×1061.5×106，吹吸勻。分裝於凍存管中，火焰封口，將凍存管直接投入液氮罐保存，降溫速度約為600℃/min，進行細胞凍存。細胞培養時，細胞濃度調至1×106培養。
本發明中採用MTT法測定幹細胞增殖來鑑定所得幹細胞的活性。具體為以無血清培養基製備單細胞懸液，接種於培養板中，加入MTT(中文名)溶液，孵育，離心，棄培養板孔內上清，加入二甲基亞碸。酶聯免役檢測儀測定OD570檢測幹細胞是否出現明顯增殖，如有增殖說明所製備的幹細胞具有活性。
本發明中採用免疫組化法檢查幹細胞是否向肝細胞轉化，具體為取細胞塗片，丙酮固定，加稀釋一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)，37℃40分鐘，PBS洗3次，每次3分鐘。加FITC標記的二抗(1∶50稀釋)，37℃條件下保存40分鐘。PBS洗3次每次3分鐘。緩衝甘油封片，螢光顯微鏡下檢查是否向向肝細胞轉化。
依實驗分組情況進行實驗，CD34+細胞用Hoechest33342、PKH26雙標，尾靜脈注射幹細胞藥物。取觀察臟器製成冰凍切片、石蠟切片。細胞形態學鑑定採用紫外螢光顯微成像，雷射共聚焦細胞儀觀察。細胞人源性檢測採用PCR技術，提取組織中的DNA，用PCR的方法特異性的擴增人Alu序列，用於區分人和鼠的細胞。如果PCR擴增有陽性結果，可進一步通過用人Alu序列的核酸探針進行原位雜交鑑定。細胞造血幹細胞性質檢測採用CD34+CD38+雙標，Confolcal檢測。CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，尾靜脈注射入裸鼠，加幹細胞誘導因子SIF，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測。CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，尾靜脈注射入裸鼠，加SIF的PBS緩衝液，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測。CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，尾靜脈注射入裸鼠，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測。
肝性化檢測，採用免疫組化方法可用CK14、CK19、清蛋白、AFP分別鑑定。肝細胞標記還可用HepParl，OC可採用OV-6和CD-117標記。免疫組化設立人肝陽性對照、鼠肝陰性對照。
在本發明的另一個實施方案中，還涉及以從人或其他哺乳動物的胚胎軟骨為原料製備胚胎軟骨來源的間充質幹細胞的製備。
胚胎軟骨來源的間充質幹細胞是通過下述方法製備取人或其他哺乳動物的軟骨，通過胰蛋白酶、膠原蛋白酶消化、在培養基中培養，傳代，得到間充質幹細胞。
由於胚胎軟骨在胚胎發育時期就是從間充質發育而來，估計在胎兒軟骨中可能存在一部分間充質幹細胞，以彌補由於意外造成的軟骨缺損。本發明中對胚胎的軟骨通過胰酶、膠原酶消化，從胚胎軟骨中分離間充質幹細胞，獲得了比較均一的細胞群，該細胞群的表面標誌與文獻報導的間充質幹細胞的表面標誌十分相似，且細胞增殖旺盛，形態較為均一，在體外對其進行成骨、成脂、成神經的多向分化能力檢測，發現該群細胞具有成骨、成脂、成神經的多向分化能力。
本發明的幹細胞及其製備方法具有下述優點1.簡便快捷經MNC細胞獲取、CD34抗體標記、流式細胞儀分選及細胞接種分離幹細胞。
2.特異性強通過MTT法測定幹細胞增殖，免疫組化法檢查幹細胞是否向肝細胞轉化，結果證明，本發明的幹細胞可以定向轉化。
3.實用有效經誘導可定向轉化，用於幹細胞治療各種疾病及進行細胞藥物的篩選。
下面結合附圖和具體實施例詳細描述本發明，所述的實施例是用於描述本發明，而不是限制本發明。
圖1.CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，幹細胞誘導因子SIF作用於肝臟的雷射共聚焦細胞儀檢測結果圖；圖2.CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，加SIF的PBS緩衝液，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測結果圖；圖3.CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測結果圖；圖4.本發明的間充質幹細胞流式細胞儀鑑定結果圖；
圖5-8.本發明的間充質幹細胞流式細胞儀鑑定結果圖；實施例1取人14周胚胎脊髓約5g剪碎，以20ml枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩衝溶液稀釋，得到脊髓稀釋液；緩衝溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
脊髓稀釋液用Ficoll(Sigma公司產品)分層，Ficoll∶CB＝3∶7，4℃ 800g離心30分鐘。收集界面層後，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，得到脊髓單核細胞(MNC)。
以磁珠(MACS，Miltenyi公司產品)陽性篩選CD34(抗體)和脊髓單核細胞(MNC)，所用抗體為Dynabeads M-450 CD34和Detachabead CD34，與MNC的比例及用量為MNC∶Dynabeads M-450 CD34抗體(Dynal公司產品)Detachabead CD34抗體(Dynal公司產品)＝4×108∶4×107∶4×107(濃度)＝1ml∶100μl∶100μl(用量)。
陽性篩選CD34+細胞(MNC)——混合磁珠和細胞，4℃下微旋孵育30分鐘。
首先用Dynabeads M-450 CD34洗滌脊髓單核細胞，置於磁板(MPC)1分鐘，棄清液後，用PBS緩衝液洗滌4次。
陽性篩選CD34+細胞(MNC)，——將玫瑰花環狀細胞——磁珠重新懸起，置於磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重複3次，得玫瑰花環狀細胞—磁珠，懸於100mlPBS緩衝液中。用Detachabead CD34解離細胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩衝液混勻，置於磁板(MPC)2分鐘，收集細胞清液，重複3次，匯集細胞清液，置於磁板(MPC)2分鐘，除去殘留磁珠，將細胞清液移入錐形試管。離心、洗滌2次，細胞計數，CD34、CD3雙標，流式細胞儀(FACS)檢測MACS陽性篩選CD34+細胞。得到脊髓幹細胞。
為避免胞內冰晶損傷和溶液損傷，採用人胚胎細胞較多應用的玻璃化凍存方法。首先冰浴預冷凍存液，細胞離心管置於冰水浴操作，沿離心管壁緩加凍存液，細胞終濃度為1×1061.5×106，吹吸勻。分裝於凍存管中，火焰封口，將凍存管直接投入液氮罐保存，降溫速度約為600℃/min，進行細胞凍存。
實施例2參考實施例1的方法，具體操作如下取人臍帶血約100ml，以枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩衝溶液稀釋，得到臍帶血的稀釋液，緩衝溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
人臍帶血稀釋液用Ficoll(Sigma公司產品)分層，Ficoll∶CB＝3∶7，4℃ 800g離心30分鐘。收集界面層後，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清。沉澱物用紅細胞裂解液4℃下裂解10分鐘。用PBS緩衝液洗滌細胞，300g離心20分鐘，採用流式細胞儀分選幹細胞，細胞計數，FASC檢測，調整細胞至4×107，得到臍帶血的單核細胞(MNC)。
採用MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。Dynabeads M-450 CD34洗滌，置於磁板(MPC)1分鐘，棄清液，PBS緩衝液洗滌2次。混合磁珠(MACS，Miltenyi公司產品)和臍帶血的單核細胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分鐘，陽性篩選CD34+細胞。
玫瑰花環狀細胞—磁珠重新懸起，置於磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重複3次，得玫瑰花環狀細胞—磁珠，懸於100μl PBS緩衝液。Detachabead CD34解離細胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩衝液，混勻，置於磁板(MPC)2分鐘，收集細胞清液，重複3次，匯集細胞清液，置於MPC 2分鐘，除去殘留磁珠，將細胞清液移入錐形試管。離心、洗滌2次，細胞計數，流式細胞儀FACS檢測。
實施例3同實施例1，不同之處在於採用10周豬胚胎脊髓為原料，得到豬脊髓幹細胞。
實施例4同實施例2，不同之處在於採用牛臍帶血為原料，得到牛臍帶血幹細胞。
實施例5本實施例涉及軟骨來源的間充質幹細胞的製備15周胚胎進行常規的無菌消毒，充分暴露四肢的關節軟骨後將其切取，去除關節軟骨表面的軟骨膜等成分，用PBS反覆衝洗乾淨，用剪刀剪切軟骨至不大於1立方釐米大小，37℃水浴中按照軟骨與胰蛋白酶1∶5的比例，用0.25％胰蛋白酶消化30分鐘，去胰蛋白酶後，按照軟骨與胰蛋白酶1∶5的比例加入含有血清的0.2％II型膠原蛋白酶酶，37℃水浴中攪拌消化90分鐘後，過篩，用冷的hanks緩衝溶液充分洗滌5次，至細胞沉澱明顯，種於75cm2培養瓶中，培養基為10ml IMDM(Hyclone公司產品，ISCOVE』S MODIFIED DUIBECLO』S MEDIUM的縮寫)+1ml 10％胎牛血清+2.5umol/L兩性黴素B+雙抗(100μg/ml青黴素+100μ/ml鏈黴素)。當細胞長至80％～90％融合時，按照1∶3的比例加入0.25％胰酶-1mmol/L EDTA常規消化，以1∶3(1瓶傳3代)比例傳代，液氮凍存。
經流式細胞儀鑑定細胞表面抗原發現，本發明的間充質幹細胞CD45(-)，CD44(+)(-)，參見圖4；CD117(-)，CD147(+)，參見圖5；CD34(-)，CD147(+)，參見圖6；(-)為表面抗原陰性，(+)為表面抗原陽性。
本發明首次從軟骨中提取到表面標誌與文獻報導的骨髓來源的間充質幹細胞表面標誌基本一致的細胞群，並證明從軟骨中分離的細胞群不僅具有成脂、成骨的向中胚層分化的能力，而且具有成神經轉化的向外胚層分化的能力。與目前文獻報導的其他來源的間充質幹細胞相比，從軟骨中分離的細胞群具有細胞成分單一、純化的特點，便於研究及建立細胞系。
實施例6同實施例5，不同之處在於採用家兔妊娠中期胚胎四肢軟骨製備間充質幹細胞。
實驗例1幹細胞活性的鑑定方法如下MTT法測定幹細胞增殖將實施例1-4的幹細胞細胞濃度分別調至1×106，以無血清培養基分別製備上述實施例的單細胞懸液，按每孔1×104個細胞接種於96孔培養中，每孔體積為200μl，培養3天，接種細胞。每孔加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，孵育4小時。1000轉/分，離心5分鐘。棄培養板孔內上清。每孔加入150μl二甲基亞碸，震蕩15分鐘。酶聯免役檢測儀測定0D570，實施例1-4的實驗結果都表明幹細胞出現明顯增殖，說明所製備的幹細胞具有活性。
實驗例2本實驗例涉及幹細胞向肝細胞轉化活性的鑑定採用免疫組化法檢查幹細胞是否向肝細胞轉化取細胞塗片，丙酮固定10分鐘。加稀釋一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)，37℃下放置40分鐘，PBS緩衝液洗3次，每次3分鐘。加FITC標記的二抗(1∶50稀釋)，37℃條件下保存40分鐘。PBS洗3次每次3分鐘。緩衝甘油封片，螢光顯微鏡下檢查。實驗結果表明人幹細胞增殖及向肝細胞轉化。
實驗例3本實驗例涉及臍帶血來源的幹細胞對於肝臟損傷的修復。
裸鼠肝損傷模型造膜以40％CCl4橄欖油，0.3ml/100g，2次/周，皮下注射，6周製成肝纖維化模型。免疫磁珠陽性篩選獲得實驗所需臍帶血CD34+細胞，並建立細胞藥物篩選平臺。
依實驗分組情況進行實驗，CD34+細胞用Hoechest33342、PKH26雙標，尾靜脈注射促肝細胞生長因子(市售產品)，首次因子劑量加倍，以後每天皮下注射追加促肝細胞生長因子。定期處死動物，取肝、脾，製成冰凍切片、石蠟切片。以紫外螢光顯微成像、雷射共聚焦細胞儀，進行細胞形態學鑑定。參見圖1-3。
以PCR技術進行細胞人源性檢測。提取組織中的DNA，用PCR的方法特異性的擴增人Alu序列，用於區分人和鼠的細胞。設立人肝陽性對照、鼠肝陰性對照。PCR步驟1mm3大小的組織塊置於EP管中，加25μl 1×TE緩衝液，搗碎組織塊，取1μl組織漿置於PCR反應管中，加基因釋放劑20μl，振蕩10-30秒，加一層石蠟油，置微波爐中加熱5-7分鐘，置預調至80-90度的擴增儀上，分別按要求加入引物、Mg2+、dNTP、ddH2O、TaqDNA聚合酶，進行反應。反應結束後，進行2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增條帶。如果PCR擴增有陽性結果，可進一步通過用人Alu序列的核酸探針進行原位雜交鑑定。CD34+CD38+雙標，Confolcal檢測進行細胞造血幹細胞性質檢測。
採用免疫組化方法進行肝性化檢測，設立人肝陽性對照、鼠肝陰性對照。免疫組化步驟載玻片酸洗、預處理、石蠟切片處理、冰凍切片處理。染色步驟3％H2O2室溫孵育5～10分鐘，以消除內源性過氧化物酶活性，蒸餾水衝洗，PBS浸泡5分鐘。飽和處理內源性生物素，將切片浸入25μg/ml親和素溶液中15分鐘，PBS清洗15分鐘後即可染色。蛋白酶消化或抗原修復，具體按要求進行。5-10％正常二抗來源的動物血清封閉(PBS稀釋)，室溫孵育10分鐘，傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗工作液，37度孵育1-2小時或4度過夜。(置溼盒中)PBS衝洗，5分鐘3次。滴加適當比例稀釋的生物素標記的二抗(1％BSA-PBS稀釋)，37度孵育10-30分鐘。PBS衝洗，5分鐘3次。滴加適當比例稀釋的LRP標記的鏈黴卵白素(PBS稀釋)，37度孵育10-30分鐘，PBS衝洗，5分鐘3次。顯色劑顯色(DAB或AEC)，自來水充分衝洗，復染(蘇木素)，正常羊血清封片，觀察。
上述結果表明，所製備的幹細胞可以用於治療、修復病變或失去功能的組織或器官。
權利要求
1.一種幹細胞，是以人或其他哺乳動物的胚胎、臍帶血、脊髓組織為原料，通過免疫磁珠陽性篩選製備的。
2.根據權利要求1所述的一種幹細胞，其製備方法包括如下步驟1)將原料稀釋得到稀釋液；2)單核細胞的獲得；3)免疫磁珠陽性篩選。
3.根據權利要求2所述的一種幹細胞，其中步驟1)中的原料稀釋為以20ml枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩衝溶液稀釋臍帶血或脊髓塊等，得到臍帶血或脊髓稀釋液；緩衝溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4；或將人或其他哺乳動物的胚胎勻漿後稀釋。
4.根據權利要求2所述的一種幹細胞，其中步驟2)中通過下述方法獲得單核細胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll將脊髓或胚胎稀釋液分層，4℃ 800g離心30分鐘，收集界面層後，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，得到脊髓單核細胞收集界面層。
5.根據權利要求4所述的一種幹細胞，上還包括採用流式細胞儀分選幹細胞。
6.根據權利要求2所述的一種幹細胞，其中步驟2)中通過下述方法獲得單核細胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll將臍帶血稀釋液分層，4℃ 800g離心30分鐘，收集界面層後，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，將棄上清後的沉澱物用紅細胞裂解液4℃下裂解10分鐘，用PBS緩衝液洗滌細胞，300g離心20分鐘，採用流式細胞儀分選幹細胞，得到臍帶血的單核細胞(MNC)。
7.根據權利要求2所述的一種幹細胞，步驟3)中的免疫磁珠陽性篩選為Dynabeads M-450 CD34洗滌，置於磁板(MPC)1分鐘，棄清液，PBS緩衝液洗滌2次，混合磁珠(MACS，Miltenyi公司產品)和臍帶血的單核細胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分鐘，陽性篩選CD34+細胞；玫瑰花環狀細胞一磁珠重新懸起，置於磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重複3次，得玫瑰花環狀細胞—磁珠，懸於100μl PBS緩衝液；Detachabead CD34解離細胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩衝液，混勻，置於磁板(MPC)2分鐘，收集細胞清液，重複3次，匯集細胞清液，置於MPC 2分鐘，除去殘留磁珠，將細胞清液移入錐形試管；離心、洗滌2次，細胞計數，流式細胞儀FACS檢測。其中MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl；
8.一種幹細胞，通過下述方法製備取人或其他哺乳動物的軟骨，通過胰蛋白酶、膠原蛋白酶消化、在培養基中培養，傳代，得到的間充質幹細胞。
9.根據權利要求8所述的一種幹細胞，通過下述方法製備胚胎進行常規的無菌消毒，充分暴露四肢的關節軟骨後將其切取，去除關節軟骨表面的軟骨膜等成分，用PBS反覆衝洗乾淨，用剪刀剪切軟骨至不大於1立方釐米大小，37℃水浴中按照軟骨與胰蛋白酶1∶5的比例，用0.25％胰蛋白酶消化30分鐘，去胰蛋白酶後，按照軟骨與胰蛋白酶1∶5的比例加入含有血清的0.2％II型膠原蛋白酶酶，37℃水浴中攪拌消化90分鐘後，過篩，用冷的hanks緩衝溶液充分洗滌5次，至細胞沉澱明顯，種於75cm2培養瓶中，培養基為10ml IMDM(Hyclone公司產品，ISCOVE』S MODIFIED DUIBECLO』S MEDIUM的縮寫)+1ml 10％胎牛血清+2.5umol/L兩性黴素B+雙抗(100μg/ml青黴素+100μ/ml鏈黴素)；當細胞長至80％～90％融合時，按照1∶3的比例加入0.25％胰酶-1mmol/L EDTA常規消化，以1∶3(1瓶傳3代)比例傳代，液氮凍存。
全文摘要
本發明涉及一種來源於人類胚胎、臍帶血、脊髓的幹細胞、其製備方法及其在治療、修復失去功能的器官或病變組織中的應用，通過免疫磁珠陽性篩選製備幹細胞，經MNC細胞獲取、CD34抗體標記、流式細胞儀分選及細胞接種分離幹細胞，以MTT法測定幹細胞增殖，免疫組化法檢查幹細胞是否向肝細胞轉化。所製備的幹細胞經誘導可定向轉化，用於治療、修復失去功能的器官或病變組織、各種疾病以及進行細胞藥物的篩選。
文檔編號C12N5/0786GK1397640SQ02123638
公開日2003年2月19日 申請日期2002年7月2日 優先權日2001年7月2日
發明者韓梅, 王寧, 李凌松 申請人:北京北醫基因科技投資有限公司