用於測量存在於生物學流體樣品中的微顆粒的纖溶酶活性的方法及用途的製作方法

2023-04-30 17:23:26 1

專利名稱：：用於測量存在於生物學流體樣品中的微顆粒的纖溶酶活性的方法及用途的製作方法用於測量存在於生物學流體樣品中的微顆粒的纖溶酶活性的方法及用途本發明的目標在於用於測量存在於生物學流體，特別是處於流動狀況下的生物學流體的樣品中，或者存在於組織提取物中的微顆粒，特別是循環微顆粒的纖溶酶活性的方法，所述方法可以用作診斷方法或用作對治療進行追蹤的方法。由於細胞膜的出芽而導致的微顆粒已經在各種細胞模型中和在許多病理狀態中被描述為細胞的激活和/或凋亡的可靠標誌物。具體而言，本發明人最初描述了，內皮細胞響應於炎性刺激而釋放這些微顆粒，以及在呈現出血栓形成風險的患者中內皮循環微顆粒的量增加。此後，在不同的病理狀態例如冠狀動脈症候群，腎功能不全，糖尿病，抗磷脂症候群(APLS)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP)或鐮狀細胞病，其中微顆粒的存在反映了內皮功能障礙並且為預後不良的指示的病症之中描述了升高的內皮循環微顆粒的水平。因為^:顆粒表達來源於它們所源自的細胞的各種生物活性組分，所以它們可以呈現出廣泛範圍的生物學活性，所述生物活性能夠調節內皮細胞或血細胞的功能，影響血管的內環境穩定，和參與炎症反應或血管發生。例如，微顆粒，特別是循環微顆粒，呈現出在凝血因子的裝配和激活中所牽涉的促凝血磷脂表面。同樣地，微顆粒特別是循環微顆粒參與凝血酶的產生是由於它們在血管腔隙中表達、轉移或誘導組織因子的能力而引起的。在止血平衡的主要調節劑中，纖溶酶原激活系統是用於溶解纖維蛋白凝塊的主要生理學途徑。這個途徑還通過幫助細胞外基質的組分的蛋白水解而促進血管發生。纖溶酶原向活性纖溶酶的轉化依賴於兩種絲氨酸蛋白酶組織纖溶酶原激活物(t-PA:組織型纖溶酶原激活物)，其在血管中主要牽涉纖維蛋白溶解；和尿激酶(u-PA:尿激酶型纖溶酶原激活物)，其通過與其特異性受體uPAR結合而牽涉細胞外周蛋白水解。由uPA所誘導的纖溶酶產生和由此導致的基質金屬蛋白酶(MMP)的激活有助於細胞穿過間質基質的遷移，並且參與諸如組織重塑、轉移性侵襲和血管發生的過程。纖溶酶原的不受控制的和/或過度的激活可能通過誘導細胞脫離和/或細胞凋亡而具有有害的後果。因此，意識到，調節在細胞特別是內皮細胞的表面上纖溶酶的表達在血管內環境穩定的調節中具有至關重要的重要性。因此，通過閱讀上文，可以意識到在下列方面的益處一方面能夠評估在生物學流體中，特別是在處於流動狀況下的生物學流體，非常特別是血液中，或者在組織提取物中，微顆粒，特別是循環顆粒的"纖溶酶活性"的產生；和另一方面能夠調節這種活性。"生物學流體，，意指任何可提取的體液，包括例如血液、腦脊液(CSF)、支氣管肺泡液(BAF)、尿液、滑液、母乳、唾液、淚液、精液、腹水、胸腔積液、羊膜液。"處於流動狀況下的生物學流體"意指天然地在身體內或在身體外流動的任何體液，包括例如循環血液、母乳、尿液、唾液、淚液、精液、月經流出物和任何其他漿液性和/或粘液性流出物。在組織提取物的來源中，可以提及動脈粥樣化斑塊或任何其他通過外科手術獲得的組織。在本文中，術語"纖溶酶活性"應當理解為包含微顆粒(特別是循環微顆粒)的生物學流體(特別是處於流動狀況下的生物學流體)的樣品產生纖溶酶的能力，無論應用何種機制。作為診斷方法，在包含微顆粒(特別是循環微顆粒)的生物學流體樣品中測量"測試樣品的纖溶酶活性"的值，並且與在獲自被稱為"正常"(即不呈現病理學狀況)的個體的對照樣品中這一相同能力的測量相比較，如果其顯著大於對照的纖溶酶活性值，那麼將會反映，例如但不限於，對於個體來說具有或多或少升高的例如遭受由於增加的動脈粥樣化斑塊的不穩定性而引起的血管意外的風險，對於患有癌症的個體來說具有或多或少升高的遭受轉移性侵襲的風險，或者對於個體來說具有或多或少升高的遭受腦血管意外及其對於大腦功能的有害後果的風險。如果"測試樣品的纖溶酶活性"的這個值小於對照的纖溶酶活性值，那麼它將會例如反映對於其血液進行了測試的個體來說具有增加的血栓形成風險。作為治療的追蹤，在來自正進行治療的個體的生物學流體樣品(特別是處於流動狀況下的生物學流體)的微顆粒(特別是循環微顆粒)中測量"測試樣品的纖溶酶活性"的值，並且與在治療前或在治療早期獲自同一個體的對照樣品中這一相同能力的測量相比較，所述"測試樣品的纖溶酶活性"的值使得能夠追蹤所述個體根據施用給其的治療所作出的應答的演變。然而，依然存在有對於下列方面的需要即用於患者所承受的與其血液的太強或太弱的纖溶酶活性相關的風險的簡單、有效且可靠的測試，或者用於追蹤治療(其旨在調節個體的生物學流體(特別是處於流動狀況下的生物學流體)的微顆粒(特別是循環微顆粒)的纖溶酶活性)的演變的簡單測試。提供此類測試是本發明的目的之一。事實上，在長期工作後，令人驚訝地，本發明人以其知識首次顯示，存在於個體的生物學流體，特別是處於流動狀況下的生物學流體，特別是血液中的循環微顆粒具有賦予它們產生纖溶酶的能力的生物學活性。基於該發現，本發明的目標在於用於測量事先抽取的生物學流體(特別是處於流動狀況下的生物學流體，特別是血液)的樣品的微顆粒(特別是循環微顆粒)的纖溶酶活性的方法，其中-在第一步驟中，分離出存在於所述樣品中的微顆粒，特別是循環微顆粒，-在第二步驟中，通過任何合適的方式來測量在步驟1中分離出的所述微顆粒產生纖溶酶的能力，和-在第三步驟中，將在步驟2中獲得的測量結果與在相同條件下對於對照相同生物學流體的樣品所進行的相同測量的結果相比較。根據本發明的一種變化形式，所述對照相同生物學流體可以為與所測試的生物學流體相同但來源於至少一個祐^人為健康(即不呈現病理學狀況，至少不呈現其生物學流體被測試的個體所遭受的病理學狀況)的個體的生物學流體，從而使得能夠就被認為正常的值而言來評估所述個體的風險。根據本發明的另一種變化形式，所述對照相同生物學流體可以為與所測試的生物學流體相同、來源於同一個體但在提供了測試樣品的那次取樣之前例如在治療開始前的取樣中獲得的生物學流體，以便能夠建立對於例如在治療過程中微顆粒產生纖溶酶的能力的演變的追蹤。根據本發明，該方法的第一步驟(分離出存在於樣品中的微顆粒，特別是循環微顆粒)可以根據與此類微顆粒的分離相容的任何程序來進行。例如，可以提及高速離心或者生物捕獲技術，不論捕獲支持物是什麼(例如，抗體，例如膜聯蛋白V的抗體)。依照根據本發明的方法的第一步驟的一種優選的變化形式，微顆粒(特別是循環微顆粒)可以通過在這樣的程序中的一系列離心和超速離心來進行分離，根椐所述程序，-在步驟1A中，在2-6'C，優選地3-5。C的溫度下，以1000g-MOOg，優選地1200g-1800g的速度，使體積為500jil-5ml，優選地1ml-2ml的事先抽取的生物學流體，特別是處於流動狀況下的生物學流體，例如血液的樣品離心5分鐘-20分鐘，優選地10-15分鐘的時間；-在步驟1B中，在2-6。C，優選地3-5。C的溫度下，以10000g-20000g，優選地12000g-15000g的速度，使在步驟1A中獲得的上清液離心1分鐘-5分鐘，優選地2-3分鐘的時間；-在步驟1C中，在2-6。C，優選地3-5"C的溫度下，以1500010g-25000g，優選地18000g-22000g的速度，使在步驟IB中獲得的上清液離心45-120分鐘，優選地60-100分鐘的時間；-在步驟ID中，將在步驟1C中獲得的粒狀沉澱接納在體積為250jal-4ml，優選地1-2ml的磷酸緩沖鹽水(PBS)中，並且在2-6。C，優選地3-5。C的溫度下，以15000g-25000g，優選地18000g-22000g的速度，使該混合物離心45-120分鐘，優選地60-100分鐘的時間；-在步驟1E中，將在步驟1D中獲得的粒狀沉澱接納在體積為2504ml，優選地1-2ml的磷酸緩沖鹽水(PBS)中，並且在2-6。C，優選地3-5。C的溫度下，以15000g-25000g，優選地18000g-22000g的速度，4吏該混合物離心45-120分鐘，優選地60-100分鐘的時間；-在步驟1F中，將在步驟1E中獲得的粒狀沉澱接納在體積為20pl-500pl，優選地50-100pl的磷酸緩衝鹽水(PBS)中。在步驟1F中獲得的微顆粒(特別是循環微顆粒)的懸浮液可以立即用於分析，或者可以優選地貯存於-80。C。根據本發明，該方法的第二步驟(測量微顆粒，特別是循環微顆粒產生纖溶酶的能力)可以直接對於在第一步驟結束時獲得的微顆粒的量來進行。優選地，根據本發明，該方法的笫二步驟可以對於在第一步驟結束時獲得的微顆粒的確定的量來進行，所述量可以為10000-100000G個微顆粒，優選地100000-300000個微顆粒。在這種情況下，根據本發明的方法可以包括對在第一步驟結束時獲得的微顆粒進行計數的另外步驟(步驟lbis)，所述計數步驟在根據本發明的方法的第一步驟和第二步驟之間發生。根椐本發明，所述計數步驟可以根據任何已知的微顆粒計數方法來進4亍。有利地，微顆粒的計數可以通過流式細胞術來進行，其中根據在現有技術中常規使用的方案，例如在法國專利申請FR-A-2795820中所描述的那些，或者通過基於微顆粒的促凝血活性的檢測測試(ZymuphenMP-activity,HyphenBioMed)或蛋白質含量測定來進行。優選地，根據本發明，通過流式細胞術來對微顆粒進行計數。根據本發明，該方法的第二步驟，即在步驟1中分離出的所述微顆粒(特別是循環微顆粒)產生纖溶酶的能力的測量，可以通過測量在所述微顆粒上自發存在的纖溶酶的量或者通過測量能夠由這些微顆粒產生的纖溶酶的量來進行測定。纖溶酶的所迷測量可以通過任何已知的方法來進行。依照根據本發明的方法的步驟2的一種變化形式，在微顆粒(特別是循環微顆粒)上自發存在的纖溶酶的量的測量可以通過任何已知的方法，例如使用抗纖溶酶(抗纖溶酶原)抗體(例如TC12040,Technoclone，Austria或產品3641,AmericanDUgnostica)的免疫學測量(FASEBJ2003，17:1301-3)(ELISA或Western印跡)，或者通過經由使用纖溶酶的選擇性生色底物(例如CBS0065,Stago)在405nm處讀取樣品的吸光度而施行的分光光度法來進行。依照根據本發明的方法的步驟2的另一種變化形式，能夠由微顆粒(特別是循環微顆粒)產生的纖溶酶的量的測量可以根據ThrombHaemost2004;92:1066-75中所描述的程序來進行，在所述程序中，-在步驟2-l中，向在根據本發明的方法的步驟1或步驟Ibis中獲得的微顆粒中，以0.10nM，優選地O.5jLiM-1^M的最終量添加纖溶酶原(有利地經純化的)，以及以0.50mM-1.0mM，優選地0.65mM-0.85mM的最終量添加纖溶酶的選擇性生色底物，例如由STAGO公司(France)銷售的(曱基-丙二醯基)-羥丙基精氨酸-對硝基苯胺((m"hyl-malonyl)-hydroxypropylarginine-p-nUroaniUde)(CBS0065);-在步驟2-2中，例如在乾燥箱中，使在步驟2-l中獲得的混合物在25。C-45°C，優選地30°C-40。C的溫度下溫育30分鐘-9Q分鐘，優選地50-70分4中的時間，和-在步驟2-3中，通過經由在405nM處讀取樣品的吸光度而施行的光度法來檢測能夠被產生的纖溶酶的量(例如，在96孔平板閱讀器例如DynexMR700微量培養板閱讀器中)。根據步驟2-1的一種變化形式，纖溶酶的選擇性底物可以為螢光底物，例如H-D-Val-Leu-Lys-7-氨基-4-甲基香豆素(Bachem，Bubendorf,Switzerland)或D-AFK-ANSNH-C4H9.2HB(HaematologicTechnologiesInc，VermontUSA)。根據步驟2-2的一種變化形式，將在步驟2-1中獲得的混合物放置在恆溫於37。C的平板閱讀器中，所迷平板閱讀器通過隨著時間測量在405nm處的吸光度來測量纖溶酶形成的動力學。根據本發明，該方法的第二步驟可以在與待施行的溫育和測量相容的任何支持物上進行。在這方面，可以提及圓底杯形器或平底杯形器，例如由聚苯乙烯或聚氯乙烯製成的48或96孔平板的杯形器。優選地，根據本發明的方法的步驟2在96孔平板的圓底杯形器或平底杯形器中進行。根據本發明，能夠由微顆粒(特別是循環微顆粒)產生的纖溶酶的量，或者在微顆粒(特別是循環微顆粒)上自發存在的纖溶酶的量的測量可以在25^1-150優選地50^1-100pl的終體積中進行，例如使用以1.0-3.0rag/ml，優選地1.5-2.5mg/ml的濃度添加有牛血清白蛋白(BSA)的辨酸緩沖鹽水(PBS)來進行調整。每孔中待測試的孩麼顆粒的數目可以為50000-400000個顆粒/孔，優選地100000-200000個顆粒/孔。有利地，當在圓底杯形器中進行測量時，終體積優選地為50而當在平底杯形器中進行測量時，終體積優選地為100pl。根據本發明，將結果表示為"產生的纖溶酶的量/微顆粒數目"。在生物學流體(特別是處於流動狀況下的生物學流體，非常特別是血液)的樣品中，所述微顆粒(特別是所述循環微顆粒)代表了微顆粒的總群體，關於這些微顆粒先前已知曉，它們起源於細胞出芽，並且它們可以源自許多不同的細胞類型。在這方面，可以提及源自內皮細胞、造血細胞的孩吏顆粒。因此，根據它們所源自的細胞類型，微顆粒(特別是循環微顆粒)將會具有對於它們所源自的細胞類型來說固有的特徵。在此基礎上，可以根據其起源來分離微顆粒，從而產生不同的單一類型微顆粒的群體。然而，僅對特定類型的微顆粒施行纖溶酶活性的測量可以是有好處的。因此，根據本發明的一個特別的實施方案，該方法還可以包括根據其起源來分離微顆粒的步驟lter。該步驟可以在根據本發明的方法的第一步驟之後進行，即在所述方法的步驟1或步驟lbis之後，優選地在步驟1之後且在步驟lbis之前。目的微顆粒的分離可以通過現有技術已知的任何方法來進行。在這方面，可以提及通過細胞計量術的細胞分選操作程序或者磁性免疫分離法。優選地，根據本發明，使用磁性免疫分離方法。依照根據本發明的方法的另外一種變化形式，可以將在步驟1中分離出的微顆粒固定在支持物上，在所述支持物上將會進行步驟2。微顆粒的固定可以根據現有技術已知的任何方法來進行，特別是在國際申i青W0-A-96/03655中所描述的那種。例如，可以通過^f吏用由於識別所述微顆粒的表面的成分而能夠固定微顆粒的化合物覆蓋支持物的表面，來製備在根據本發明的方法的步驟2中使用的支持物。在這方面，可以提及識別促凝血磷脂的膜聯蛋白V，或者對於膜的活性和/或功能性構象糖蛋白複合物GPIIb/GPIIIa特異的抗體，或者單核細胞或淋巴細胞的粘著受體LFA-1，或者內皮血栓調節蛋白，或者CD146。依照根據本發明的方法的另一種變化形式，可以使用聚陽離子例如聚-L-賴氨酸來固定微顆粒。本發明的目標還在於存在於生物學流體(特別是處於流動狀況下的生物學流體)的樣品中的微顆粒(特別是循環微顆粒)在用於測量生物學流體的所述樣品的纖溶酶活性的方法中，特別是在先前所描述的用於測量纖溶酶活性的方法中的用途。本發明的目標還在於存在於生物學流體(特別是處於流動狀況下的生物學流體)的樣品中的微顆粒(特別是循環微顆粒)在診斷方法中的用途，所述診斷方法在所述生物學流體所源自的個體中診斷-具有或多或少升高的遭受例如由於增加的動脈粥樣化斑塊的不穩定性而引起的血管意外的風險，或者-對於患有癌症的所述個體來說具有或多或少升高的遭受轉移性侵襲的風險，或者_對於所述個體來說具有或多或少升高的遭受腦血管意外、其出血性併發症或其對於大腦功能的後果的風險，-對於所述個體來說具有遭受血栓形成的風險，-對於所述個體來說具有或多或少升高的患其中由微顆粒所進行的纖溶酶產生^^皮增加的疾病的風險，所述疾病例如為纖維蛋白溶解過度或細胞外周蛋白水解。優選地，根據本發明，所述診斷方法為先前所描述的用於測量纖溶酶活性的方法。本發明的目標還在於存在於生物學流體(特別是處於流動狀況下的生物學流體)的樣品中的微顆粒(特別是循環微顆粒)在用於追蹤所述生物學流體所源自的個體對於治療所作出的應答的方法中的用途。優選地，根據本發明，所述用於對治療進行追蹤的方法為先前所描述的用於測量纖溶酶活性的方法。此外，本發明人已可以顯示，在生物學流體(特別是處於流動狀況下的生物學流體，例如血液)中所包含的、具有在本發明的意義內的纖溶酶活性的循環微顆粒(特別是源自內皮細胞的微顆粒)，對於失活(特別是對於由在生物學流體中存在的蛋白水解酶的抑制劑所導致的中和或抑制)具有很大的抗性。這種性質賦予所述循環微顆粒以這樣的能力，即經由生物學流體運輸纖溶酶活性穿過生物體直至纖溶酶的存在發揮其活性的地點，而沒有抑制風險，至少具有極大減少的抑制風險。在這方面已知，循環的天然纖溶酶在生物學流體中被快速抑制。因而，所述微顆粒可以被看作類似於纖溶酶活性的載體，這使得能夠考慮就這樣來使用它們(一旦經純化或半純化)。同樣地，攜帶組織因子的微顆粒在先天性出血性疾病例如血友病的治療中是潛在有用的(NatureMedicine2003，9:1020-1025)。根據本發明，"經純化或半純化"是表示，微顆粒在經歷了至少一個純化步驟後才進行使用。因此，本發明的目標在於經純化或半純化的源自內皮細胞的微顆粒(特別是循環微顆粒)作為纖溶酶活性的載體的用途。本發明的目標還在於經純化或半純化的微顆粒(特別是循環微顆粒，特別是源於內皮細胞的微顆粒)作為藥物，特別是具有蛋白水解或抗血栓形成活性的藥物的用途。通過閱讀下面的實施例(僅為了舉例說明而給出，而絲毫不限制本發明)後，本發明的其他特徵和優點將是顯而易見的。實施例實施例1:由處於培養中的內皮細胞的微顆粒所攜帶的纖溶酶活性的證明1-A:內皮細胞的微顆粒的製備將人微血管內皮系細胞HMEC-l(J.Invest.Dermatol.1992;99:683-90)在MCDB131培養基(InvitrogenLifeTechnologies,CergyPontoise，France)中培養至亞匯合，所述MCDB131培養基添加有10%不含微顆粒的胎牛血清(FCS)、10ng/ml重組人EGF(UpstateCel1SignalingSolutions,LakePlacid,NY，USA)和1|iig/ml氬化可的松(Sigma，StQuentinFallavier，France)。根據J.Clin.Invest.1999Jul;104(1):93-102中所描述的條件，從用100ng/mlTNF-oc(PeproTechInc，RockyHill，NJ，USA)刺激了48小時的HMEC-1細胞的培養基中純化出內皮微顆粒(EMP)。將培養物的上清液在4300g下離心5分鐘，以1更從中清除細胞和漂浮的細胞碎片。然後，將上清液於4。C在20000g下離心120分鐘。然後，EMP粒狀沉澱用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌2次，並重懸浮於PBS中。通過綴合至異硫氰酸螢光素(FITC)(Abcys，Paris,France)的膜聯蛋白V,來對EMP(稀釋至1/100)的懸浮液的10pi等分試樣進行標記。如先前在J.Thromb.Haemost.2004Oct;2(10):1842-3和法國專利申請FR-A-2795820中所描述的，通過流式細胞術來對EMP進行計數。1-B:EMP的固定根據物理化學吸附原理，使EMP固定在聚陽離子表面上。為此，將由PVC製成的96孔平板的圓底孔的壁和底部用25pg/ml聚-L-賴氨酸(Aldrich-Sigma)進行活化。然後，將不同濃度的在PBS中的EMP於4'C在事先經活化的孔中溫育過夜。然後，對所述孔進行洗滌，並且在纖溶酶產生的測試中使用經固定的EMP。1-C:纖溶酶產生的測試1-C-1:方案在由PVC製成的96圓底孔平板的孔中，將不同濃度的在添加有0.8%牛血清白蛋白的PBS(PBSA)中的EMP懸浮液與50pl的1pM纖溶酶原和0.75mM(曱基-丙二醯基)-羥丙基精氨酸-對硝基苯胺(CBS0065,Stago，AsnUres，France)(纖溶酶的選擇性生色底物)的混合物一起進行溫育。將相同體積的來自EMP的最後一次洗滌的上清液用作對照。將微量培養板放置在微量培養板閱讀器中，並且於3rc，使用對於閱讀多孔平板而言經適應調整的分光光度計(MX5000,Dynex)，通過測量隨著時間過去由於對硝基苯胺的釋放而產生的在405nm處的吸光度的變化，來在9小時內追蹤纖溶酶出現的動力學。1-C-2:結果這些測量的結果顯示在下表中EMP/50nLA405mn/分鐘10648.710512.95xl(T4.71041.61031.100.517tableseeoriginaldocumentpage18EACA:s-氨基己酸，纖溶酶原與MP結合的抑制劑1-D:米氏常數的測量l-D-1:對於處於懸浮狀態下的EMP的測量l-D-la:方案在由PVC製成的96圓底孔平板的孔中，在O.75mM(曱基-丙二醯基)-羥丙基精氨酸-對硝基苯胺(CBS0065,Stago，AsnUres，France)(纖溶酶的選擇性生色底物)存在下，在50jul的終體積中，將懸浮在添加有0.8%牛血清白蛋白的PBS(PBSA)中的2x105個EMP與不同濃度的纖溶酶原(0-5pM)—起進行溫育。將相同體積的來自BMP的最後一次洗滌的上清液用作對照。l-D-lb:結果這些測量的結果顯示在下表中tableseeoriginaldocumentpage18通過應用米-曼方程，這些結果使得能夠測定關於纖溶酶的特異產生的米氏常數Km=0.122—。l-D-2:對於固定的EMP的測量l-D-2a:方案如上文所指明的(l-B微顆粒的固定)，將微顆粒固定在孔中。根據與關於處於懸浮狀態下的EMP相同的方案，將纖溶酶原和生色底物添加至固定的樣t顆粒。在微量培養板閱讀器中，通過測量在405mn處的吸光度來檢測纖溶酶形成的動力學。這種變化形式使得能夠在檢測激活動力學後測量與固定的微顆粒結合的纖溶酶。為此，平板用PBSA進行洗滌，並且通過添加50p1/孔的0.325mMCBS0065並測量在405nm處的吸光度的變化來檢測與固定的微顆粒結合的纖溶酶。tableseeoriginaldocumentpage19這些結果表明，由^:顆粒進行的纖溶酶形成隨著添加至孔中的微顆粒的數目而變化，或者在固定濃度的微顆粒時隨著所添加的纖溶酶原的濃度而變化。這些結果還表明，微顆粒的這種效用是由於存在於微顆粒上的纖溶酶原激活物的存在而引起的。實施例2:在體內由微顆粒所攜帶的纖溶酶活性的證明2-A:方案從事先於呈現出具有血栓形成風險的自身免疫病理學狀況的個體中獲得的總血液樣品開始，根據下述方法分離出微顆粒+(步驟1A)在4。C的溫度下以1500g的速度4吏2ml所述血液樣品離心10分鐘；+(步驟IB)在4。C的溫度下以17500g的速度使在步驟1A中獲得的上清液離心2分鐘；+(步驟1C)在4'C的溫度下以17500g的速度使在步驟IB中獲得的上清液離心90分鐘；+(步驟ID)將在步驟1C中獲得的粒狀沉澱接納在1000pl磷酸緩衝鹽水(PBS)中，並且在4。C的溫度下以17500g的速度使該混合物離心90分4f;+(步驟IE)將在步驟ID中獲得的粒狀沉澱接納在1000pi磷酸緩衝鹽水(PBS)中，並且在4。C的溫度下以17500g的速度使該混合物離心90分4中；+(步驟IF)將在步驟IE中獲得的粒狀沉澱接納在50pi磷酸緩沖鹽水(PBS)中，以用於貯存和以後的使用。通過流式細胞術來對在步驟IF中如此獲得的微顆粒進行計數。在96孑L平板(VinylalphanumericU形底平板，Ref.2101，Thermo)的圓底杯形器中，在50pi的終體積(必要時，用以2mg/ml的終濃度添加有牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽水(PBS)進行調整)中，向事先獲得的並且保存於以2mg/ml的終濃度添加有牛血清白蛋白的PBS中的200000個微顆粒之中，以Q.5(或1)的終濃度添加經純化的纖溶酶原(Am6ricanDiag謂tica,Hyphen)和以0.75mM的終濃度添加CBS0065(STAGO)。在完成了在96孔平板中在50pi的終體積中向孩支顆粒之中添加纖溶酶原和生色底物後，將所述平板直接放置在恆溫於37。C的光度計(MX5000，Dynex)中，以便在4-8小時內隨著時間過去檢測在405頭處的吸光度的變化。在相同條件下平行地測量來源於沒有血栓形成風險的受試者的對照樣品的纖溶酶活性。相對於用各種不同濃度的纖溶酶(0-20nM)製作的參照曲線來計算由微顆粒產生的纖溶酶的量。2-B:結果20pAPAPAPAPAPA11.353.590.4131.5173.75211，521.861.0100.7141.05187.5220.930.770.6111.2151.8196.540.582.8129.05162.15200.85A:吸光度(405nm/分鐘)；P=患者2-C:結論這些結果表明，從呈現出自身免疫疾病的受試者的血漿開始而分離出的循環微顆粒如在體外測試的原型顆粒一樣產生纖溶酶。這些結果還表明，在體內產生的微顆粒的這種效用依賴於所添加的纖溶酶原的存在。權利要求1.用於測量事先抽取的生物學流體，特別是處於流動狀況下的生物學流體，非常特別是血液的樣品的微顆粒，特別是循環微顆粒的纖溶酶活性的方法，其中-在第一步驟中，分離出存在於所述樣品中的所述微顆粒，-在第二步驟中，通過任何合適的方式來測量在步驟1中分離出的所述微顆粒產生纖溶酶的能力，和-在第三步驟中，將在步驟2中獲得的測量結果與在相同條件下對於對照相同生物學流體的樣品所進行的相同測量的結果相比較。2.根據權利要求1的方法，其特徵在於，所述對照相同生物學流體為與所測試的生物學流體相同但來源於至少一個被認為健康的個體的生物學流體，或者與所測試的生物學流體相同、來源於同一個體但在提供了測試樣品的那次取樣之前例如在治療開始前的取樣中獲得的生物學流體。3.根據權利要求1或2中任一項的方法，其特徵在於，所述方法的第一步驟(分離出存在於樣品中的微顆粒，特別是循環微顆粒)根據這樣的程序來進行，在所述程序中，-在步驟1A中，在2-6。C，優選地3-5C的溫度下，以1000g-2000g，優選地1200g-1800g的速度，使體積為5005ml，優選地1m卜2ml的事先抽取的生物學流體，特別是處於流動狀況下的生物學流體，例如血液的樣品離心5分鐘-20分4中，優選地10-15分鐘的時間；-在步驟1B中，在2-6。C，優選地3-5。C的溫度下，以10000g-20000g，優選地12000g-15000g的速度，使在步驟1A中獲得的上清液離心l分鐘-5分鐘，優選地2-3分鐘的時間；-在步驟1C中，在2-6。C,優選地3-5。C的溫度下，以15000g-25000g，優選地18000g-22000g的速度，使在步驟IB中獲得的上清液離心45-120分鐘，優選地60-100分鐘的時間；-在步驟ID中，將在步驟1C中獲得的粒狀沉澱接納在體積為250jtl-4ml,優選地1-2ml的磷酸緩衝鹽水(PBS)中，並且在2-6°C，優選地3-5。C的溫度下，以15000g-25000g,優選地18000g-22000g的速度，使該混合物離心45-120分鐘，優選地60-IOO分鐘的時間；-在步驟IE中，將在步驟ID中獲得的粒狀沉澱接納在體積為250pl-4ml,優選地1-2ml的磷酸緩沖鹽水(PBS)中，並且在2-6'C，優選地3-5'C的溫度下，以15000g-25GQ0g，優選地18000g-22000g的速度，使該混合物離心45-120分鐘，優選地60-100分鐘的時間；-在步驟IF中，將在步驟IE中獲得的粒狀沉澱接納在體積為20W-500優選地5o-ioo的磷酸緩衝鹽水(PBS)中。4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其特徵在於，所述方法的笫二步驟(測量所述微顆粒產生纖溶酶的能力)直接對於在第一步驟結束時獲得的微顆粒的量來進行。5.根據權利要求1-3中任一項的方法，其特徵在於，所述方法的第二步驟(測量所述微顆粒產生纖溶酶的能力)對於在第一步驟結束時獲得的微顆粒的確定的量來進行。6.根據權利要求5的方法，其特徵在於，所述量為10000-1000000個孩i顆粒，優選地lOQQQG-SGQGQQ個樣i顆粒。7.根據權利要求1-3或5或6中任一項的方法，其特徵在於，所述方法包括對在第一步驟結束時獲得的所述微顆粒進行計數的另外步驟(步驟lbis),所述計數步驟在根據本發明的方法的第一步驟和第二步驟之間發生。8.根據權利要求7的方法，其特徵在於，所述微顆粒的計數通過流式細胞術來進4亍。9.根據權利要求1-8中任一項的方法，其特徵在於，所述方法的第二步驟，即在步驟1中分離出的所述微顆粒產生纖溶酶的能力的測量，通過測量在所述微顆粒上自發存在的纖溶酶的量或者通過測量能夠由這些^i:顆粒產生的纖溶酶的量來進行測定。10.根據權利要求9的方法，其特徵在於，在所述微顆粒上自發存在的纖溶酶的量的測量通過任何已知的方法，例如使用抗纖溶酶(抗纖溶酶原)抗體的免疫學測量(ELISA或Western印跡)，或者通過經由使用纖溶酶的選擇性生色底物在405nin處讀取樣品的吸光度而施行的分光光度法來進行。11.根據權利要求9的方法，其特徵在於，能夠由所述微顆粒產生的纖溶酶的量的測量根據這樣的程序來進行，在所迷程序中，-在步驟2-1中，向在所述方法的步驟1或步驟lbis中獲得的微顆粒中，以0.1jaM-2.0^M,優選地0.5pM-l陣的最終量添加纖溶酶原，有利地經純化的纖溶酶原，以及以0.50mM-l.OmM，優選地0.65mM-O.85mM的最終量添加纖溶酶的選擇性生色底物；-在步驟2-2中，例如在乾燥箱中，使在步驟2-l中獲得的混合物在25。C-45°C，優選地30°C-40。C的溫度下溫育30分鐘-90分鐘，優選地50-70分鐘的時間，和-在步驟2-3中，通過經由在405nM處讀取樣品的吸光度而施行的光度法來檢測能夠被產生的纖溶酶的量。12.根據權利要求11的方法，其特徵在於，在步驟2-l中，纖溶酶的選擇性底物為螢光底物，例如H_D-Val-Leu-Lys-7-氨基-4-甲基香豆素(Bachem,Bubendorf，Switzeriand)或D-AFK-ANSNH-iC4H9.2HB(HaematologicTechnologiesInc，VermontUSA)。13.根據權利要求1-12中任一項的方法，其特徵在於，所述方法的第二步驟，即在步驟l中分離出的所述微顆粒產生纖溶酶的能力的測量，在25150pl，優選地50pl-100pl的終體積中進行。14.根據權利要求1-13中任一項的方法，其特徵在於，所迷方法的第二步驟，即在步驟l中分離出的所述微顆粒產生纖溶酶的能力的測量，在以1.0-3.0mg/ml，優選地1.5-2.5mg/ml的濃度添加有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸緩衝鹽水(PBS)中進行。15.根據權利要求1-14中任一項的方法，其特徵在於，所述方法還包括根據其起源來分離所述微顆粒的步驟Uer。16.根據權利要求1-15中任一項的方法，其特徵在於，將在步驟1中分離出的所述微顆粒固定在支持物上，在所述支持物上進行步驟2。17.根據權利要求16的方法，其特徵在於，使用能夠固定所述微顆粒的化合物將在步驟l中分離出的所述微顆粒固定在支持物上，所述化合物事先被固定至所述支持物的表面。18.根椐權利要求17的方法，其特徵在於，能夠固定所述微顆粒的所述化合物選自膜聯蛋白V、對於膜的活性和/或功能性構象糖蛋白複合物GPIIb/GPIIIa特異的抗體、單核細胞或淋巴細胞的粘著受體LFA-1、內皮血栓調節蛋白、或CD146或者聚陽離子例如聚-L-賴氨酸。19.存在於生物學流體的樣品中的循環微顆粒在用於測量生物學流體，特別是處於流動狀況下的生物學流體的所述樣品的纖溶酶活性的方法中的用途。20.根據權利要求19的用途，其特徵在於，用於測量生物學流體的所述樣品的纖溶酶活性的方法為在權利要求1-18中任一項之中所描述的方法。21.存在於生物學流體，特別是處於流動狀況下的生物學流體的樣品中的循環^L顆粒在診斷方法中的用途，所述診斷方法在所迷生物學流體所源自的個體中診斷-具有或多或少升高的遭受例如由於增加的動脈粥樣化斑塊的不穩定性而引起的血管意外的風險，或者-對於患有癌症的所述個體來說具有或多或少升高的遭受轉移性侵襲的風險，或者-對於所述個體來說具有或多或少升高的遭受腦血管意外及其出血性後果的風險，或者-對於所述個體來說具有遭受血栓形成的風險，-對於所述個體來說具有或多或少升高的患其中由微顆粒所進行的纖溶酶產生被增加的疾病的風險，所述疾病例如為纖維蛋白溶解過度或細胞外周蛋白水解。22.根據權利要求21的用途，其特徵在於，所述診斷方法為在權利要求1-18中任一項之中所描述的用於測量纖溶酶活性的方法。23.存在於生物學流體，特別是處於流動狀況下的生物學流體的樣品中的循環微顆粒在用於追蹤所述生物學流體所源自的個體對於治療所作出的應答的方法中的用途。24.根據權利要求23的用途，其特徵在於，所述用於對治療進行追蹤的方法為在權利要求1-18中任一項之中所描述的用於測量纖溶酶活性的方法。25.經純化或半純化的循環微顆粒，特別是源自內皮細胞的微顆粒作為纖溶酶活性的載體的用途。26.經純化或半純化的循環微顆粒，特別是源自內皮細胞的微顆粒作為藥物，特別是具有蛋白水解或抗血栓形成活性的藥物的用途。全文摘要本發明的目標在於用於測量生物學流體，特別是處於流動狀況下的生物學流體的樣品的微顆粒，特別是循環微顆粒的纖溶酶活性的方法，所述方法可以用作診斷方法或用作對治療進行追蹤的方法。文檔編號C12Q1/56GK101688235SQ200880018876公開日2010年3月31日申請日期2008年6月6日優先權日2007年6月7日發明者E·安格萊斯卡諾,F·迪尼奈-喬治,F·馬拉泰爾,R·拉克魯瓦申請人:國家健康醫學研究所;公共救濟事業局-馬賽醫院;地中海大學;下諾曼第卡昂大學