腦膜炎球菌多價原始外膜囊泡疫苗、其製備方法和應用的製作方法

2023-04-30 17:33:51

專利名稱：腦膜炎球菌多價原始外膜囊泡疫苗、其製備方法和應用的製作方法
腦膜炎球菌多價原始外膜囊泡疫苗、其製備方法和應用相關申請的交叉引用本發明要求申請日為2008年5月30日，名稱為「腦膜炎球菌多價原始外膜囊泡疫 苗」的美國臨時申請號61/057，462的優先權。該申請的全部公開和內容通過引用全文併入 本文。聯邦政府支持的研究或開發美國政府享有本申請中的權利。
背景技術：
腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是世界範圍內的腦膜炎和敗血病的 主要誘因。腦膜炎球菌性腦膜炎是腦膜、沿著腦和脊髓的膜的炎症。在腦膜炎球菌性敗血 病和腦膜炎球菌性腦膜炎中，損傷是由失控的局部或全身性宿主炎性應答引起的。目前B 群腦膜炎球菌疾病佔很多國家包括北美和南美洲以及歐洲的所有腦膜炎球菌疾病的至少 一半。在70年代末期在挪威出現了一種新的B群腦膜炎奈瑟球菌的毒性克隆體，稱為ET5， 從那時起ET5在挪威、古巴、巴西和智利引起了長時期的流行病。這些流行病已經產生了嚴 重的公共健康問題並且在數個受影響的國家引起了開發有效B群疫苗的深入研究。在美國 缺乏批准的B群疫苗，並且A和C莢膜多糖疫苗在18個月以下的兒童中效力很差，這已經 阻止了針對腦膜炎球菌疾病的常規」L童疫苗接種的認真考慮。腦膜炎奈瑟球菌分為13個血清群，其中9個群引起侵襲性疾病(A、B、C(C1，C1_)、 X、Y、W-135、Z和L)。5個血清群是開發疫苗的靶標，因為它們能夠引起流行病，其中包括血 清群A、B、C、Y和W135，它們是很多疫苗研究的靶標。針對引起幾乎所有的侵襲性腦膜炎球菌疾病的腦膜炎奈瑟球菌的血清群A、C、Y 和W135的疫苗是可獲得的，並且常規使用，效果甚佳。由於多種原因，開發針對腦膜炎奈瑟 球菌的B群菌株的合適疫苗卻困難得多。例如，確定血清群的莢膜多糖在用於疫苗時是無 效的且具有潛在的不安全性，這是因為它具有與某些人類細胞尤其是血細胞中存在的多聚 唾液酸相同的結構。造成缺乏合適疫苗的另一個原因是以下事實表面暴露的莢膜下(subcapsular) 抗原，例如外膜蛋白和脂寡糖(內毒素)在抗原性上是可變的和/或在B群菌株中的表達 是不恆定的。尚未鑑別出單獨具有對有效疫苗而言必不可少的所有特徵的單一抗原。

發明內容
在一個方面，本技術提供了包含原始外膜囊泡(NOMV)的疫苗，所述原始外膜囊泡 獲自經過遺傳修飾以提供廣泛保護的至少兩種腦膜炎球菌菌株。所述原始外膜囊泡包括基 於PorA、L0S和保守性外膜蛋白的三組不同抗原；並且所述經遺傳修飾的菌株被修飾為，基 於lpxLl，synX和IgtA基因的滅活提供增強的安全性。兩種腦膜炎球菌菌株均可表達具 達具有不同LOS核心結構並具有由葡萄糖和半乳糖組成的α鏈的LOS。每種菌株可以表 達基於B群病例分離體中最常見的PorA亞型選擇的至少兩種不同的PorA亞型蛋白或亞型表位。此外，所述疫苗還包括不同的具有誘導殺菌抗體能力的保守性表面蛋白，其在每種菌 株中過表達並且選自FHBP (GNA1870)變體1、FHBP變體2和FHBP變體3 ；NadA ；App ；NspA ； TbpA 和 TbpB。在另一方面，本技術提供了來自三種經遺傳修飾的、抗原性上不同的腦膜炎奈瑟 球菌菌株的NOMV的組合。至少一種所述菌株選自(1) H44/76H0PS-DL,其具有下列遺傳修飾 或特徵基因synX、IpxLl和IgtA的滅活；在opaD的位置插入第二 porA基因(亞型Pl. 7-1， 1) ；NadA增強的表達；和Opc和PorA的穩定高表達；(2) 8570H0PS_GAL，其具有下列遺傳修 飾或特徵基因synX、IpxLl和IgtA的滅活；在opaD的位置插入第二 porA基因；因子H結 合蛋白變體1的增強的表達；和PorA和Opc的穩定高表達；和/或(3)B16B6HPS-G2A，其具 有下列遺傳修飾或特徵基因synX、IpxL 1和IgtA的滅活；在opaD的位置插入第二 porA 基因；因子H結合蛋白變體2的增強的表達；和PorA和Opc的穩定高表達。從壓縮的細胞 (packed cells)或從耗盡的培養基中製備N0MV，不暴露於去汙劑或變性溶劑。所述疫苗可 以與一種或多種佐劑混合併且可以肌內和/或鼻內給藥。在另一個方面，本技術提供了針對腦膜炎球菌疾病、更優選為B群腦膜炎球菌疾 病的疫苗組合物，其包括來自一種或多種經遺傳修飾的腦膜炎奈瑟球菌菌株的原始外膜囊 泡(NOMV)。所述一種或多種經遺傳修飾的菌株經過下列修飾每種菌株中synX基因的滅 活、IpxLl基因的滅活、IgtA基因的滅活，其導致表達短的或截短的缺少四糖「乳糖-N-新 四糖」的脂寡糖(LOS)，和/或在opa基因的位置插入至少一個抗原性上不同的第二 porA 基因。在另一個方面，經遺傳修飾的菌株還包含至少一種次要的保守性外膜蛋白的增加的 或穩定的表達，和/或至少一種外膜蛋白的穩定的表達。所述至少一個抗原性上不同的第 二 porA基因可以表達至少一種PorA亞型蛋白或亞型表位，其選自腦膜炎B群分離體的最 常見的PorA亞型。在另一個方面，本技術提供了腦膜炎奈瑟球菌亞型B菌株的經遺傳修飾的疫苗菌 株。所述經遺傳修飾的疫苗菌株可以包括H44/76H0PS-D菌株(Bi)、8570 H0S-G1菌株(B2) 和 / 或 B16B6 HPS-G2A 菌株(B3)。在另一個方面，本技術提供了腦膜炎奈瑟球菌亞型B的經遺傳修飾的疫苗菌株， 其衍生自包含以下遺傳修飾的H44/76菌株i)synX基因的滅活，ii) IpxLl基因的滅活， iii) IgtA基因的滅活，iv)在opaD基因的位置插入第二 porA基因，ν)相對於原始菌株， NadA的增強的表達，和vi) Opc和PorA蛋白的穩定的增強的表達。在一些方面，所述經遺傳 修飾的菌株衍生自ΕΤ-5野生型菌株Η44/76 (B 15 =Pl. 7,16 =L, 3, 7 :Ρ5· 5，C)。在另一個方面，本技術提供了腦膜炎奈瑟球菌亞型B菌株的經遺傳修飾的疫苗菌 株，其衍生自包含以下遺傳修飾的8570 :i)synX基因的滅活，ii) IpxLl基因的滅活，iii) IgtA基因的滅活，iv)在opaD的位置插入第二 porA基因，ν)因子H結合蛋白變體1的增 強的表達，和vi)PorA和Opc蛋白的穩定的增強的表達。在一些方面，所述經遺傳修飾的菌 株衍生自 ET-5 野生型菌株 8570 (B 4 =P 1. 19，15 :L3，7v :Ρ5· 5，11，C)。在另一個方面，本技術提供了腦膜炎奈瑟球菌亞型B的經遺傳修飾的疫苗菌株， 其衍生自包含以下遺傳修飾的Β16Β6 :i) synX基因的滅活，ii) IpxLl基因的滅活，iii) IgtA 基因的滅活，iv)在opaD的位置插入第二 porA基因(亞型Pl. 22-1，4)，ν)因子H結合蛋 白變體2的增強的表達，和vi) PorA和Opc蛋白的穩定的增強的表達。在一些方面，所述經遺傳修飾的菌株衍生自已丁-5野生型菌株81686出2￡1屮1.5，2 :L2 :Ρ5· 1,2,5) 在一些方面，本技術提供了在鐵缺陷型的培養基中生長的經遺傳修飾的菌株。在其它方面，本技術提供了經遺傳修飾的菌株，其中通過在滅活基因的序列內插 入藥物抗性基因使synX基因、IpxLl基因或IgtA基因滅活。另一個方面提供了包括源生自本技術的經遺傳修飾的菌株的NOMV的疫苗。所述 NOMV從壓縮的細胞或從耗盡的培養基中製備，不暴露於去汙劑或變性溶劑。所述疫苗還可 以包含一種或多種佐劑。在其它方面，遺傳上改變的菌株改變為表達鐵攝入蛋白。在另一個方面，本技術提供了針對腦膜炎球菌疾病的疫苗，其包含多種原始外膜 囊泡(NOMV)，其中至少一些所述NOMV基本沒有表達或脂寡糖(L0Q的唾液酸化；包含含有 脂A的L0S，所述脂A具有五醯基結構；並包含至少一種次要的保守性外膜蛋白的增加的表 達，其中所述次要的保守性外膜蛋白選自誘導殺菌抗體的蛋白。所述次要的保守性外膜蛋 白可以選自NadA、因子H結合蛋白(FHBP)變體1和FHBP變體2。在其它方面，至少一些 NOMV包含短的或截短的基本上不含四糖「乳糖-N-新四糖(LNnT) 」的L0S，和/或至少一些 NOMV包含兩個或更多個不同的PorA蛋白。在另一個方面，本技術提供了在動物或人中引發針對腦膜炎球菌疾病的免疫應答 的方法，其包括向動物或人施用包含來自至少一種經遺傳改變的腦膜炎奈瑟球菌菌株的 NOMV的組合物，以進行針對腦膜炎球菌疾病的免疫。疫苗用於針對B群腦膜炎球菌疾病的 免疫。在另一個方面，本技術提供了製備用於針對腦膜炎球菌疾病的疫苗的經遺傳修飾 的腦膜炎奈瑟球菌菌株的方法，包括以下步驟a)選擇能夠進行遺傳修飾的腦膜炎球菌B 型菌株；b)通過滅活synX基因對該菌株進行遺傳修飾；c)通過滅活IpxLl基因對該菌株進 行遺傳修飾；d)通過滅活IgtA基因對該菌株進行遺傳修飾；和e)通過增加一種或多種次 要的保守性外膜蛋白的表達對該菌株進行遺傳修飾。在另一個方面，所述方法還包括通過 將至少一個抗原性上不同的第二 PorA基因插入到opa基因的開放讀碼框中而對該菌株進 行遺傳修飾。在其它方面，所述方法還包括以下步驟通過將至少一種外膜蛋白的啟動子內 或開放讀碼框內的多聚C序列替換為包含G和C核苷酸的序列而對該菌株進行遺傳修飾， 以穩定表達或過表達所述至少一種外膜蛋白。在另一方面，本技術提供了製備針對腦膜炎球菌疾病的疫苗的方法，包括以下步 驟a)培養包含一種或多種選自下列的修飾的腦膜炎奈瑟球菌的經遺傳修飾的菌株synX 基因的滅活、IpxLl基因的滅活、IgtA基因的滅活、在opa基因的位置插入至少一個抗原性 上不同的第二 PorA基因、至少一種次要的保守性外膜蛋白的增強的或穩定的表達、和/或 至少一種外膜蛋白的穩定的表達；b)使用a)的培養的菌株接種發酵器中的培養基，通過發 酵擴增培養物；c)滅活發酵的培養物；d)通過持續流動離心法收集培養的腦膜炎奈瑟球菌 細胞並收集細胞糊；e)從細胞糊中分離NOMV ；和f)將NOMV重懸於適合於疫苗施用的緩衝 液或載體。


圖1的流程圖描述了用於生產疫苗的經遺傳修飾的奈瑟球菌菌株的主細胞庫 (master cell bank)的製備。
圖2的流程圖描述了用於生產疫苗的經遺傳修飾的奈瑟球菌菌株的細胞庫製備 物的生產。圖3的流程圖描述了奈瑟球菌的發酵，其用於製備用於生產疫苗的經遺傳修飾的 奈瑟球菌菌株。圖4的流程圖描述了來自用於生產疫苗的經遺傳修飾的奈瑟球菌菌株的NOMV的純化。圖5是圖4的流程圖的繼續。圖6是考馬斯藍染色的凝膠圖，其顯示了標準物(泳道1)、對照8570 HOPS-G NOMV 製備物(泳道2)、過濾的原液疫苗(bulk vaccine)(泳道3)和成品疫苗(泳道4)的蛋白含量。圖7是銀染凝膠，其顯示了疫苗的脂寡糖含量。泳道1是對照ML5LPS，泳道2是 過濾的原液疫苗，泳道3是成品疫苗產品。將15μ1的1 2稀釋的100 μ g/ml疫苗跑膠 (20 μ 1的100 μ 1/ml 1 2稀釋的對照)。圖8是抗體染色的western印跡圖，其顯示了 8570 H0PS-GN0MV疫苗中存在的蛋 白的性質和組成。圖9的圖顯示了從經過不同濃度的疫苗溫育之後的人血液釋放的TNF- α。圖10的圖顯示了從經過不同濃度的經遺傳修飾的NOMV疫苗溫育之後的人血液釋 放的IL-6。圖11的圖顯示了 「從經過不同濃度的經遺傳修飾的疫苗溫育之後的人血液釋放 WTNF-Ci 」與「從經過來自菌株44/76的DOC提取的OMV溫育之後的人血液釋放的TNF-α 」 進行比較。圖12的柱形圖顯示了以含有或不含佐劑的不同濃度的8570H0PS-G疫苗接種的小 鼠的殺菌效價。圖13的柱形圖顯示了以8570 HOPS-G疫苗接種的小鼠針對不同測試菌株的殺菌 效價。圖14的圖顯示了 LOS、GNA1870、NOMV和Opc抗原的殺菌抗體消除測定的結果。圖15顯示了以含有或不含佐劑的8570 HOPS-G NOMV疫苗接種的兔子的抗體應答。圖16的圖顯示了 8570 HOPS-Gl NOMV疫苗對測試菌株的殺菌抗體消除測定的結^ ο圖17的圖顯示了 8570 HOPS-Gl PorA敲除菌株的LOS和FHBP抗原的殺菌抗體消 除測試的結果。圖18是本技術的三種經遺傳修飾的奈瑟球菌菌株(A = B1，B = B2，C = B3)的表 型的圖示。圖19是用於構建經遺傳修飾的奈瑟球菌菌株的質粒的圖示a)構建為敲除IgtA 的質粒，b)表達第二 PorA的質粒，c)通過直系同源啟動子(如果是大腸桿菌的話，則用 Ptac)的驅動過表達fHbp的質粒，d)通過同源啟動子(腦膜炎奈瑟球菌的PorA啟動子) 的驅動過表達NadA的質粒，和e)通過同源重組替換NspA基因，以fHbp (變體1和2)和 NadA過表達質粒轉化腦膜炎奈瑟球菌的示意圖。
圖20a是通過敲除三種經遺傳修飾的菌株中的IgtA基因而使NOMV疫苗菌株的截 短的LOS免疫型穩定化的圖示。圖20b是經遺傳改變的菌株B2和親代菌株(B16B6)表達 的LOS α鏈的免疫印跡圖，使用針對L3，7，9(左)和L8 (右)的單克隆抗體。圖21的示意圖顯示了經遺傳修飾的菌株B3中fHbp變體2的表達。圖21a)顯示 了通過免疫印跡方法選擇含有慶大黴素抗性的重組子、含有fHbp過表達的菌株；圖21b)是 Western印跡圖，顯示了 fHBp的表達的增加，其中使用針對fHbp的JAR4單克隆抗體。
具體實施例方式本技術提供了用於針對腦膜炎球菌疾病、更優選針對腦膜炎奈瑟球菌B型亞組進 行免疫的廣泛保護的疫苗組合物。本技術的一個實施方式提供了包含來自至少一種、優選 至少兩種、更優選至少三種經遺傳修飾的腦膜炎奈瑟球菌菌株的原始外膜囊泡(NOMV)的 疫苗組合物。原始外膜囊泡，也稱為泡(bleb)，是從革蘭氏陰性細菌的外膜的片段形成或衍 生的囊泡，在生長過程中自然脫落，其可以從培養基獲得或通過不使用去汙劑或變性溶劑 的溫和方法從細胞獲得。這些NOMV通常包含外膜蛋白(OMP)、脂類、磷脂、周質物質和脂多 糖(LPQ，包括脂寡糖。革蘭氏陰性細菌，尤其是病原體，例如腦膜炎奈瑟球菌，在毒性感染 中，通常會在稱作起泡(bibbing)的過程中脫落N0MV。在本技術中，NOMV是從細菌的外膜 產生的囊泡，其中不使用化學變性過程，並且是從經遺傳修飾的菌株產生的，所述菌株在抗 原性上是不同的並且每種菌株都經過遺傳修飾以改進安全性、抗原性的穩定性和保護性免 疫應答的廣度。本發明的一個實施方式提供了包含衍生自至少兩種或更多種經遺傳修飾的腦膜 炎奈瑟球菌菌株、優選至少三種不同的經遺傳修飾的菌株的原始外膜囊泡(NOMV)的疫苗 組合物。本技術的在一些實施方式中提供了腦膜炎奈瑟球菌、優選B亞型腦膜炎奈瑟球菌 的抗原性上不同的菌株，其包括細菌基因組內的至少3個遺傳修飾，更優選至少5個遺傳 修飾，更適宜地至少6個遺傳修飾。所述遺傳修飾可以包括以下一種或多種l)synX基因 的滅活，該基因對於唾液酸的生物合成是必需的，其滅活導致沒有莢膜表達或脂寡糖(LOS) 的唾液酸化；2) IpxLl基因的滅活，這會產生毒性顯著較低的L0S，其具有五醯基結構的脂 A;3)在一個opa基因(OpaC或OpaD)的位置插入抗原性上不同的第二 porA基因；4)至少 一種次要的保守性外膜蛋白的增加的表達，所述次要的保守性外膜蛋白顯示出誘導殺菌抗 體的能力(例如，但不限於，NadA、因子H結合蛋白(FHBP)變體1和FHBP變體2) ；5)每種 菌株中IgtA基因的滅活，這導致短的或截短的LOS的表達，其缺少四糖「乳糖-N-新四糖 (LNnT) 」，和/或6)某些外膜蛋白的穩定的表達，例如Opc和PorA，這些蛋白在野生型菌株 中易於發生相變異(phase variation)。本技術提供了經遺傳修飾的菌株，所述菌株提供了使用的安全性的增加以及針對 腦膜炎球菌疾病的保護性抗體應答的廣度的增加。在一個實施方式中，通過向細菌基因組 中引入至少一個下列突變，經遺傳修飾的菌株提供了增加的安全性刪除synX基因，這會 阻斷衣殼的唾液酸合成，並導致形成莢膜陰性的表型的NOMV ；刪除IpxLl基因，這會通過產 生五醯基脂A結構而降低內毒素活性；和/或刪除IgtA基因，這會阻斷脂寡糖(LOS)上乳 糖-N-新四糖的生物合成，從而使截短的LOS結構穩定；更優選地，經遺傳修飾的菌株提供這些突變中的兩項，最優選地，經遺傳修飾的菌株提供所有這三項突變。在本技術的另一個 實施方式中，通過靶向NOMV中包含的三組可能的保護性抗原中的至少一個，經遺傳修飾的 菌株具有保護性抗體應答的增加的廣度。所述靶向的三種可能的抗原包括以下至少一種 PorA蛋白、至少一種次要的保守性蛋白、和/或LOS核心結構，並且包括其任意組合。在更 優選的實施方式中，經遺傳修飾的菌株靶向至少兩種可能的保護性抗原，最優選靶向所有 這三種可能的保護性抗原。在本技術的一些實施方式中，通過美國專利6，558，677中描述的方法將synX-突 變(synX基因的滅活)插入經遺傳修飾的菌株，該專利通過引用全文併入本文。簡而 言之，使用基於PUC19的質粒轉化經遺傳修飾的菌株，所述質粒包含synX基因，其中 200bp序列替換為卡那黴素抗性基因。選擇Kan抗性轉化子並通過PCR測試其中是否存 在被破壞的synX基因並測試其莢膜陰性表型。這種synX-突變體是基於Swartley和 Stephens (Swartley and Stephens (1994) J. Bacteriol. 176 :1530-1534)報導的結果和序 列信息構建的，他們的研究顯示向synX基因中插入轉座子會導致莢膜陰性表型。可以向 任何可轉化的腦膜炎奈瑟球菌菌株中導入相同或等同的突變。使用以下程序構建了用於轉 化腦膜炎球菌的合適質粒。使用通過重疊延伸(SOE)聚合酶鏈式反應(PCR)的剪接(Horton 等人(1989) Gene 77 61-65)將3個DNA序列拼接在一起。所述3個DNA序列包括從5 『 末端開始，synXB鹼基67-681 ；來自pUC4K (Pharmacia LKB Biotech Co.)的卡那黴素抗性 基因671-1623 ；和synxB鹼基886-1589。此外，通過在用於擴增synXB 67-691鹼基序列的 PCR引物末端加入假定的攝取序列(uptake sequence)ACCGTCTGAA，在5'末端添加該攝取 序列。通過PCR擴增完整的構建體、純化並平末端連接進入pUC19。pUC19用於轉化大腸杆 菌DH5ci並在LB瓊脂上以50 μ g卡那黴素進行選擇。選取卡那黴素抗性菌落，提取DNA、純 化並以^CbaI切割。將假定的攝取序列的另一個拷貝連接進入此多克隆位點區，使用得到的 質粒轉化大腸桿菌DH5 α並通過PCR就另外的攝取序列的存在來篩選卡那黴素抗性菌落。 從所選擇的菌落中分離質粒DNA並用作PCR的模板，所述PCR使用僅擴增質粒的插入部分 (不包括氨比西林抗性基因，其不應被導入腦膜炎奈瑟球菌)的引物。然後純化經擴增的 DNA並用於轉化經遺傳修飾的腦膜炎奈瑟球菌菌株。通過卡那黴素抗性選擇腦膜炎奈瑟球 菌的synX(-)突變體並通過PCR擴增修飾區域加以確認。在本發明的一些實施方式中，在經遺傳修飾的菌株中將IpxLl基因滅活以產生疫 苗組合物中的NOMV上表達的內毒素毒性降低的L0S。腦膜炎奈瑟球菌LOS的脂A通常是六 醯基結構，其負責LOS的內毒素毒性特性。脂A中存在的兩個醯基-氧-醯基連接的次級脂 肪酸對於內毒素毒性活性具有重要意義。經遺傳修飾的菌株包括如van der Ley及其同事 (van der Ley, P. , Steeghs, L. , Hamstra, H. J. , van Hove, J. , Zomer, B. , and van Alphen, L. Modification of lipid Abiosynthesis in Neisseria meningitidis IpxL mutants influence on lipopolysaccharide structure, toxicity, and adjuvant activity. Infection and Immunity 69 (10)，5981-5990，2001.)描述的 IpxLl 突變體。IpxLl 基因的 刪除導致五-醯基LOS的正常水平的表達，其具有大大降低的內毒素毒性，如通過兔子熱源 測試法和使用來自全血的人單核細胞進行的細胞因子釋放測定法所測。在本技術的其它實 施方式中考慮到了用於破壞IpxLl基因以用於開發經遺傳修飾的菌株的其它方法。在一些實施方式中，經遺傳修飾的菌株中包含插入到opa基因中的一個(OpaC或
11OpaD)的位置中的抗原性上不同的第二porA基因。腦膜炎奈瑟球菌的主要外膜蛋白PorinA 或PorA是porA基因的產物。PorA具有廣泛的抗原性變異，並且易於發生相變異以逃避免 疫選擇性壓力；因此，它對其它亞型並不總是具有交叉保護性。為了增加疫苗組合物對不同 亞型的PorA的反應活性，將至少一個另外的porA基因插入到經遺傳改變的菌株的opaC或 opaD基因中。所選的用於插入的PorA血清型是根據B亞型腦膜炎球菌疾病病例中發現的最 主要的PorA形式來選擇的。合適的PorA血清型包括但不限於，Pl. 7-1(來自菌株M1080)； 卩1.22，14(來自菌株114410) ；Pl. 22，1，4 ；或本領域技術人員理解的或目前文獻中描述的 其它適宜的 PorA 血清型，例如 Sacchi 等人，Diversity and prevalence of PorA types in Neisseria meningitidis serogroup B in the United States, 1992—1998, J Infect Dis. 20000ct ； 182 (4) : 1169-76中所描述的。所述第二 PorA基因可以置於提供PorA蛋白表 達的任何合適的有力的啟動子的控制之下，例如來自適宜的菌株例如H44/76菌株的PorA 啟動子。將PorA基因克隆進入經遺傳改變的菌株的合適方法是本領域技術人員已知的，可 以包括但不限於同源重組。例如，可以通過PCR從細菌染色體DNA擴增porA基因，將其克 隆進入克隆載體，並使用通過修改的重疊延伸PCR技術的基因剪接將其再克隆進入適當地 構建的質粒，例如PUC19。可以通過同源重組將該構建體質粒導入細菌的基因組以替換opa 基因。可以通過使用針對Porin的單克隆抗體通過菌落印跡法來選擇轉化子。這些方法對 本領域技術人員是已知的。在本技術的進一步的實施方式中，修飾的菌株具有至少一種次要外膜蛋白的穩定 的和/或增加的表達。合適的次要外膜蛋白顯示出誘導殺菌抗體的能力(例如，但不限於， NadA,因子H結合蛋白(FHBP)變體1和FHBP變體2)。不被任何理論所束縛，高度保守的表 面暴露的次要外膜蛋白(通過基因組分析鑑別為具有誘導保護性抗體的潛力)的穩定的和 /或增加的表達可以引起交叉保護性免疫應答的增加。適宜的保守性次要蛋白包括但不限 於NadA、FHBP變體1和2和Opc。使次要外膜蛋白(OMP)穩定和/或過表達的方法包括使 用表達質粒和同源重組，或本領域技術人員已知的其它合適的方法。次要OMP可以置於有 力的啟動子的控制之下，例如但不限於，腦膜炎奈瑟球菌PorA啟動子或IPTG可誘導的大腸 桿菌ptac啟動子。如下文實施例中所描述，使用構建體質粒在經遺傳修飾的菌株中建立fHbpl和 fHbp2的增加的表達，其中過表達的蛋白被正確地加工、脂化並轉移至外膜表面。例如，v. 1 在IPTG可誘導的大腸桿菌Ptac啟動子的控制下在菌株8570 HOPS-G (B》中的表達比在 親代菌株8570中的表達高大約4倍；v. 2在菌株B16B2 HPS-G2A (B3)中的表達比在親代菌 株B16B6中的表達高32-64倍(見圖20)。或者，利用PorA啟動子的表達系統可用於使次 要的保守性蛋白穩定/過表達。在本技術的進一步的實施方式中，經遺傳修飾的菌株包括IgtA基因的滅活，這導 致短的或截短的缺少四糖「乳糖-N-新四糖(LNnT)，，的LOS的表達。腦膜炎球菌的LOS的一個重要特徵是相變異，這是由於IgtA和其它奈瑟球菌基因 中的核苷酸殘基的均聚束(homopolymeric tract)的高頻率突變造成的。這些突變開啟 或關閉LgtA轉移酶的表達，該酶介導LOS α -鏈的組裝(改變庚糖二上的取代基的構象)。 IgtA基因的這種相變異激活可能引起LOS α -鏈的不想要的延長，從而導致產生與人類血 液細胞抗原具有結構類似性的乳糖-N-新四糖。在本技術的經遺傳修飾的菌株中，通過使用抗生素標誌物或其它合適的標誌物(用於篩選基因中的變異)，例如，但不限於zeomycin 抗性基因，破壞原始基因，將IgtA基因敲除。敲除IgtA基因的方法是本領域技術人員已知 的，包括但不限於，構建質粒和同源重組或轉化。在所觀察的至少22個傳代的過程中，在所 有的經修飾的菌株中，突變的△ IgtA基因是無活性的，並且這是穩定的截短形式的LOS核 心結構。IgtA基因的刪除穩定了截短的α-核心LOS結構，例如，提供了如圖19所示的截 短的核心結構，其中顯示了 3個示例性的修飾的菌株，例如Β3菌株，其含有具有L3核心結 構的L8 α鏈。本技術的經遺傳修飾的菌株含有對應於免疫型L3、L5和L2的特異性LOS核 心結構，提供了穩定的核心結構，其中可以增強免疫應答，在下文的實施例中證明截短的L8 樣LOS (L8-3、L8-5和L84)能夠殺死表達全長LOS的野生型菌株。Δ IgtA菌株能夠激發 識別截短的和全長形式的LOS結構的抗體，與人類血細胞中存在的乳糖-N-新四糖寡糖沒 有交叉反應。在本技術的其它實施方式中，經遺傳修飾的腦膜炎奈瑟球菌菌株穩定表達在野生 型菌株中通常易於發生相變異的外膜蛋白，所述蛋白是例如但不限於Opc和PorA。可以通 過本領域已知的方法穩定這些蛋白的表達，所述方法包括以最佳長度形式的最大表達的非 重複序列替換待穩定的基因的啟動子或讀碼框中的多聚重複序列。例如，這些基因的啟動 子中的多聚-C或多聚-G序列的一部分可以替換為相同長度的含有C和G核苷酸二者的序 列，例如opcA的啟動子(見SEQ IDNO 1)的12bp的多聚-G序列替換為新的相同長度的含 有C和G核苷酸二者以及Not I位點的序列(見SEQ ID NO :2,Not I位點以下劃線標出)。 在其它適宜的實施方式中，PorA啟動子(例如，見SEQID NO 3)中的多聚-G序列可以替換 為新的含有C和G核苷酸的序列。本技術的其它實施方式提供了在含有低水平鐵的液體培養基中生長以便誘導參 與鐵攝取的蛋白(例如，轉移結合蛋白A和B)表達的疫苗菌株。在一些實施方式中，所用 的培養基不含有特異性添加的鐵螯合劑，例如得斯芬(desferol)。一種適宜的培養基是從 Bff Catlin(Catlin Bff. (1973) J. Infec. Dis. 128 :178-194)發表的培養基改進而來將幾 種單獨的胺基酸替換為的酪蛋白胺基酸(經鑑定的，Difco Laboratories)。每升所述 培養基含有下列物質0. 4g NH4CUO. 168gKCl、5. 85g NaCl、1.065g Na2HPO4^O. 17g KH2PO4, 0. 647g檸檬酸鈉、6. 25g乳酸鈉(60%的糖漿)、0· 037g CaCl2. 2Η20、0· 0013gMnS04. H20、5g甘 油、0.02g半胱氨酸、IOg酪蛋白胺基酸、0.616gMgS04，加蒸餾水至1升。將相同的鐵缺陷型 培養基用於起始培養瓶和最終培養瓶或發酵器。包括來自至少3種不同的經遺傳修飾的B亞型菌株的NOMV的本技術的疫苗組合 物可以提供3種潛在水平的保護或3種抗原，每種潛在地誘導保護性抗體應答。所述3種 抗原是PorA蛋白(疫苗中存在6種不同的PorA亞型，3種疫苗菌株的每一種有2種PorA 蛋白)；脂寡糖(疫苗中存在3種不同的LOS核心結構，每種菌株有1種)；和保守的次要蛋 白NadA、FHBP變體1和2，以及Opc，它們在疫苗菌株中過表達。雖然PorA具有相對高水平 的抗原變異，其中已經鑑別了幾百種不同的序列變異，但是某些PorA血清亞型比其它的更 經常遇到，適度數目的不同的血清亞型可以潛在地提供針對一半以上的B群疾病的保護。 在疫苗中具備一種以上的能夠誘導殺菌抗體的抗原具有重要意義，這是因為已經表明了當 抗原的表面密度較低時，針對該抗原的抗體可能不能啟動補體介導的裂解事件。但是，如果 存在針對兩種或更多種此類抗原的抗體，則抗體聯合在一起能夠啟動補體介導的裂解。本發明的經遺傳修飾的菌株包括但不限於圖18中所示的3種菌株，包括BK44/76 H0PS-D)、 B2(8570 HOPS-G1)和 B3 (B16B6HPS-G2)菌株。本技術提供了這樣的疫苗，其提供針對腦膜炎球菌疾病、尤其是腦膜炎奈瑟球菌B 亞型引起的腦膜炎球菌疾病的廣譜保護。本發明的疫苗組合物可以與現有的四價的A、C、Y 和W-135疫苗組合以提供針對多數致病性腦膜炎奈瑟球菌血清群的保護。不被任何特定理 論所束縛，本技術的疫苗還可以提供針對其它致病性血清群以及腦膜炎球菌的次要血清群 的後備保護(back up protection)，因為該疫苗所基於的莢膜下抗原為腦膜炎球菌的所有 血清群所共有。在本技術的優選實施方式中，通過同源重組和/或位點特異性重組的方式將目標 基因或目標DNA輸送並整合進入細菌染色體。用於輸送此類基因和/或操縱子的整合性載 體可以是條件化的可複製的或自殺質粒、噬菌體、轉位子，或通過本領域技術人員已知的限 制性水解或PCR擴增獲得的線性DNA片段。在一些實施方式中，整合靶向那些對於體外生 長可有可無的染色體區域。在其它實施方式中，可以通過游離型載體(印isomal vector), 例如環形/線性可複製質粒、粘粒、質粒、溶原性噬菌體或細菌人工染色體的方式將目標基 因或目標DNA輸送至細菌。可以通過可選擇的遺傳標誌物例如賦予對抗生素(例如卡那黴 素、zeomycin、紅黴素、氯黴素、慶大黴素等)抗性的基因、賦予對重金屬和/或毒性化合物 抗性的基因、或補償營養缺陷型突變的基因來選擇重組事件。或者，可以通過PCR擴增、測 序、限制性消化或本領域技術人員已知的其它方法進行重組的篩選。本文所稱的「疫苗」定義為藥物組合物或治療性組合物，其用於接種動物以使該動 物產生抵抗生物體、優選為致病性生物體感染的免疫力。疫苗通常包含一種或多種衍生自 一種或多種生物體的抗原，向動物施用之後將刺激主動免疫力並保護該動物抵抗這些生物 體或相關的致病性生物體的感染。通過本領域技術已知的方法製備用於向哺乳動物、適宜地向人類、小鼠、大鼠或兔 子施用的純化的N0MV，所述方法可以包括過濾以將溶液滅菌、稀釋該溶液、添加佐劑和穩定 該溶液。本發明的疫苗可以通過多種途徑向人類或動物施用，包括但不限於，例如非腸道 (例如肌內或透皮)、鼻內、口、局部或本領域技術人員已知的其它途徑。下文使用的術語 非腸道包括靜脈內、皮下、真皮內、肌內、動脈內注射，或輸注技術。疫苗可以是單劑製備物 的形式或多劑瓶裝形式，其可用於大規模免疫項目。製備和使用疫苗的適宜方法可以參見 Remington' s Pharmaceutical Scien ces,Mack Publishing Co. ,Easton,Pa. ,0sol(ed.) (1980)禾口 New Trends in Developments in Vaccines, Voller 等人(編)，University Park Press, Baltimore, Md. (1978)，通過引用併入。本技術的疫苗組合物通常以非腸道方式、以包含標準的熟知的非毒性的生理上可 接受的載體、佐劑和/或介質的劑量單元製劑的形式施用。本技術的疫苗組合物還可以包含一種或多種佐劑。「佐劑」是指這樣的物質當與 特異性疫苗抗原一起使用時，其增強、加速或延長抗原的抗原特異性免疫應答，但是當單獨 使用時，其不會刺激產生免疫應答。合適的佐劑包括無機或有機佐劑。合適的無機佐劑包 括但不限於，例如，鋁鹽，例如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁(優選是氫氧化鋁)，但也可 以是鈣鹽(特別是碳酸鈣)、鐵或鋅，或者可以是醯基化的酪氨酸的不溶性懸浮液，或醯基化的糖，陽離子或陰離子衍生的多糖或聚磷嗪。其它合適的佐劑是本領域技術人員已知的。 還可以使用合適的Thl佐劑系統，並且包括但不限於，例如，單磷醯脂A，LPS的其它非毒性 衍生物，以及，單磷醯脂A (例如3-鄰位-脫醯基的單磷醯脂A (#D-MPL)與鋁鹽的組合。其它的適宜的佐劑的實例包括但不限於，MF59、MPLA、結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)、百曰咳鮑特菌(Bordetella pertussis)、細菌月旨多糖、 氨基烷基葡萄糖胺磷酸酯化合物(AGP)或其衍生物或類似物，可以從Corixa(Hamilton， Mont.)獲得，且描述於美國專利號6，113,918 ；例如，2_[ (R)-3-十四醯氧基十四醯氨 基]乙基、2-脫氧-4-0-膦醯-3-0- [ (R) -3-十四醯氧基十四醯基]-2- [ (R) _3_十四醯 氧基十四醯氨基]-b_D-吡喃葡萄糖苷、MPL (3-0-脫醯基的單磷醯脂A)(可以從Corixa 獲得)，描述於美國專利號4，912，094，合成的多核苷酸例如含有CpG基序的寡核苷酸 (美國專利號6，207，646)，COG-ODN (CpG寡脫氧核苷酸)，多肽，皂甙，例如Quil A或 STIMUL0N QS-21 (Antigenics, Framingham, Mass.)，描述於美國專利號 5，057，540，百日 咳毒素(PT)，或大腸桿菌熱不穩定性毒素(LT)，尤其是LT-K63，LT-R72，CT-S109, PT-K9/ G129 ；參見，例如國際專利公開號W093/13302和WO 92/1擬65，霍亂毒素(野生型或突變形 式)。或者，各種油製劑，例如硬脂醯酪氨酸(ST，參見美國專利號4，258，029)，被稱為MDP 的二肽，皂甙，霍亂毒素B亞基(CTB)，來自大腸桿菌的熱不穩定的腸毒素(LT)(已經開發了 遺傳上類毒素的突變體LT)，和Emulsome (Pharmos, LTD.，Rehovot, Israel)。各種細胞因子 和淋巴因子適合用作佐劑。一種這樣的佐劑是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)， 其核苷酸序列描述於美國專利號5，078，996。細胞因子白細胞介素-12(IL-12)是另一種佐 劑，其描述於美國專利號5，723，127。已經表明其它的細胞因子或淋巴因子具有免疫調節 活性，包括但不限於白細胞介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18，幹擾 素-α、β和Y、粒細胞集落刺激因子，和腫瘤壞死因子α和β，它們適合用作佐劑。可以將疫苗組合物凍幹以產生針對腦膜炎奈瑟球菌的乾燥形式的疫苗，以便易於 運輸和儲存。此外，可以以混合疫苗的形式來製備疫苗，所述混合疫苗含有包含來自上文 描述的經遺傳改變的菌株的蛋白的N0MV，以及至少一種其它的抗原，只要該添加的抗原不 幹擾疫苗的有效性並且不以加和或協同方式增加副作用和不利反應。疫苗可以與化學部 分聯合，所述化學部分可以改善疫苗的溶解性、吸收、生物半衰期等。所述部分還可以降低 疫苗的毒性、消除或減弱疫苗的任何不想要的副作用等。能夠介導此類效應的部分公開於 Pharmaceutical Sciences (1980) 0將此類部分偶聯至分子的程序是本領域熟知的。疫苗可以儲存於密封的瓶、安瓿等容器中。本發明的疫苗一般可以通過噴霧的形 式施用，用於鼻內給藥；或者通過鼻滴液、吸入劑、扁桃體上的拭子、或作為膠囊、液體、懸浮 液或西也劑用於口服給藥。在疫苗是乾燥形式的情況下，在施用前將疫苗溶解於或懸浮於 滅菌的蒸餾水。優選使用任何惰性載體，例如鹽水、磷酸鹽緩衝液、或者NOMV疫苗在其中具 有適宜的溶解性的任何此類載體。本技術的疫苗組合物可以包括載體。如果處於溶液或液體氣霧劑懸浮液中，合適 的載體可以包括但不限於，鹽溶液、蔗糖溶液，或其它藥學上可接受的緩衝液。氣霧劑溶液 還可以包含表面活性劑。可以使用的可接受的介質和溶劑包括水、林格氏溶液、和等滲氯化鈉溶液，包括磷 酸鹽、乳酸鹽緩衝的鹽溶液、Tris等。另外，無菌的、不易揮發的油常規地用作溶劑或懸浮介質，包括但不限於，例如，合成的單-或雙-甘油酯。此外，脂肪酸例如油酸可用於製備可 注射製劑。可注射製劑，例如無菌的可注射水性或油性懸浮液，是使用適當的分散劑或潤溼 劑和懸浮劑根據已知技術配製的。無菌的可注射製劑也是處於非毒性非腸道可接受的稀釋 劑或溶劑中的無菌的可注射溶液或懸浮液，例如，1，3_ 丁二醇中的溶液。通過參考以下實施例可以更好地理解本文描述的技術及其優點。提供這些實施例 是為了描述本技術的具體實施方式
。通過提供這些具體實施例，本申請人不因此限制本技 術的範圍和精神。本領域技術人員將理解，本文描述的技術的完整範圍包括本說明書隨附 的權利要求所定義的主題以及這些權利要求的任何變體、修飾或等同物。實施例實施例1.經遺傳修飾的腦膜炎奈瑟球菌疫苗菌株的衍生和包含經遺傳修飾的疫 苗菌株的外膜蛋白的NOMV的生產對親代菌株8570進行5種遺傳修飾，獲得經遺傳修飾的菌株8570H0PS-G1，所述 親代菌株經過該菌株的來源實驗室的多位點酶電泳分析並且確定屬於ET-5克隆複合物 (Caugant等人)。在進行遺傳修飾之前，對PorA可變區進行測序分類，並確認LOS的免疫 型。菌株8570是ET-5克隆4 :P1. 19，15 :L7v，ft~oB3(ST4)Tbp2II型。按照以下描述，對該 菌株依次進行5個遺傳修飾1)在opaD基因座插入不同的第二 porA基因，敲除opaD基因。基於pUC 19的質 SpA 18. 4在插入子中沒有抗生素抗性標誌物，將該質粒用於把第二porA基因插入到opaD 基因座的染色體中，通過以插入子替換基因中部的IOObp序列而使opaD失能。插入子含有 新的來自菌株M4410(B 15 :PI.22,14)的porA基因，並將其置於來自菌株H44/76 WporA 啟動子之後。得到的porA型是Pl. 19，15 :P1. 22，14，其含有兩個porin A基因。2)從1中獲得的表達第二 PorA的菌株開始，通過將opcA的啟動子中的12bp的多 聚-c序列替換為含有c和G核苷酸二者的相同長度的新序列來使外膜蛋白opcA的表達穩 定化。最初的啟動子序列(seq ID no 1)(多聚-G序列為斜體和粗體)5' . . catagttaaaacc tctmaatttggattgtagtcggatatggtmcataacgtaaatmtcgttacgcttacaattatattcttaagcttt CGGGGGGGGGGGGA^ . 3'替換為含有g和c核苷酸二者的具有Noti位點(下劃 線)的修改的啟動子序列(seq ID no 2)5' · · catagttaaaacctctaaaatttggattgtagtcgg atatggtmcataacgtamtaatcgttacgcttacaattatattcttaagctttcCCGCGGCCGCGC ATTTT.3'。選擇的替換序列包含NotI的限制性位點以能夠驗證替換序列的存在。用於轉 化的質粒是p0pc79(seq ID no :4)。質粒插入子不含抗生素標誌物。基於使用針對OpcA的 單克隆抗體進行的菌落印跡來選擇轉化子。待轉化的菌株選擇為OpcA陰性相變體，通過菌 落印跡鑑定強烈的OpcA陽性克隆。通過PCR和限制性酶(NotI)分析將真實轉化子和OpcA 陽性相變體區分開。3)從2中得到的菌株開始，通過將IpxLl基因中部的^Obp的序列替換為含 有tetM抗生素抗性基因的插入子而使基因IpxLl失能，所述基因IpxLl是負責把兩個醯 基-氧-醯基連接的脂肪酸之一連接至LOS的脂A的醯基轉移酶。所述tetM基因獲自質粒 PJS1934，該質粒衍生自轉座子 Tn916(Swartley，等人 1993. Mol. Microbiol. 10 :299-310)。 用於使IpxLl基因失能的質粒是pMn5(kq. ID No. 5)。使用IpxLl基因的起始端和末端的引物通過PCR確認IpxLl基因中插入子的存在，該PCR產生3. 3kbp的擴增子。4)從步驟3得到的菌株開始，通過在nspA基因座中插入GNA 1870變體1基因的 第二個拷貝(敲除NspA的表達)來增加保守性外膜蛋白GNA 1870(變體1) (FHBP v. 1)的 表達。新插入的基因是插入子的一部分，所述插入子含有慶大黴素抗生素抗性基因、具有 IPTG-可誘導的Ptac啟動子的大腸桿菌Iac操縱子、GNA1870變體1基因和rrnB終止子， 所用的質粒顯示於圖19c和kq. ID No. 6。基於PUC19的質粒pBE/GNA1870/101用於轉化 和同源重組，以把GNA 1870變體1基因插入到修飾的菌株中。按照表1中描述的特徵構建 PBE/GNA1870/101 質粒 plasmid (7687b. p.)(序列見 kq. ID No. 6)。表 權利要求
1.包含原始外膜囊泡的疫苗，所述原始外膜囊泡獲自經過遺傳修飾以提供廣泛保護的 至少兩種腦膜炎球菌菌株，其中所述原始外膜囊泡包括基於PorA、LOS和保守性外膜蛋白 的三組不同抗原；並且其中所述經遺傳修飾的菌株被修飾為提供基於lpxLl、synX和IgtA 基因滅活的增強的安全性。
2.權利要求1的疫苗，其中每種菌株表達的LOS具有不同的LOS核心結構並具有由葡 萄糖和半乳糖組成的α鏈。
3.權利要求1的疫苗，其中每種菌株表達基於B群病例分離體中最常見的PorA亞型選 擇的至少兩種不同的PorA亞型蛋白或亞型表位。
4.權利要求1的疫苗，其中具有誘導殺菌抗體能力的不同的保守性表面蛋白在每種菌 株中過表達並且所述蛋白選自FHBP(GNA1870)變體1、FHBP變體2和FHBP變體3 ；NadA ； App ；NspA ； TbpA 禾口 TbpB0
5.來自三種經遺傳修飾的、抗原性上不同的腦膜炎奈瑟球菌菌株的NOMV的組合，其中 至少一種所述菌株選自(1)H44/76H0PS-DL,其具有下列遺傳修飾或特徵 基因synX、IpxLl和IgtA的滅活；在opaD的位置插入第二 porA基因(亞型Pl. 7-1,1)；NadA增強的表達；和Opc和PorA的穩定高表達；(2)8570HOPS-GaL,其具有下列遺傳修飾或特徵 基因synX、IpxLl和IgtA的滅活；在opaD的位置插入第二 porA基因； 因子H結合蛋白變體1的增強的表達；和 PorA和Opc的穩定高表達；和(3)B16B6HPS-G2A,其具有下列遺傳修飾或特徵 基因synX、IpxL 1和IgtA的滅活；在opaD的位置插入第二 porA基因； 因子H結合蛋白變體2的增強的表達；和 PorA和Opc的穩定高表達。
6.權利要求5的疫苗菌株的組合，其中所述菌株H44/76H0PS-DL衍生自ET-5野生型菌 株 H44/76(B 15 :P1. 7，16 :L，3，7 :P5. 5，C)。
7.權利要求5的疫苗菌株的組合，其中所述菌株SSTOHOPS-GiL衍生自ET-5野生型菌 株 8570 (B 4 :P 1. 19，15 :L3，7v :Ρ5· 5，11，C)。
8.權利要求5的疫苗菌株的組合，其中所述菌株Β16Β6HPS-G2L衍生自ΕΤ-5野生型菌 株 B16B6(B :2a :P 1. 5,2 :L2 :Ρ5· 1,2,5)。
9.權利要求1的疫苗，其中從壓縮的細胞或從耗盡的培養基中製備N0MV，不暴露於去 汙劑或變性溶劑。
10.權利要求1的疫苗，其中所述疫苗懸浮於作為賦形劑的5%葡萄糖中。
11.權利要求1的疫苗，其中所述NOMV與一種或多種佐劑混合，所述佐劑包括氫氧化鋁 或磷酸鋁、MF 59、CPG-ODN 或 MPLA。
12.使用肌內和/或鼻內施用的權利要求1的疫苗以進行針對腦膜炎球菌疾病的免疫 的方法。
13.使用肌內和/或鼻內施用的權利要求1的疫苗以進行針對B群腦膜炎球菌疾病的 免疫的方法。
14.針對腦膜炎球菌疾病的疫苗組合物，其包含來自一種或多種經遺傳修飾的腦膜炎 奈瑟球菌菌株的原始外膜囊泡(NOMV)，其中所述一種或多種經遺傳修飾的菌株經過下列修 飾i.synX基因的滅活，ii.IpxLl基因的滅活，iii.每種菌株中IgtA基因的滅活，從而導致表達短的或截短的缺少四糖「乳糖-N-新 四糖」的脂寡糖(LOS)，和iv.在opa基因的位置插入至少一個抗原性上不同的第二porA基因。
15.權利要求14的疫苗組合物，其中所述經遺傳修飾的菌株還包含至少一種次要的保 守性外膜蛋白的增加的或穩定的表達。
16.權利要求14-15任一項的疫苗組合物，其中所述經遺傳修飾的菌株還包含至少一 種外膜蛋白的穩定的表達，其中所述外膜蛋白選自Opc和PorA。
17.權利要求14-16任一項的疫苗組合物，其中所述至少一個抗原性上不同的第二 PorA基因表達至少一種PorA亞型蛋白或亞型表位，其選自腦膜炎B群分離體的最常見的 PorA亞型。
18.權利要求15-17任一項的疫苗組合物，其中所述至少一種次要的保守性外膜蛋白 選自 FHBP (GNA1870)變體 1、FHBP 變體 2、FHBP 變體 3 ；NadA ；App ；NspA ；TbpA 和 B。
19.腦膜炎奈瑟球菌亞型B菌株的經遺傳修飾的疫苗菌株，其包含H44/76H0PS-D菌株。
20.腦膜炎奈瑟球菌亞型B的經遺傳修飾的疫苗菌株，其衍生自包含以下遺傳修飾的 H44/76 菌株i)synX基因的滅活，ii)IpxLl基因的滅活，iii)IgtA基因的滅活，iv)在opaD基因的位置插入第二porA基因，ν)相對於原始菌株，NadA的增強的表達，和vi)Opc和PorA蛋白的穩定的增強的表達。
21.權利要求19或20的經遺傳修飾的菌株，其中所述菌株H44/76H0PS-DL衍生自ΕΤ-5 野生型菌株 Η44/76 (B 15 :Ρ1· 7，16 :L，3，7 :Ρ5· 5，C)。
22.腦膜炎奈瑟球菌亞型B的經遺傳修飾的疫苗菌株，其包含菌株8570H0S-G1。
23.腦膜炎奈瑟球菌亞型B菌株的經遺傳修飾的疫苗菌株，其衍生自包含以下遺傳修 飾的8570 i)synX基因的滅活，ii)IpxLl基因的滅活，iii)IgtA基因的滅活，iv)在opaD基因的位置插入第二porA基因，ν)因子H結合蛋白變體1的增強的表達，和vi)PorA和Opc蛋白的穩定的增強的表達。
24.權利要求22或23的經遺傳修飾的菌株，其中所述經遺傳修飾的菌株衍生自ΕΤ-5 野生型菌株 8570 (B 4 :Ρ 1. 19，15 :L3，7v :Ρ5· 5，11，C)。
25.腦膜炎奈瑟球菌亞型B的經遺傳修飾的疫苗菌株，其包含Β16Β6HPS-G2A菌株。
26.腦膜炎奈瑟球菌亞型B的經遺傳修飾的疫苗菌株，其衍生自包含以下遺傳修飾的 Β16Β6 i)synX基因的滅活，ii)IpxLl基因的滅活，iii)IgtA基因的滅活，iv)在opaD基因的位置插入第二porA基因(亞型Pl. 22-1，4)，ν)因子H結合蛋白變體2的增強的表達，和vi)PorA和Opc蛋白的穩定的增強的表達。
27.權利要求25或沈的經遺傳修飾的菌株，其中所述經遺傳修飾的菌株衍生自ΕΤ-37 野生型菌株 B16B6(B :2a :P 1. 5,2 :L2 :Ρ5· 1,2,5)。
28.權利要求19-27任一項的經遺傳修飾的菌株，其中所述菌株在鐵缺陷型培養基中 生長。
29.權利要求19- 任一項的經遺傳修飾的菌株，其中通過在滅活基因的序列內插入 藥物抗性基因使synX基因、IpxLl基因或IgtA基因滅活。
30.包含來自一種或多種權利要求20-29任一項的經遺傳修飾的菌株的NOMV的疫苗組 合物。
31.權利要求30的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物包含來自兩種或更多種經遺傳修 飾的菌株的NOMV。
32.
33.權利要求30的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物包含來自三種或更多種經遺傳修 飾的菌株的NOMV。
34.權利要求1-18和30-33任一項的疫苗組合物，其中所述NOMV從壓縮的細胞或從耗 盡的培養基中製備，不暴露於去汙劑或變性溶劑。
35.權利要求1-18和30-33任一項的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物懸浮於作為賦 形劑的5%的葡萄糖中。
36.權利要求1-18和30-33任一項的疫苗組合物，其中所述NOMV與一種或多種佐劑混合。
37.權利要求1-18和30-33任一項的疫苗組合物，其中所述經遺傳修飾的菌株改變為 表達鐵攝入蛋白。
38.針對腦膜炎球菌疾病的疫苗，其包含多種原始外膜囊泡(NOMV)，其中至少一些所 述NOMV基本上沒有表達或脂寡糖(LOS)的唾液酸化；包含含有脂A的L0S，所述脂A具有 五醯基結構；並包含至少一種次要的保守性外膜蛋白的增加的表達，其中所述次要的保守 性外膜蛋白選自誘導殺菌抗體的蛋白。
39.權利要求38的疫苗，其中所述次要的保守性外膜蛋白選自NadA、因子H結合蛋白 (FHBP)變體1和FHBP變體2。
40.權利要求38的疫苗，其中至少一些NOMV包含短的或截短的基本上不含四糖「乳 糖-N-新四糖(LNnT)，，的LOS。
41.權利要求38的疫苗，其中至少一些NOMV包含兩種或更多種不同的PorA蛋白。
42.權利要求43的疫苗，其中所述至少兩種或更多種不同的PorA蛋白選自腦膜炎奈瑟 球菌B亞型菌株的最常見菌株。
43.在動物或人中引發針對腦膜炎球菌疾病的免疫應答的方法，其包括向動物或人施 用權利要求1-18和30-33任一項的組合物，以進行針對腦膜炎球菌疾病的免疫。
44.權利要求43的方法，其中所述疫苗用於針對B群腦膜炎球菌疾病的免疫。
45.製備用於針對腦膜炎球菌疾病的疫苗的經遺傳修飾的腦膜炎奈瑟球菌菌株的方 法，包括以下步驟a)選擇能夠被遺傳修飾的腦膜炎球菌B型菌株；b)通過滅活synX基因對該菌株進行遺傳修飾；c)通過滅活IpxLl基因對該菌株進行遺傳修飾；d)通過滅活IgtA基因對該菌株進行遺傳修飾；和e)通過增加一種或多種次要的保守性外膜蛋白對該菌株進行遺傳修飾。
46.權利要求46的方法，還包括以下步驟通過將至少一個抗原性上不同的第二porA 基因插入到opa基因的開放讀碼框中而對該菌株進行遺傳修飾。
47.權利要求45或46的方法，還包括以下步驟通過將至少一種外膜蛋白的啟動子內或開放讀碼框內的多聚C序列替換為包含G和C 核苷酸的序列而對該菌株進行遺傳修飾，以穩定表達或過表達所述至少一種外膜蛋白。
48.製備針對腦膜炎球菌疾病的疫苗的方法，包括以下步驟a)培養包含一種或多種選自下列的修飾的腦膜炎奈瑟球菌的經遺傳修飾的菌株i.synX基因的滅活，ii.IpxLl基因的滅活，iii.IgtA基因的滅活，iv.在opa基因的位置插入至少一個抗原性上不同的第二porA基因，v.至少一種次要的保守性外膜蛋白的增強的或穩定的表達，和vi.至少一種外膜蛋白的穩定的表達；b)使用a)的培養的菌株接種發酵器中的培養基，通過發酵擴增培養物；c)滅活發酵的培養物；d)通過持續流動離心法收集培養的腦膜炎奈瑟球菌細胞並收集細胞糊；e)從細胞糊中分離NOMV；和f)將NOMV重懸於適合於疫苗施用的緩衝液或載體。
全文摘要
本發明提供了包含來自至少一種經遺傳修飾的奈瑟球菌菌株的原始外膜囊泡(NOMV)的疫苗組合物，其提供針對腦膜炎球菌疾病、更優選B亞型腦膜炎球菌疾病的保護性免疫力。本發明還提供了針對腦膜炎球菌疾病對動物或人進行免疫的方法，包括施用本發明的疫苗組合物。
文檔編號A61K39/116GK102105166SQ200980125861
公開日2011年6月22日 申請日期2009年6月1日 優先權日2008年5月30日
發明者B·約寧, D·施米爾, E·E·莫蘭, M·多內茨, R·馬奎斯, W·D·佐林格 申請人:由沃爾特·裡德軍隊研究院軍隊秘書處為代表的美利堅合眾國