一種厭氧生產脂肽表面活性劑的方法及發酵培養基與流程
2023-04-30 17:17:26
本發明屬於微生物採油和發酵生產領域，具體地說，它涉及一種厭氧生產脂肽表面活性劑的方法及發酵培養基。
背景技術：
脂肽是由芽孢桿菌屬的細菌代謝合成的一種生物表面活性劑，具有表面活性高、臨界膠束濃度低，安全無毒、可生物降解等優勢，因而在微生物採油、環境汙染修復、植物生防控制等技術領域有重要的應用潛力。目前很多研究集中在好氧條件下生產脂肽表面活性劑，但對脂肽在在厭氧條件下的生產還缺少研究。
微生物採油技術具有驅油潛力大、工藝簡便、成本低、環境友好、採出液不需特殊處理等優勢，有望成為未來油田開發後期穩油控水、提高採收率的主力技術。當前，油田在利用脂肽表面活性劑提高採收率的技術中，大都採用地上發酵生產脂肽，然後再注入油藏；然而地上建廠、發酵設備的運行與維護以及產品運輸的成本較高，不適合作為低油價運行機制下的石油開採方式。油藏是一個缺氧環境，通過油藏注空氣進行油藏地下有氧發酵又會增加開採成本。如果產脂肽的芽孢桿菌能在油藏缺氧條件下合成脂肽表面活性劑，實現油藏原位驅油將具有重要的應用前景。因此，獲得一種厭氧生產脂肽表面活性劑的方法，將能夠解決上述瓶頸問題。
在脂肽表面活性劑的發酵生產過程中，當發酵液中含有較高濃度的脂肽表面活性劑時，經過通氣、攪拌，常常會產生大量較穩定的泡沫。泡沫問題一直困擾著脂肽的發酵生產，同時，通氣、攪拌等工藝也會增加脂肽的發酵生產成本。然而，厭氧發酵生產過程中，不需要通氣，也就不會產生嚴重的泡沫問題。因此，發明一種厭氧生產脂肽表面活性劑的方法，在脂肽的發酵生產領域將具有重要的應用價值。
技術實現要素：
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為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種厭氧生產脂肽表面活性劑的方法及其應用。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為：
一種厭氧生產脂肽表面活性劑的方法，包括以下步驟：1)按照常規方法配製含NaNO3為唯一氮源，含蔗糖、甘油或者可溶性澱粉為唯一碳源的發酵培養基；2)將產脂肽表面活性劑的芽孢桿菌接種至LB培養基中培養至對數生長後期，製備種子液；3)將上述種子液接種至含發酵培養基的厭氧培養體系(如厭氧瓶、厭氧發酵罐)中，在適宜溫度下厭氧生產脂肽，培養結束後定性和定量分析厭氧發酵液中的脂肽表面活性劑。
發酵培養基中以NaNO3為唯一氮源，選擇蔗糖、甘油或可溶性澱粉中的任何一種作為唯一碳源時，能夠滿足一些芽孢桿菌厭氧生產脂肽。發酵培養基按質量分數為：蔗糖2-4％(或甘油3-5％，或可溶性澱粉2-4％)，NaNO3 0.1-0.3％，K2HPO4·3H2O 0.3-0.5％，KH2PO4 0.2-0.4％，MgSO4·7H2O 0.03-0.05％，CaCl2 0.01-0.02％；餘量為水，pH 6.5-7.0。
產脂肽的芽孢桿菌包括地衣芽孢桿菌，但不限於地衣芽孢桿菌。取產脂肽的芽孢桿菌(如地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis ATCC39307)的斜面菌種1-2接種環，接種到100ml的LB培養基中，在37℃、160-200rpm/min下，好氧培養8-12小時，至OD600值為0.5-0.8，即得到培養至對數生長後期的種子液，菌數為103-105個/ml。
將產脂肽菌種的種子液接種至發酵培養基的厭氧培養體系(如厭氧瓶、厭氧發酵罐)中，在35-39℃下，厭氧培養10-15天，厭氧生產脂肽表面活性劑。種子液與發酵培養基的體積比為3-6:100。
利用氯仿/甲醇(2:1，v/v)萃取法提取厭氧發酵液中的脂肽，提取方法為：取厭氧發酵液，離心除菌體，調節上清液pH值至2.0，於4℃過夜放置；然後利用等體積的氯仿/甲醇(2:1，v/v)混合物進行萃取，萃取的下層有機相進行真空旋轉蒸發(45℃，50rpm)，得到厭氧條件下生產的脂肽產物。
本發明可對於脂肽進行薄層色譜法定性分析；利用排油圈直徑法定量厭氧發酵液中的脂肽。
對產物進行薄層色譜法定性分析，在茚三酮顯色劑下，產物顯示紫色，表明為脂肽。
利用排油圈直徑法定量厭氧發酵液中的脂肽。利用提取到的脂肽產物配製一系列濃度(0-1000mg/l)的脂肽標準品溶液；將直徑為90mm的培養皿放到坐標紙上，加入30ml蒸餾水，再在培養皿中水面的中央滴20μl的原油(粘度低於20mPa·s)，在水面上形成一層油膜；取10μl的脂肽標準品溶液滴到油膜中央，記錄排油圈直徑，並製備排油圈直徑與脂肽濃度間的標準曲線(見附圖1)。取2ml厭氧發酵液在5000rpm條件下離心10min後得上清液；按照上述排油圈方法，測定獲得相應的排油圈直徑，根據標準曲線得到待測樣品中脂肽的質量濃度。
所述厭氧生產脂肽表面活性劑的方法使得一部分芽孢桿菌實現了厭氧產脂肽，在厭氧培養的8-10天，脂肽表面活性劑產量大於100mg/L，厭氧發酵液對原油的乳化活性大於60％，表面張力低於32mN/m。在物理模擬巖心驅油實驗中，利用本發明方法在缺氧的巖心環境中原位生產脂肽表面活性劑，提高的原油採收率高於5.0％。物理模擬巖心驅油實驗評價方法如下：1)依次對巖心進行稱重、抽真空、飽和水，測定孔隙體積(PV)、飽和油、老化等處理；2)進行一次水驅至巖心出口端採出液的含水率99％以上，計算一次水驅採收率；3)向巖心中注入產脂肽的芽孢桿菌種子液及發酵培養基的混合液，注入體積0.3PV-0.5PV，封閉巖心兩端，在模擬油藏溫度下培養一個月；4)進行二次水驅至巖心出口端採出液的含水率99％以上，計算二次水驅採收率；5)實驗數據處理，計算巖心中原位產脂肽表面活性劑所提高的原油採收率。
所述的厭氧生產脂肽表面活性劑的方法可以應用於微生物採油和脂肽的發酵生產領域。
本發明的有益效果：
本發明使得一部分芽孢桿菌實現了在厭氧條件下生產脂肽，避免了好氧發酵過程中的諸多不利因素。利用本發明方法，不需要空氣的注入，可以實現在缺氧的油藏環境中原位生產脂肽表面活性劑，提高的原油採收率，減少基礎設施和生產設備費用、降低採油成本。
附圖說明
圖1為排油圈直徑法定量分析發酵液中脂肽含量的標準曲線。
具體實施方式
結合下述具體實施例對本發明進行詳細的說明，使本領域的普通技術人員更全面的理解本發明，但不以任何方式限制本發明。在如下實施例中，如無特殊說明，所用的材料和試劑均可從生化試劑公司購買獲得；除特殊說明的方法外，所用試驗方法均為實驗室常規實驗方法。
在如下實施例中，選擇菌株Bacillus licheniformis ATCC39307作為示例菌株，來研究和驗證本發明的厭氧生產脂肽表面活性劑的方法和應用。
產脂肽的芽孢桿菌(產脂肽的芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis ATCC39307)的斜面菌種2接種環，接種到100ml的LB培養基中，在37℃、180rpm/min下，好氧培養8-12小時，至OD600值為0.7，即得到培養至對數生長後期的種子液，菌數為104個/ml。
實施例1：厭氧產脂肽的碳源篩選
以NaNO3為唯一氮源，硝酸鹽可以作為菌種厭氧生長代謝所需要的電子受體，篩選能夠促使產脂肽芽孢桿菌在厭氧條件下生產脂肽的碳源。所考察的9種碳源包括葡萄糖、蔗糖、糖蜜、大豆油、橄欖油、原油、甘油、玉米漿粉、可溶性澱粉。實驗中的基礎培養基按質量分數為：蔗糖3％，NaNO3 0.2％，K2HPO4·3H2O 0.4％，KH2PO4 0.35％，MgSO4·7H2O 0.06％，CaCl2 0.01％，餘量為水；pH 6.8。分別以所考察的9種碳源替換基礎培養基中的蔗糖，來製備9種培養基。為了除掉培養基中的溶解氧，將配製好的培養基加熱至煮沸狀態，保持約15min。在高純氮氣的保護下，將培養基分裝到相應的厭氧管中，塞好橡膠塞，再擰緊蓋子，置於高壓蒸汽滅菌鍋中，115℃下滅菌處理30min。待培養基冷卻至室溫後，接種培養基體積3％的菌株ATCC 39307的種子液(菌數為104個/ml)，至於37℃下，培養12天，用於厭氧發酵生產脂肽。
培養結束後，利用全自動表面張力儀BZY-1測定厭氧發酵液上清液(5000rpm，10min)的表面張力；以原油(粘度小於20mPa·s)為油膜，測定厭氧發酵液的排油圈直徑。
結果表明，在以蔗糖、甘油、可溶性澱粉3種底物為碳源時，厭氧發酵液的表面張力能夠降低到32mN/m以下，且排油圈直徑大於15mm。說明在NaNO3作為唯一氮源的條件下，以蔗糖、甘油、可溶性澱粉3種碳源中的任何一種為唯一碳源，均能夠促使產脂肽芽孢桿菌在厭氧條件下生產脂肽。其餘6中碳源的厭氧發酵液的表面張力均高於50mN/m，排油圈直徑小於5mm；表明了其餘6種碳源不能滿足產脂肽芽孢桿菌在厭氧條件下生產脂肽。
實施例2：厭氧發酵液中脂肽的提取以及定性與定量分析
厭氧發酵液的製備對應於實施例1中的蔗糖為碳源。
1)脂肽的提取：利用氯仿/甲醇(2:1，v/v)萃取法提取厭氧發酵液中的脂肽。取厭氧發酵液，離心除菌體，用6mol/L的HCl調節上清液pH值至2.0，於4℃過夜放置；然後利用等體積的氯仿/甲醇(2:1，v/v)混合物進行萃取，萃取的下層有機相進行真空旋轉蒸發(45℃，50rpm)，真空冷凍乾燥後，得到厭氧條件下生產的脂肽產物。
2)薄層色譜法定性分析：將提取的脂肽產物溶於二氯甲烷中，將樣品點在矽膠板上，在氯仿：乙酸＝8:2(v/v)的展開劑中展開，用顯色劑進行顯色。在茚三酮顯色劑下，產物顯示紫色，表明為脂肽。
3)定量分析：利用排油圈直徑法測定發酵液中脂肽表面活性劑的含量。稱取250mg脂肽提取物溶於蒸餾水，定容至250ml，得到質量濃度1000mg/l的脂肽溶液。配製一系列濃度(0-1000mg/l)的脂肽溶液，分別取5.0ml，10.0ml，15.0ml，20.0ml，25.0ml，30.0ml，35.0ml，40.0ml，45.0ml濃度為1000mg/l的脂肽溶液，至蒸餾水中定容至50ml；得到質量濃度分別為100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000mg/l的脂肽標準品溶液。
將直徑為90mm的培養皿放到坐標紙上，加入30ml蒸餾水，再在培養皿中水面的中央滴20μl的原油(粘度低於20mPa·s)，在水面上形成一層油膜；取10μl的脂肽標準品溶液滴到油膜中央，記錄排油圈直徑，並製備排油圈直徑與脂肽濃度間的標準曲線(見附圖1)。
取2ml的厭氧發酵液在5000rpm條件下離心10min後得上清液；按照上述排油圈方法，測定獲得相應的排油圈直徑；根據標準曲線得到厭氧發酵液中脂肽的質量濃度。
實施例3：在厭氧瓶中發酵生產脂肽表面活性劑
1)實驗中的所用的發酵培養基按質量分數為：蔗糖3％，NaNO3 0.2％，K2HPO4·3H2O 0.4％，KH2PO4 0.35％，MgSO4·7H2O 0.06％，CaCl2 0.01％，餘量為水；pH 6.8。
2)厭氧培養基製備方法如下：將上述配製好的培養基煮沸約15min；然後在高純氮氣保護下，將200ml培養基分裝到250ml的厭氧瓶中；115℃，滅菌30min；培養基冷卻至室溫後，注入過濾除菌的2.5％(w/v，g/ml)Na2S·9H2O還原劑至終質量濃度0.02％，去除殘餘氧。
3)發酵條件：菌株體積接種量為5％，在37℃、80rpm下，厭氧培養10天。
在厭氧瓶培養條件下，菌株ATCC 39307的脂肽表面活性劑的產量為143.5±9.7mg/l。
實施例4：實施例3獲得的含脂肽厭氧發酵液的表面活性與乳化活性分析
菌株ATCC 39307在裝有200ml發酵培養基的厭氧瓶中，於37℃、80rpm/min條件下，厭氧培養10天，對厭氧發酵液的乳化活性和表面活性進行分析評價。培養結束後，取厭氧發酵液在5000rpm條件下離心10min去除菌體，得上清液。
取12ml厭氧發酵液的上清液，利用全自動表面張力儀BZY-1，測定表面張力，以蒸餾水為對照。
乳化活性以乳化係數EI24來表徵，EI24即乳化層高度與混合液總高度的百分比值。乳化活性的測定方法如下：取一支10ml的帶刻度試管，加3ml的原油和3ml的厭氧發酵液上清液；在微型漩渦混合儀上，振蕩2min；於40℃下，靜置24h後，計算乳化係數EI24。
上述厭氧發酵液的表面張力低於32mN/m，而相同測定條件下蒸餾水的表面張力為72.1mN/m。厭氧發酵液對原油的乳化活性大於60％，展現出了乳化分散原油提高採收率的應用價值。
實施例5：厭氧產脂肽的物理模擬巖心驅油評價：
實驗中所用巖心為人造膠結巖心(巖心處於處於一個帶有進口和出口的密閉腔室中)，所用原油為某油田採油二廠的脫水脫氣原油，飽和水和驅替水均為某油田採油二廠的油藏注入水。
1)實驗中巖心的處理：對巖心進行稱重，設置好巖心的進口端和出口端；對巖心進行抽真空與飽和水處理，對飽和水後的巖心進行第二次稱重，根據兩次稱重的差值計算得到孔隙體積(PV)為67.1mL。然後對巖心進行飽和原油處理，當巖心出口端出油20mL以上時，即認為飽和油過程結束；將巖心放在模擬油藏溫度(39℃)下進行老化處理24h。
2)一次水驅採油：用平流泵對巖心進行一次水驅處理，巖心出口端放置一個100ml量筒，平流泵流速為0.5ml/min，當巖心出口端採出液含水率99％以上時，即認為一次水驅過程結束，計算一次水驅後的採收率為48.7％。
3)微生物菌液的注入：用平流泵向巖心中注入產脂肽芽孢桿菌的種子液及發酵培養基的混合液，注入體積為0.5PV，封閉巖心兩端，將巖心放置在模擬油藏溫度(39℃恆溫培養箱)下培養一個月。
4)二次水驅：水驅至巖心出口端採出液的含水率99％以上，計算二次水驅後的總採收率54.1％。
5)實驗數據處理：根據一次水驅後採收率48.7％和二次水驅後的總採收率54.1％，計算得到厭氧產脂肽培養基在巖心中作為營養激活劑所提高的原油採收率為5.4％。
在模擬油藏溫度培養的過程中，菌株厭氧產生脂肽表面活性劑，動用原油，從而在一次水驅基礎上提高原油採收率達5個百分點。本發明的厭氧生產脂肽表面活性劑的方法在微生物採油領域具有重要的推廣和應用價值。