高表達發酵單胞菌屬啟動子的製作方法

2023-05-01 05:03:11

專利名稱：高表達發酵單胞菌屬啟動子的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物學和基因工程領域。更具體地講，鑑定了引導細菌中的嵌合基 因表達的新啟動子。
背景技術：
通過微生物來生產乙醇提供了一種替代化石燃料的可供選擇的能源，因此成為當 前研究的重要領域。希望微生物能夠利用木糖作為碳源生產乙醇以及其他有用的產物，因 為木糖是水解的木質纖維質材料的主要戊糖，因此能提供豐富可用的低成本碳底物。運動 發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)和其他乙醇細菌天然不利用木糖，可通過導入基因將它 們遺傳工程化以利用木糖，導入的基因編碼1)木糖異構酶，該酶催化木糖轉化成木酮糖； 2)木酮糖激酶，它將木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)轉酮醇酶；和4)轉醛醇酶。已經成功地工程化了運動發酵單胞菌菌株用於木糖代謝(US5514583、US 5712133、US 6566107、WO 95/28476，Feldmann 等人(1992) Appl Microbiol Biotechnol 38 =354-361, Zhang 等人(1995) Science267 240-243)，以及工程化 了棕櫚發酵細 菌(Zymobacter palmae)菌株用於木糖代謝(Yanase 等人(2007)Appl. Environ. Mirobiol. 73 :2592_2599)。然而工程化菌株通常在木糖上生長和生產乙醇不如在葡萄糖上 一樣好。就這種工程化而言，編碼用於木糖代謝的異源蛋白的基因已經從在運動發酵單胞 菌細胞中有活性的啟動子上表達，通常是運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟 動子或運動發酵單胞菌烯醇酶基因的啟動子。工程化以利用木糖的菌株已經適應在木糖培 養基上連續傳代，所得菌株具有改善的木糖利用率，如美國專利7，223，575以及共有的和 共同未決的美國專利申請公布US20080286870所描述。然而仍未確定該改善的遺傳基礎。需要具有改善的木糖利用率的發酵單胞菌屬的遺傳工程化菌株和其他乙醇細菌。 申請人:已經發現突變體啟動子具有提高的活性，這可用於表達木糖利用基因，其活性賦予 包含這些啟動子的工程化菌株改善的木糖利用率。該啟動子也可用於表達其他基因。

發明內容
本發明涉及分離的突變型啟動子，所述啟動子用於表達基因，即在發酵單胞菌屬、 發酵細菌屬、以及相關細菌中的嵌合基因，它們引導的基因表達水平比由運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(Pgap)的天然啟動子引導的基因表達水平更高。該突變型啟 動子是運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子的衍生物，並且由於特定突變的 存在而具有提高的活性。該啟動子可用於基因工程以表達編碼區或表達調控RNA。由這些 啟動子引導的木糖異構酶的編碼區表達導致利用木糖的運動發酵單胞菌在包含木糖的培 養基中的生長改善。本文所述的是包含運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子的分離的 核酸分子，所述啟動子在選自-190位、-89位、或-190和-89位兩者的位置上具有核苷酸 取代；其中所述位置編號是相對於運動發酵單胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸 脫氫酶的天然ATG翻譯起始密碼子。本文還描述了以下內容包含上述分離的核酸分子並可操作地連接至異源核酸分 子的嵌合基因；包含上述核酸分子的載體以及對包含導入到細胞中的上述核酸分子的細菌 細胞進行基因工程化的方法。附圖簡沭和序列描述可通過下列發明詳述、附圖、以及結合作為本專利申請一部分的序列描述，能更全 面地理解本發明的多個實施方案。

圖1示出轉酮醇酶(A)、轉醛醇酶(B)、木糖異構酶(C)、和木酮糖激酶(D)的酶檢 測分析方法。圖2是在用PgapxylAB轉化的T2C、T3C、T4C、和T5C品系中的木糖異構酶(XI)和 木酮糖激酶(XK)的活性示意圖。圖3是在用PgapxylAB轉化的T2C、T3C、T4C、和T5C品系中的轉醛醇酶(TAL)和 轉酮醇酶(TKT)的活性示意圖。圖4是選擇的適合利用木糖菌落的理論乙醇產率％和木糖利用率％示意圖。圖5是適合利用木糖的菌株在具有5%葡萄糖(RMG)的RM中生長50代之前和之 後，在具有5%木糖(RMX5%)的RM(豐富培養基)上生長70小時時的生長示意圖。圖 6 示出以下質粒的圖譜(A)pZB188 ； (B) pZB188/aadA ；和(C)pZB188/ aadA-GapXylA ；以及(D)大腸桿菌木糖異構酶表達盒PgapXylA的示意圖。圖 7 示出以下質粒的圖譜(A) pM0D -2- ； (B) pMOD-Linker ；和(C) pMOD-Linker-Spec。圖8示出質粒pLDHSp-9ffff的圖譜。圖 9 示出質粒 pM0D-Linker-Spec-80IGapXylA 的圖譜。圖 10 示出以下質粒的圖譜(A) pM0D-Linker-Spec-80 IGapXylA ； (B)pZB188/ aadA-GapXylA ；禾卩(C) pZB188/aadA_801GapXylA。圖11示出包含Pgap-大腸桿菌木糖異構酶表達質粒(X1、X2和X2)的三個菌株和 包含對照質粒(C1、C2和C3)的三個菌株在包含木糖的培養基中的生長曲線(0D600對時 間)。圖12示出ZW641、ZW658、X1和Cl菌株在包含木糖的無奇放線菌素培養基中的生 長曲線(0D600對時間)，(A)對線性尺度作圖，而⑶對對數尺度作圖。圖13示出具有整合801Pgap-XylA(#8-2、#8_4、#8-5)的三個菌株和具有整合 641Pgap-XylA(#6-l、#6-3、#6-5)的三個菌株與菌株ZW658相比較的生長曲線(0D600對時間)，(A)對線性尺度作圖，而(B)對對數尺度作圖。圖 14 示出 pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL 的質粒圖譜。圖 15 示出(A)pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL ； (B)pZB188aadA_641GapRPI ； 和(C)pZB188aadA-801GapRPI 的質粒圖譜。圖16示出來自具有表達RPI的不同啟動子的菌株的全細胞蛋白的染色蛋白凝膠。根據下面的詳細描述和附帶的序列描述可以更充分地理解本發明，下面的詳細描 述和所附的序列描述形成了本申請的一部分。下面的序列遵M 37C. F. R. 1. 821-1. 825 ( "Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules」(對含有核酸序列和/或胺基酸序列公開的專利申請的 要求-序列規則))，並且符合WorldIntellectual Property Organization(世界智慧財產權 組織，WIP0) ST. 25標準(1998)以及EPO和PCT的序列清單要求(規貝丨J 5. 2和49. 5 (a-bis) 以及Administrative Instructions (行政指令)的第208節和附錄C)。用於核苷酸和氨 基酸序列數據的符號和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中示出的規則。SEQ ID NO=I是來自運動發酵單胞菌的CP4菌株的ZmPgap的核苷酸序列。SEQ ID NO :2是來自運動發酵單胞菌的ZM4菌株的ZmPgap的核苷酸序列。SEQ ID NO 3是來自pZB4的ZmPgap的核苷酸序列，它也位於菌株ZW641和8XL4 的PgapxylAB操縱子中。SEQ ID NO 4是來自菌株ZW658的改善Pgap的核苷酸序列。SEQ ID NO :5是來自菌株8b的改善Pgap的核苷酸序列。SEQ ID NO 6是在Pgap的pZB4突變體中的具有-190 (ZW658)和-89 (8b)突變的 改善Pgap的核苷酸序列。SEQ ID NO 7是在Pgap的CP4突變體中的具有來自ZW658的-190突變的改善 Pgap的核苷酸序列。SEQ ID NO 8是在Pgap的CP4突變體中的具有來自8b的-89突變的改善Pgap的 核苷酸序列。SEQ ID NO 9是在Pgap的CP4突變體中的具有-190 (ZW658)和-89 (8b)突變的 改善Pgap的核苷酸序列。SEQ ID NO 10是在Pgap的ZM4突變體中的具有來自ZW658的-190突變的改善 Pgap的核苷酸序列。SEQ ID NO 11是在Pgap的ZM4突變體中的具有來自8b的-89突變的改善Pgap 的核苷酸序列。SEQ ID NO 12是在Pgap的ZM4突變體中的具有-190 (ZW658)和-89 (8b)突變的 改善Pgap的核苷酸序列。SEQ ID NO 13和14是用於擴增包含來自pZB4的甘油醛_3_磷酸脫氫酶基因啟 動子(Pgap)的DNA片段的引物核苷酸序列。SEQ ID NO 15和16是用於擴增包含來自pZB4的tal編碼區的DNA片段的引物 核苷酸序列。SEQ ID NO 17和18是用於擴增包含來自Pgap和tal片段的Pgaptal的DNA片
5段的引物核苷酸序列。SEQ ID NO 19和20是用於擴增包含來自pZB 186的IoxP: :Cm的DNA片段的引
物核苷酸序列。SEQ ID NO :21是pMODPgaptaltktCm質粒的全長核苷酸序列。SEQ ID NO 22和23是用於擴增在接納pMODPgaptaltktCm的轉化體中包含tal和 tkt編碼區的3kb DNA片段的引物核苷酸序列。SEQ ID NO 24是pMODPgapxyIABCm質粒的全長核苷酸序列。SEQ ID NO 25 和 26 是用於擴增來自具有 pMODPgapxyIABCm 的 T2C、T3C、T4C 和 T5C整合子的1.6kb PgapxylA DNA片段的引物核苷酸序列。SEQ ID NO 27和28是用於擴增包含來自ZW641和ZW658的Pgap編碼區的DNA片 段的引物核苷酸序列。SEQ ID NO :29_31是用於對來自ZW641和ZW658的Pgap測序的引物核苷酸序列。SEQ ID NO 32和33是用於擴增包含Speclr-盒的DNA片段的引物核苷酸序列。SEQ ID NO 34是木糖異構酶表達盒PgapXylA的全長核苷酸序列。SEQ ID NO 35和36是用於替代pM0D2_中的不同多克隆位點的寡核苷酸的 核苷酸序列。SEQ ID NO :37 和 38 是用於擴增來自菌株 ZW801-4 禾口 ZW641 的 PgapxylA 區域的引物核苷酸序列，該序列用於插入pMOD-Linker-Spec以分別生成質粒 pM0D-Linker-Spec-80IGapXylA 和 pM0D-Linker-Spec_641GapXylA。SEQ ID NO 39 和 40 是用於擴增來自 pZB188/aadA_641GapXylA 的 Pgap 的引物核 苷酸序列，並且包括運動發酵單胞菌RPI開放閱讀框的前15bp。SEQ ID NO 41和42是用於擴增運動發酵單胞菌RPI開放閱讀框的引物的核苷酸 序列。SEQ ID N0:43是RPI表達盒的全核苷酸序列，該表達盒位於質粒pZB188aadA/ Gap/Zymo RPI/EcoliSL 中。SEQ ID NO 44和45用於擴增包含來自8XL4和8b的Pgap的DNA片段的引物核 苷酸序列。SEQ ID NO 46是用於對來自8XL4和8b的Pgap測序的引物全長核苷酸序列。發明詳述本文所述的是可用於表達細菌細胞中的嵌合基因的新啟動子。申請人已經發現， 運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子的兩個不同突變每個均分別提高由該 啟動子引導的表達水平。一個突變在-190位，第二個突變在-89位，兩個位置都相對於運動 發酵單胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶的天然ATG翻譯起始密碼子。運 動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子包含這些突變中的任何一個或兩者均有， 所述啟動子可用於在細菌細胞中表達異源的、可操作地連接的DNA序列。以下縮寫和定義將用於說明書和權利要求的解釋。如本文所用，術語「包含」、「由...組成」、「包括」、「涵蓋」、「具有」、「含有」、「包容」
或「容納」或其任何其它變型旨在包括非排他的包含物。例如，包含一系列元素的組合物、 混合物、工藝、方法、製品或設備不必僅限於那些元素，而可以包括其它未明確列出的元素，或此類組合物、混合物、工藝、方法、製品或設備固有的元素。此外，除非有相反的明確說明， 「或」是指包含性的「或」，而不是指排他性的「或」。例如，以下任何一種情況均滿足條件A或 B =A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的 (或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。同樣，涉及元素或組分例證(即出現)次數的位於本發明元素或組分前的不定冠 詞「一個」或「一種」旨在是非限制性的。因此，應將「一個」或「一種」理解為包括一個或至 少一個，並且元素或組分的詞語單數形式也包括複數形式，除非有數字明顯表示單數。「基因」指表達特定蛋白質或功能RNA分子的核酸片段，該核酸片段可包含位於編 碼序列之前的調節序列(5'非編碼區)和之後的調節序列(3'非編碼區)。「天然基因」 或「野生型基因」指具有其自身調控序列的天然存在的基因。「嵌合基因」指不是天然基因 的任何基因，包含在天然情況下不是一起存在的調控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可包 括源於不同來源的調控序列和編碼序列，或者包括源於同一來源但以不同於天然存在的方 式排列的調控序列和編碼序列。「內源性基因」指位於生物的基因組內它的天然位置的天然 基因。「外來基因」指正常情況下不存在於宿主生物中的基因，它通過基因轉移導入宿主生 物。外來基因可以包含插入到非天然生物體內的天然基因，或嵌合基因。術語「遺傳構建體」指編碼表達一種或多種特定蛋白或功能RNA分子的核酸片段。 在基因構建體中u基因可以是天然的、嵌合的、或外來的。通常基因構建體將包含「編碼序 列」。「編碼序列」指編碼特定胺基酸序列的DNA序列。「啟動子」或「啟動控制區」指能夠控制編碼序列或功能RNA的表達的DNA序列。一 般來講，編碼序列位於啟動子序列的3'端。啟動子可整個源於天然基因，或者由源於不同 的天然存在的啟動子的不同元件組成，或者甚至包含合成的DNA片段。本領域內的技術人 員應當理解，不同的啟動子可以在不同的組織或細胞類型中，或者在不同的發育階段，或者 響應不同的環境條件而引導基因的表達。通常將在大多數細胞類型中、在大多數情況下引 起基因表達的啟動子稱為「組成型啟動子」。如本文所用，術語「表達」指轉錄和衍生自基因的編碼RNA (mRNA)或功能RNA的穩 定積聚。表達也可指將mRNA翻譯成多肽。「反義抑制」指產生能夠抑制靶蛋白表達的反義 RNA轉錄物。「超表達」指在轉基因生物中產生的基因產物超出在正常生物或未轉化生物中 產生的基因產物的水平。「共抑制」指產生能夠抑制相同的或基本上類似的外源或內源性基 因表達的正義RNA轉錄物或片段(美國專利5，231，020)。如本文所用，術語「信使RNA (mRNA)，，指無內含子並且可以由細胞翻譯成蛋白質的 RNA。如本文所用，術語「轉化」指將核酸片段轉移至宿主生物體內，導致在基因上穩定 遺傳。轉化的核酸可以是宿主細胞中保留的質粒形式，或者一些轉化的核酸可以被整合進 宿主細胞基因組中。含有轉化核酸片段的宿主生物被稱為「轉基因」或「重組」或「轉化」生 物體。如本文所用，術語「質粒」和「載體」是指通常攜帶有不屬於細胞中心代謝的部分 的基因的染色體外元件，並且常常是環狀雙鏈DNA分子的形式。這類元件可以是源自任何 來源的自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或單鏈或雙鏈DNA或RNA的核苷酸序列(線 性或環狀)，其中多個核苷酸序列已連接或重組進入一種獨特構建體中，該獨特構建體能夠將所選基因產物的啟動子片段和DNA序列與相應的3'末端非翻譯序列一起引入細胞中。術語「可操作地連接」指單個核酸片段上的核酸序列的關聯，使得其中一個核酸序 列的功能受到另一個核酸序列的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達(即，該編 碼序列受到該啟動子的轉錄控制)時，則該啟動子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列 可以以有義或反義的取向可操作地連接至調節序列。術語「選擇性標記」指一種鑑定因子，通常是抗生素或化學藥品抗性基因，該因子 能基於標記基因的效應，即，對抗生素的抗性進行選擇，其中所述效應用於追蹤遺傳的受關 注核酸和/或用於鑑定遺傳了受關注核酸的細胞或生物。術語「異源的」指不天然存在於受關注的位點。例如「異源基因」是指不天然存在 於宿主生物中的基因，它通過基因轉移導入宿主生物。例如存在於嵌合基因中的異源核酸 分子是不與嵌合基因中的其他片段一起天然存在的核酸分子，如具有彼此不天然相關聯存 在的編碼區和啟動子片段的核酸分子。如本文所用，「分離的核酸分子」是RNA或DNA的聚合物，它是單鏈或雙鏈的，任 選地包含合成的、非天然的或改變的核苷酸鹼基。DNA聚合物形式的分離的核酸分子可由 cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個或多個區段構成。術語「運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子」和「ZmPgap」指具有啟 動子活性的核酸分子，它具有天然存在於運動發酵單胞菌基因組中的甘油醛-3-磷酸脫氫 酶編碼區上遊的核苷酸序列。這些術語指運動發酵單胞菌菌株如CP4和ZM4菌株(分別是 SEQ IDNO 1和2)的啟動子以及引導表達的序列和/或長度上的變異體，如pZB4(SEQ ID NO 3)的ZmPgap，所述變異體引導的表達水平無顯著不同。本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域熟知的並且已經在如下文獻中 有所描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F.禾口 Maniatis, T. Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2版；Cold Spring HarborLaboratory : Co Id Spring Harbor, New York, 1989 (Tr 文稱為「Maniatis，，)；以及 Silhavy, Τ. J. , Bennan, Μ. L.禾口 Enquist, L. W. Experiments with GeneFusions ；Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor, New York, 1984 ；以及 Ausubel, F. M.等人，In Current Protocols in MolecularBiology,由 Greene Publishing 禾口 Wiley-Interscience 公布於 1987 年。-3-磷Il脫顏因啟雲力子的發現,運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ZmPgap或Pgap)的啟動子已經被用 於在運動發酵單胞菌和棕櫚發酵細菌中表達嵌合基因。當已經使用ZmPgap表達木糖代謝 基因時，所得木糖利用率通常不如期望的那樣有效。經工程化以表達四個木糖代謝酶(木 糖異構酶、木酮糖激酶、轉酮醇酶、和轉醛醇酶)的重組運動發酵單胞菌菌株具有有限的木 糖利用能力，進一步適應木糖培養基，具有改善的木糖利用率(描述於共有的和共同未決 的美國專利申請公布US20080286870)。如本文實施例3所述，申請人已經發現稱為ZW658 (ATCC#PTA_7858)的改善木糖利 用率的菌株具有提高的木糖異構酶和木酮糖激酶表達，所述酶以操縱子形式被整合進基因 組中，從ZmPgap (PgapxylAB操縱子)中開始表達。申請人已經進一步發現，在PgapxylAB 操縱子的啟動子中有單個的新核苷酸改變，它負責引導可操作地連接的編碼區的表達增加 的啟動子。與ZW658前體菌株中的PgapxylAB操縱子的ZmPgap序列相比，該核苷酸改變是
8相對於菌株ZW658的PgapxylAB操縱子的Pgap序列的新改變，所述前體菌株不具有提高的 木糖異構酶和木酮糖激酶活性。因此具有該單個核苷酸改變的Pgap是改善的啟動子。此外申請人已經發現，運動發酵單胞菌菌株經過用編碼四個木糖利用酶的基 因分別工程化並且分別經改造以具有改善的木糖利用率(菌株8b，描述於美國專利 7，223，575)，該菌株也具有提高的木糖異構酶和木酮糖激酶表達，所述酶以PgapxylAB操 縱子形式被整合進基因組。申請人已經進一步發現，在8b菌株的PgapxylAB操縱子的Pgap 中有單個的新核苷酸改變，所述改變位於與ZW658 Pgap的核苷酸改變不同的位置。基於由 PgapxylAB操縱子編碼的木糖異構酶和木酮糖激酶的表達提高，PgapxylAB操縱子的突變 型Pgap也提供改善的啟動子。在ZW658的Pgap和8b菌株PgapxylAB操縱子中鑑定的新核苷酸改變分別在_190 位和-89位，其相對於運動發酵單胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶天然 ATG翻譯起始密碼子。發現的核苷酸改變在-190位是從G變成T，在-89位是從C變成T。改變鹼基的序列上下遊區域是重要的因素，因為位置編號可由於序列變異而改變。-190位在以下序列中AACGGTATACT G GAATAAATGGTCTTCGTTATGGTATTGATGTTTTT 其中粗體並且用下劃線 標示的G突變成T。該-190位在CP4和ZM4菌株的ZmPgap序列中，但是-189位在pZB4 中，因為在PZB4的啟動子序列中的-21位置上缺失了 T。-89位在以下序列中CGGCATCACGAA C AAGGTGTTGGCCGCGATCGCCGGTAAGTCGGC 其中粗體並且用下劃線標 示的C突變成T。該-89位在CP4和ZM4菌株的ZmPgap序列中，但是-88位在pZB4中，因 為在PZB4的啟動子序列中的-21位置上缺失了 T。本發明的啟動子在ZmPgap中的-190 位、-89位、或者這兩個位置上都具有核苷酸改變。優選地改變是在-190位上從G變成T， 並且在-89位上從C變成T。包含這些突變的本發明啟動子是改善的Pgap。在-190和-89位的其他核苷酸改變可提供活性改善的ZmPgap。此外在啟動子中 其他位置的核苷酸改變可提供活性改善的ZmPgap。ZmPgap的天然存在的序列不是單獨序列，但是序列中可具有一些變異，所述變異 對啟動子功能無顯著影響。對啟動子功能無顯著效應意味著該啟動子序列引導的表達水平 基本上類似於存在於天然運動發酵單胞菌菌株中的ZmPgap引導的表達水平。序列變異可 天然發生在不同分離蛋白或運動發酵單胞菌菌株之間，如CP4和ZM4菌株之間在相對於甘 油醛-3-磷酸脫氫酶(分別是SEQ ID NO 1和2)的天然ATG翻譯起始密碼子的_29位上 的差異，其中在CP4中是A，而在ZM4中是G。除天然存在的序列變異外，不顯著影響功能的核苷酸改變還可在常規操縱程序 期間發生，包括PCR、克隆、轉化、以及菌株生長，這是本領域技術人員已知的。一個實例是 PZB4的ZmPgap，它在-21位置上缺失T。發生在不同天然或工程化菌株中的ZmPgap序列中的、不顯著影響啟動子功能的 任何核苷酸改變可存在於運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子序列中，例如 在pZB4(SEQ ID NO 3)的ZmPgap中的-21位置後缺失T。因此在上述-190位和-89位上 的突變確實影響啟動子功能，即，顯著改善啟動子功能的、在上述-190位和-89位上的突變可在任何具有基本上類似活性(天然水平)的ZmPgap序列中發生，並且可與不影響功能的 突變共發生。具有在-190位和/或-89位上的所述突變的改善Pgap序列的實例包括來自菌株 ZW658 (SEQ ID NO 4)、菌株8b (SEQ ID NO :5)、和來自 pZB4 (SEQ ID NO 6)的雙重突變相同 ZmPgap變異體的啟動子序列。附加的改善Pgap序列的實例是在來自CP4(分別是SEQ ID NO :7、8、和9)的ZmPgap變異體中的_190、_89或雙重突變以及在來自ZM4(分別是SEQ ID NO: 10、11、和12)的ZmPgap變異體中的-190、-89或雙重突變。此外在ZmPgap序列中發生的長度變異基本上不影響啟動子功能。本發明包括改 善的Pgap，它在-190位和/或-89位(相對於運動發酵單胞菌CP4和ZM4菌株中的甘油 醛-3-磷酸脫氫酶的天然ATG翻譯起始密碼子)具有所述的突變，所述位置在添加-190和 /或-89突變之前無顯著活性改變的不同長度ZmPgap中。製備改善的Pgap可通過本領域技術人員已知的任何方法將-190位和/或-89位上的所述突變導 入ZmPgap核酸分子中。例如可合成具有突變和圍繞DNA序列的寡核苷酸並將其克隆到較 大的啟動子DNA片段中以取代無突變的片段。可合成包含該突變和一些鄰近啟動子序列的 引物並用於PCR中以製備啟動子片段。可合成全長啟動子DNA片段使之成為連接到一起的 多個寡核苷酸。可使用定點誘變導入突變。此外可使用來自ZW658或8b菌株的DNA作模 板製備突變啟動子，作為PCR擴增的DNA片段。
_0] 在嵌合基因禾PjH本中的PgaD,導入細If細朐,可將本發明的啟動子可操作地連接至意欲在細菌細胞中表達異源核酸分子，形成 嵌合核酸分子或本發明的嵌合基因。嵌合基因的設計和構建是為本領域技術人員熟知的。 嵌合基因通常包括一個啟動子、一個意欲表達的異源核酸分子、以及3』終止控制區。終止 控制區可來源於不同基因，並且常來自靶宿主細胞天然具有的基因。可操作地連接的異源 核酸分子可為期望在細菌細胞中表達的任何核酸分子，包括例如蛋白或肽的編碼區，或者 用於功能RNA表達的核酸。功能RNA包括例如反義RNA、核酶、和幹擾RNA。此外可構建一 個操縱子，該操縱子包含本文所述的啟動子和多個從該啟動子表達的編碼區。本文所述的啟動子可在嵌合基因中使用以在屬於發酵單胞菌屬或發酵細菌屬的 細菌中表達嵌合基因。嵌合基因可用於表達涉及發酵單胞菌屬或發酵細菌屬產物生產的任 何蛋白。例如一種或多種涉及胺基酸如丙氨酸或山梨醇或木糖醇合成的酶可從具有這些啟 動子的嵌合基因開始表達。嵌合基因可在不利用木糖的天然發酵單胞菌屬或發酵細菌屬菌 株中表達，或者在利用木糖的菌株中表達。本文所述的啟動子還可用於表達與木糖代謝或 另一種代謝途徑有關的酶。本文所述的嵌合基因通常在載體中構建或者轉移到載體中以進行進一步的操 縱。載體為人們所熟知。某些載體能夠在廣泛的宿主細菌中複製並可通過接合進行轉 移。pRK404和三個相關載體pRK437、pRK442、和pRK442(H)的完全註解序列是可用的。這 些衍生物已被證明是在革蘭氏陰性菌中進行遺傳操縱的有用工具(Scott等人，Plasmid 50(1) :74-79(2003))。可在不同靶宿主細胞中使用其他熟知的載體。用於不同宿主的載體實例描述於共 有的和共同未決的美國專利申請公布#舊20070092957 Al，ppll_13中，該文獻以引用方式併入本文。尤其可用於在發酵單胞菌屬中表達的載體能夠在大腸桿菌和發酵單胞菌屬中復 制，如PZB188，它在US 5，514，583中進行了描述。載體可包括用於在細胞中自主複製的質 粒，以及用於運送構建體以將其整合進細菌基因組的質粒。用於DNA整合的質粒可包括轉 座子、與靶細菌基因組同源的核酸序列區域、或者參與整合的其他序列。一種其他類型的載 體可為使用例如可從EPICEN丁RE 商購獲得的系統生產的轉座體。如何選擇合適的載 體用於期望的靶宿主和期望的功能是熟知的。本文所述的啟動子也可在無可操作地連接的核酸分子的載體中構建用於表達， 並且將其整合進內源編碼區附近以置換細菌基因組中的內源啟動子或者添加一個啟動子 至例如操縱子內的編碼區。染色體啟動子置換可使用如Yuan等人(Metab.Eng. (2006)8 79-90)和 White 等人(Can. J. Microbiol. (2007)53:56-62)描述的方法完成。可通過熟知的方法，例如使用凍-融轉化、鈣介導轉化、電穿孔、或接合，將包含本 文所述的啟動子的載體導入細菌細胞中。使用改善PgaD的異源核酸分子的表汰水平提高的嵌合基因表達可使用本文所述的改善Pgap獲得。用改善Pgap和整 合進基因組中的木糖異構酶編碼區構建的嵌合基因如本文實施例8所示，使得運動發酵單 胞菌細胞在木糖培養基上生長改善，所述菌株進行了工程化以表達編碼木糖代謝蛋白的基 因。在木糖上的改善生長如本文實施例3和10所示，與較高水平的木糖異構酶活性和木酮 糖激酶活性有關。利用木糖的運動發酵單胞菌菌株適應在木糖上的較好生長並具有引導木 糖異構酶和木酮糖激酶表達的改善Pgap，具有改善的木糖利用率。木糖異構酶和木酮糖激 酶活性比無引導木糖異構酶和木酮糖激酶表達的改善Pgap的菌株高約4至5倍。本文實施例9中顯示了包含本發明改善Pgap並位於穩定質粒上的嵌合基因的提 高的表達水平。具有可操作地連接至編碼核糖5-磷酸異構酶(RPI)的異源序列的改善Pgap 的嵌合基因產生的RPI蛋白的量比由包含ZmPgap的嵌合基因產生的RPI蛋白的量更高。
實施例實施例示出了本文所述的發明。一般方法本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域熟知的並且已經在如下文 獻中有所描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F.禾P Maniatis, T.的 Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版，Cold SpringHarbor Laboratory Co Id Spring Harbor, NY(1989)(下文稱為 「Maniatis」)；以及 Silhavy，Τ. J.，Bennan, Μ. L.禾Π Enquist，L. W.， Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory ColdSpring Harbor, NY (1984)；以及 Ausubel, F. Μ.等人，Current Protocolsin Molecular Biology, Greene Publishing Assoc.禾口 Wiley-Interscience 出版，Hoboken, NJ(1987)。縮寫的含義如下「kb」指千鹼基，「bp」指鹼基對，「nt」指核苷酸，「hr」指小時， 「min」指分鐘，"sec"指秒鐘，「d」指day (s)，「L」指升，「mL」指毫升，「 μ L」指微升，「 μ g」 指微克，「ng」指納克，「mM」指毫摩爾，「 μ Μ」指微摩爾，「nm」指納米，「 μ mol，，指微摩爾， 「pmol」指皮摩爾，「Cm」指氯黴素，"Cmr"指氯黴素抗性，「Cms」指氯黴素敏感，"Spr"指奇放 線菌素抗性，"Sps"指奇放線菌素敏感，「XI」為木糖異構酶，「XK」為木酮糖激酶，"TAL"為轉醛醇酶，「TKT」為轉酮醇酶，「EFT」指流逝的發酵時間，「冊」指包含10g/L酵母提取物加 2g/L KH2PO4的豐富培養基，「MM」指包含10g/L酵母提取物，5g/L胰蛋白腖，2. 5g/L (NH4) 2S04 和0. 2g/L KH2PO4的配合培養基。製備發酵單胞菌屬的細胞游離提取物用於酶分析法細胞在50mL RM+2%葡萄糖中，在30°C下過夜生長至OD6tltl為1. 0-1. 2。在4°C、 4500rpm下離心10分鐘收穫細胞。棄去上清液，用25mL冰凍超聲波降解緩衝液(IOmM Tris, pH7. 6，IOmM MgCl2)洗滌細胞沉澱物，隨後在4500rpm離心10分鐘。將沉澱物重懸在 2. 0-2. 5mL超聲波降解緩衝液加ImM 二硫蘇糖醇的溶液中。將500 μ L等分試樣在4°C下， 在印pendorf離心機中離心1分鐘。棄去大多數上清液，留下約10-20 μ L以防止沉澱物變 幹。冷凍細胞並貯存在約80°C直至進行分析。在分析前，解凍細胞並用500 μ L的超聲波 降解緩衝液，加ImM 二硫蘇糖醇的重懸。以62%的佔空比超聲處理混合物2χ 45秒鐘，使 用Branson超聲波細胞破碎儀450輸出對照2，使樣本在兩次超聲波降解之間冷卻約3_5分 鍾。樣本在Beckman離心機中，在4°C、14，OOOrpm下離心60分鐘。將上清液轉移到新管中 並保存在4°C。使用Pierce BCA檢測分析法測定蛋白濃度。轉酮醇酶(TKT)測定通常首先進行，因為該酶比其他酶更不穩定。TKT測定的圖表 如圖IA中所示。在微板測定中，在30°C下將20 μ L的細胞游離提取物加到每個孔的反應混合物 中，該混合物包括以下終濃度的組分0. 37mM NADP,50mM TrisHCl pH7. 5,8. 4mM MgCl2, 0. ImM TPP ((焦磷酸硫胺素)，0. 6mM E4P (赤蘚糖-4-磷酸)，4mM BHP ( β -羥基丙酮酸)， 4U/mL PGI (磷酸葡糖異構酶)，和4U/mL G6PD (6-磷酸葡萄糖脫氫酶)。在平板閱讀器上讀 數A34。3-5分鐘。如下計算TKT活性1單位對應於形成1微摩爾D-果糖6-磷酸/分鐘，溫度為30°C。U (微摩爾/分 鍾)=比降(dA34Q/分鐘)X反應體積(μ L) /6220/0. 55cm(NADP — NADPH摩爾數是6220 A34tl每摩爾每L，在Icm比色杯中)(微板中的路徑長度200μ L每孔=0. 55cm)比活性(微摩爾/分鐘-毫克)=微摩爾/分鐘/蛋白濃度(mg)轉醛醇酶(TAL)測定的基礎如圖IB所示。在微板測定中，在30°C下將20 μ L的 細胞游離提取物加到每個孔的反應混合物中，該混合物包括以下終濃度的組分0. 38mM NADH，87mM 三乙醇胺，17mMEDTA，33mM F6P (果糖-6-磷酸鹽)，1. 2mM E4P (赤蘚糖-4-磷 酸)，2. OU/mL⑶H(甘油3-磷酸脫氫酶)，和20U/mL TPI (磷酸丙糖異構酶)。將平板培養 5分鐘，然後讀數A34(i3-5分鐘。如下計算TAL活性1單位對應於形成1微摩爾D-甘油醛每分鐘，溫度為30°C。U(微摩爾/分鐘)= 比降(dA340/ 分鐘)X 反應體積(μ L)/6220/0. 55cm(NADH — NAD摩爾數是6220A34(1每摩爾每L，在Icm比色杯中)(微板中的路徑長度200μ L每孔=0. 55cm)比活性(微摩爾/分鐘-毫克)=微摩爾/分鐘/蛋白木糖異構酶(XI)測定的基礎如圖IC所示。在微板測定中，在30°C下將20 μ L的 細胞游離提取物加到每個孔的反應混合物中，該混合物包括以下終濃度的組分0. 256mM NADH, 50mM木糖，IOmMMgSO4, IOmM三乙醇胺，和lU/mL SDH(山梨醇脫氫酶)。在平板閱讀器上讀數A3403-5分鐘。如下計算XI活性1單位XI對應於形成1微摩爾D-木酮糖每分鐘，溫度為30°C。U (微摩爾/分鐘) =比降(dA340/ 分鐘)X 反應體積(μ L) /6220/0. 55cm(NADHP — NAD摩爾數是6220 A34tl每摩爾每L，在Icm比色杯中)(微板中的路徑長度200μ L每孔=0. 55cm)比活性(微摩爾/分鐘-毫克)=微摩爾/分鐘/蛋白濃度(mg)木酮糖激酶(XK)測定的基礎如圖ID所示。在微板測定中，在30°C下將20 μ L細胞游離提取物每個孔的反應混合物中，該混 合物包括以下終濃度的組分0. 2mM NADH, 50mM TrisHCl pH7. 5,2. OmM MgCl2_6H20，2. OM ATP，0. 2M PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)，8. 5mM D-木酮糖，5U/mL PK (丙酮酸激酶)，和5U/mL LDH(乳酸脫氫酶)。在平板閱讀器上讀數A34(l3-5分鐘。如下計算XI活性1單位對應於每分鐘形成1微摩爾D-木酮糖至D-5-磷酸木酮糖，溫度為30°C。U (微摩爾/分鐘)=比降(dA340/分鐘)X反應體積(μ L) /6220/0. 55cm(NADH — NAD摩爾數是6220 A34tl每摩爾每L，在Icm比色杯中)(微板中的路徑長度200μ L每孔=0. 55cm)比活性(微摩爾/分鐘-毫克)=微摩爾/分鐘/蛋白濃度(mg)HPLC 方法用Agilent 1100 系列 HPLC 和 LC 3D 的 Agilent ChemStation 軟體進行分析。柱 子為 BioRad Aminex HPX_87H(HPLC Organic AnalysisColumn 125-0140)，具有 BioRad Micro-Guard Cartridge Cation-H(125_0129)。操作條件為流量0. 6mL/分鐘
溶劑0. OlN H2SO4
終止時間25分鐘
注射體積5 μ L
自動取樣機溫度控制@10°C或4°C
柱溫55 °C
檢測器折射指數(40 0C )
具有外標標準校準曲線
實施例1
構建木糖發酉孝的運動發酵單朐,菌菌株
如共有的和共同未決的美國專利
公布US20080286870所述，木糖發酵運動 發酵單胞菌菌株經由連續轉座事件將兩個操縱子，PgapxylAB和Pgaptaltkt整合進 Zffl (ATCC#31821)的基因組進行構建，隨後在包含木糖的選擇性培養基上使該菌株適應， 它包含四個木糖利用基因，編碼木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛醇酶和轉酮醇酶。先前構建 了稱為8b的木糖發酵運動發酵單胞菌菌株，如美國專利申請公布20030162271所述，經由 組合使用同源重組和轉座方法將兩個操縱子PgapxylAxylB和Penotaltkt與選擇性抗生 素標記一起整合進運動發酵單胞菌5C的基因組中進行構建，隨後進行適應和NTG誘變。 在製備新菌株的過程中，使用與位點特異性同源重組相反的轉座(Epicentre』 sEZ::Tn體 外轉座系統)，因為該方法具有提供多個可選擇整合位點和相對高的插入頻率的優點。將
13編碼木糖利用酶的四個基因排列並克隆成兩個分開的操縱子用於整合的PgapxylAB和 Pgaptaltkt。將一個抗生素抗性標記、一個側接兩個Pl噬菌體Cre-重組酶識別序列(IoxP) 的氯黴素抗性(Cnf基因)連接到每個操縱子上用於選擇整合子。用一個兩步的連續方法 完成兩個操縱子的整合Pgaptaltkt，然後是PgapxylAB。在兩個整合事件中使用Cm抗性 選擇，因為它通過在質粒上表達Cre重組酶，隨後在每次整合後消除質粒而被移除。該方法 允許使用相同抗生素標記進行多次選擇。更重要的是，它允許移除導入的抗生素標記以選 擇整合的操縱子。該方法消除了抗生素抗性基因對商用發酵菌株的負面影響。構津DMODPgaDtaltktCm 用於轉座如美國專利申請公布20030162271 (實施例9)所述，包含來自大腸桿菌的轉酮 醇酶(tkt)編碼區的2. 2kb DNA片段從pUCtaltkt (美國專利申請公布20030162271) 中通過BglΙΙ/XbaI消化進行分離並被克隆到用BamHI/Xbal消化的pMOD (Epicentre Biotechnologies,Madison, WI)載體中，產生 pMODtkt。稱為 Pgaptal 的 PCR 片段通過如下 所述將運動發酵單胞菌gap (Pgap ；甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因的啟動子區域融合到大腸 桿菌轉醛醇酶(tal)的編碼區上生成。從PZB4擴增Pgap片段，該片段的構建如美國專利 5514583(實施例3)所述，使用具有SEQ ID NO :13禾口 14的引物。pZB4包含Pgap-xylA/xylB 操縱子和P eno-tal/tkt操縱子。使用具有SEQ ID NO 15和16的引物從pZB4擴增tal編 碼區片段。Pgaptal片段使用Pgap和tal片段作模板，用具有SEQ ID NO 17和18的引物 進行擴增。該片段用XbaI消化並克隆到質粒pMODtkt，tkt編碼區的上遊中。loXP::Cm片 段通過 PCR，使用 Cmlox(F，sfi)和 Cmlox (R，sfi)引物(SEQ ID N0:19 禾口 20)以及 pZB186 作模板生成。PZB186是天然運動發酵單胞菌質粒和pACYC184的組合，描述於US514583 (實 施例 3)和 Zhang 等人((1995) Science267 :240_243)。最後，將 loxP::Cm PCR 片段插入 包含Pgaptaltkt的質粒的SfiI位點以形成整合質粒pMODPgaptaltktCm。在該質粒中，將 Pgaptaltkt IoxP: Cm片段插入pMOD載體中的兩個嵌合末端(轉座酶結合位點)之間。SEQ ID NO :21是pMODPgaptaltktCm質粒的全長核苷酸序列。轉座和轉化ZWl 中的 pMODPgaptaltktCm質粒pMOD是基於pUC的載體，因此在發酵單胞菌屬中是非複製載體。質粒 pMODPgaptaltktCm在室溫下，在存在Mg2+的情況下用轉座酶處理一小時，並用於轉化ZWl細 胞，轉化通過電穿孔(使用BioRadGene Pulser，設為200 Ω，25 μ F和16kV/cm)進行。電穿 孔細胞在30°C下，在配合培養基(MM)中培養6小時，該培養基包含10g/L酵母提取物，5g/ L 胰蛋白腖，2. 5g/L(NH4)2S04，0. 2g/L K2HPO4)，補充了 50g/L 葡萄糖和 ImM MgSO40 將轉化 混合物置於瓊脂板上，該瓊脂板包含在MM中的15g/L Bacto瓊脂，補充了 50g/L葡萄糖和 12(^8/!^氯黴素，並且在301下厭氧培養。轉化體在約2天後可見。轉化/轉座頻率為 約 3x107 μ g DNA。獲得了總計39個Cnf轉化體菌落。挑取了 二十一個菌落並通過PCR和酶活性檢 測分析法進行進一步分析。使用引物SEQ ID NO 22和23的PCR證實存在3kb DNA片段， 該片段在轉化體中包含tal和tkt編碼區。用來自21個整合子菌落的質粒DNA迴轉化不 生成在大腸桿菌中的迴轉化體，這說明tal和tkt被整合進ZWl的基因組中。使用改進用 於微板的規程(一般方法)測試這些整合子的轉醛醇酶和轉酮醇酶活性。使用Pierce BCA 蛋白檢測分析法測定蛋白濃度。轉化體在30°C下，在50mL錐形離心管中的RM培養基上生
14長，該培養基包含2% (w/v)的葡萄糖，補充了 12(^8/!1^的氯黴素)。對照菌株8b和ZWl 也生長(RM加2%的葡萄糖用於ZWl)用於酶分析法。當OD6tltl達到1.0時收穫細胞。洗滌 細胞一次並重懸在超聲波降解緩衝液(lOmMTris-HCl，pH 7. 6和IOmM MgCl2)中。酶分析 法如美國專利申請公布20030162271所述進行。單位為微摩爾/分鐘-毫克。除一個樣本 外，所有樣本具有轉醛醇酶和轉酮醇酶活性。選擇的整合子的基因組和質粒DNA用PstI消化，使用tkt探針進行Southern雜 交。ZWl DNA不與tkt探針雜交。在所有整合子基因組樣本中均有1. 5kb的條帶是可見的， 它是期望的DNA片段，位於tkt中的PstI位點和tal中的PstI位點之間。第二個可見的 高分子量(6kb或者更大)條帶是唯一的，位於獨立品系T2、T3、T4和Τ5之間，指示每個品 系中的個別基因組整合位點。令人感興趣的是，與tkt探針雜交的T5的質粒和基因組DNA 指示Pgaptaltkt也可能在天然質粒上整合進T5中。選擇這四個菌株(T2、T3、T4和T5)進 行進一步的Cre處理以除去Cnf標記。Cre處理以從tal tkt整合子中除去Cmt標記為了從染色體中除去Cmr標記，用pZB188/Spec_Cre轉化T2、T3、T4和T5。該質 粒是發酵單胞菌屬-大腸桿菌穿梭載體PZB188 [Zhang等人(1995) Science 267 :240_243 ； US 5514583]的衍生物，它包含Cre重組酶的表達盒。pZB188/Spec_Cre與Cre表達載體相 同，該載體在實施例10中描述(pZBlSS/Kan-Cre)，不同的是它具有抗奇放線菌素基因，而 不是抗卡那黴素基因。在補充了 2%葡萄糖和200 μ g/mL奇放線菌素)的MM瓊脂板上選 擇轉化體。挑取Sf抗性菌落置於補充了 2%葡萄糖和200 μ g/mL奇放線菌素的RM瓊脂板 上和補充了 2%葡萄糖和120 μ g/mL Cm的RM瓊脂板上。百分之百的挑取菌落是Cm，指示 Cre高效切除Cnf。SplrCms轉化體在37 °C下在加有2%葡萄糖的RM中培養2至5天，每日 轉移以消除pZBlSSaadACreF。在每次轉移過程中，稀釋細胞並置於加有2%葡萄糖的RM瓊 脂板上，用於挑取到具有或不具有200 μ g/mL Sp的相同培養基的附加平板上。通過PCR分 析Sps菌落以確認消除了 pZB188aadACreF。將整合子的消除質粒的後代稱為T2C、T3C、T4C 和T5C。為了檢查這些轉座整合子是否穩定，這4個菌株在加有2%葡萄糖的RM中生長，然 後轉移到IOmL相同培養基中並在37°C下在雙重測試管中生長。每日轉移細胞，持續十天， 或者大約100代。稀釋菌落並將其置於RMG平板上用於第1次和第10次轉移後的菌落分 離。來自每個測試菌株的每次轉移的十二個菌落對存在的Pgaptaltkt顯陽性，測試通過菌 落PCR，使用5，Pgap和3，tkt引物(SEQ ID NO ；13和23)。也測量在第1次轉移和第10 次轉移後的分離轉醛醇酶和轉酮醇酶的活性(如一般方法所述)。在100代後，所有4個整 合子在非選擇性培養基上具有相似水平的TAL和TKT活性，說明這些整合子是遺傳穩定的。構建pMODPgapxylABCm 用於轉座下一步驟是進一步將PgapxylAB IoxP: Cm操縱子整合進ZWl Pgaptaltkt整合 子中(T2C、T3C、T4C 和 T5C)。整合質粒 pMODPgapxyIABCm 基於質粒 pMODPgaptaltktCm(上 文所述)構建。Pgaptaltkt DNA片段通過Sacl/Sfil消化除去。將一個包含SacI、NotI、 和SfiI限制性位點的銜接子片段通過連接導入。然後將分離自pZB4(US 5514583)的 PgapxylAB的NotI片段克隆進銜接子的NotI位點。木糖異構酶(XI)由xylA編碼，而木酮 糖激酶(XK)由xylA編碼。SEQ ID NO :24是pMODPgapxylABCm質粒的全長核苷酸序列。轉座和轉化T2C、T3C、T4C 和 T5C 中的 pMODPgapxylABCm
使用相似方法整合PgaptaltktCm，用pMODPgapxylABCm (如上所述)經轉座酶處理 以轉化/轉座T2C、T3C、T4C和T5C。在Cm選擇後的2個轉化/轉座實驗後獲取六個整合 子(T3CCmXl、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmXU T5CCmXl、T5CCmX2)。通過 PCR 確認所有轉座子 存在xylAB，所述PCR使用兩組引物SEQ ID NO :25和26，以及SEQ ID N0:15和16，不同 的是T2CcmXl和T2CcmX6使用引物SEQID NO 25和26進行檢測，它們無PCR片段。檢測包括2個PCR陰性品系的整合子的XI、XK、TAL和TKT活性(一般方法)。如 圖2和3所示的結果指示六個17認8整合子1300^1、13001^2、13001^3、1優01^1、150011父1、 和T5CCmX2都具有XI、XK、TAL和TKT活性。與陰性親本對照相比，XI和XK活性是新獲得 的(圖2)。TAL和TKT活性保持與親本對照一致。所有結果指示製備了蛋白並且具有功能。 酶活性水平不同，並且TI和XK活性類似於用相同質粒轉化/轉座的ZWl整合子的那些活 性。XI、XK、TAL和TKT的活性水平低於菌株8b中的那些活性水平。xylAB操縱子的整合通過Southern雜交確認。6個品系的基因組和質粒DNA用 SphI消化並與地高辛標記的xylB探針雜交。共有的條帶約3kb，它從xylB的SphI位點和 在pMOD載體上的鄰近克隆位點上的另一個SphI位點中生成，存在於所有基因組DNA樣本 中，並且此外在基因組DNA樣本中的較高分子量的雜交條帶指示有四個用於染色體中的P gapxylAB操縱子的整合位點。T3CCmXl和T3CCmX2看來似乎具有相同的整合位點，T3CCmX3 和T4CCmXl可具有相同的整合位點，而T5CCmXl和T5CCmX2各具有分開的整合位點。用PstI 消化相同DNA，隨後通過用tkt探針進行的Southern雜交證明每個整合子具有與其相應的 親本菌株相同的雜交圖像。Zffl: PRaptaltkt PRapxylAB Cm 整合子適應木糖培養基儘管存在所有四個木糖利用的酶活性，以前的觀察(美國專利申請公布 20030162271)指示整合子可能不立即在木糖上生長。在木糖上生長可發生在長時間在木糖 培養基上培養之後(或者在測試管中或平板上)，該過程稱為適應。菌株如下進行適應。將ZWl: =PgaptaltktPgapxylABCm整合子菌株接種到包含 RMX(包含10g/L酵母提取物，2g/L KH2P04，20g/L或2% (w/v)木糖的測試管中以及MMGX或 MMX平板上(10g/L酵母提取物，5g/L胰蛋白腖，2. 5g/L (NH4) 2S04,0. 2g/L K2HPO4, ImM MgSO4, 1.5% (w/v)瓊脂，0· 025% (w/v)葡萄糖和4% (w/v)木糖或正好4% (w/v)木糖)。低水平 的木糖用於支持初始生長以提高適應期間的突變可能性。在培養物和平板中的木糖上進行 適應的至少五個嘗試的其中一個是成功的。在30°C下厭氧培養10天後，在具有T3CCmXl和 T3CCmX2細胞的MMGX上分別有17和19個菌落是可見的。平板上的菌落較小，並且看上去不 健康(透明)。將十二個菌落(四個來自T3CCmXl平板T3CCmXll、T3CCmX12、T3CCmX13和 T3CCmX110 ；或者來自 T3CCmX2 平板T3CCmX24、T3CCmX25、T3CCmX26、T3CCmX27、T3CCmX28、 T3CCmX29、T3CCmX211 和 T3CCmX212)接種到 RMGCml20 中並轉移到 3mL RMX 中用於進一步 的適應以獲得能夠在木糖上生長較快的品系。在包含3mL RMX的測試管中的整合子的適應在30°C下進行。一直在Spectronic 601分光光度計上監控0D_。當生長達到對數中期時，將培養物轉移到RMX的新鮮管中。該 過程持續7次轉移。生長速率和最終的OD(非線性讀數)經轉移而被改善。在第6次轉移時，將培養物劃線接種在RMX平板上以分離單菌落。三個整合子比 在RMX劃線平板上的其他整合子生長更快T3CCmX13、T3CCmX26和T3CCmX27，在表中和下文的討論中將它們稱為X13、X26和X27。為了篩選在木糖上生長最好的菌落，選擇TX13、X26 和Χ27的四個大(L1-4)菌落和四個小(S1-4)菌落並在RMX測試管中培養以便能監控生長 狀況、糖利用率、和乙醇產量。菌落在30°C生長過夜，隨後當0D_ = 0. 05時接種到在雙重 測試管中的3mL RMX中。X27在RMG中比其他培養物生長更慢，在6. 5小時後再次接種。在 69小時》27為62.5小時)後，採集樣本進行HPLC分析(一般方法)。圖4圖示了在69 小時時(所有X27培養物為62. 5小時)培養物的平均乙醇產率(％理論產量)和木糖利用 率(％)。在大菌落和小菌落之間無顯著差異。儘管X27在木糖上的性能比X26更好，但它 在葡萄糖上顯示生長更慢。因此選擇性能最佳的大菌落X13(X13L3)和X26(X26L1)在pH 控制發酵中進行進一步的評估。菌株X13L3和X26L1以及對照菌株8b的發酵在37°C下在 RMG(6%葡萄糖)、RMX(6%木糖)和RMGX(8% /4%;葡萄糖/木糖)中進行。在RMG(6% ) 和RMGX(8%/4%)中生長的X13L3和X26L1的葡萄糖發酵進行得相當迅速。X13L3和X26L1 在RMGX(8%/4%)中的木糖發酵比菌株8b的木糖發酵更慢。此外X13L3和X26L1在37°C 下在RMX(6% )上的生長發生在長時間的延遲之後。從RMX(6% )發酵液中回收若干種分 離蛋白，X13b、X13c和X13FL。這些分離蛋白與初始菌株X13a (X13L3的分離蛋白)和X26 如該實施例前文所述一起經受Cre處理以從ZWl PgaptaltktPgapxylABCm菌株中除去Cmlr 標記。所得經Cre處理的無Cnf整合子稱為X13aC、X13bC、X13cC、X13FLC和X26C。實施例2菌株ZTO58的適應和詵擇如前文所述，初始ZWl PgaptaltktPgapxylABCm菌株在30"C下在RMX上的適應極 大地改善了在這些條件下菌株的生長。然而適應的菌株在37°C下在RMX(6%)中的生長和 發酵期間經歷長時間的延遲。為了在優選的過程條件下(包括較高的糖濃度和溫度)進一 步改善用於木糖發酵的整合子，進化或適應過程繼續在37°C下在RMX(5%)中進行。進行連 續轉移並且選擇生長最好的菌株。該過程中使用的整合子包括X13aC、X13bC、X13cC、X26C 和X13FLC。這5個菌株在30°C下在RMX中生長，在被轉移到37°C下的RMX(5% )之前進行 了 6次轉移，隨後另外轉移5至16次。在所有轉移期間和之後將培養物劃線接種在RMX平 板上並在37°C下培養以分離單菌落。將大菌落進一步劃線接種在RMX平板上並在37°C下 培養3至4次以純化菌落。選擇最終的大菌落用於在37°C下在RMX(5%)中的生長測試。評估在37°C下在RMX(5% )培養基中適應的菌株在經連續轉移適應後的十八個菌落最初在37°C下在RMX(5% )測試管中進行測 試。選擇十二個菌株進行第2次測試管評估。所有的評估中包括菌株8b用於比較。18個 菌落在37°C下在RMG中生長過夜，離心並將細胞在37°C下接種到4mL的RMX (5% )中，在測 試管中靜態進行第1次評估。基於生長狀況(0D·，非線性)和終點HPLC結果(低殘餘木 糖和高乙醇)，選擇12個菌株用於第2次評估。第2次評估的其中一個目的是為了測試在木糖上改善生長的穩定性和菌株的木 糖利用能力。所有12個菌株經過穩定性研究以檢查適應菌株在暴露於非選擇性培養基後 是否是穩定的，其中將它們在37°C連續轉移50代。將在RMG(5%)轉移之前和之後的培 養物接種到RMX(5% )測試管中並在37°C下生長用於評估。非線性OD通過在Spectronic 601分光光度計中直接對測試管讀數進行監控。將在RMG中生長50代之前和之後的、在 RMX(5% )中生長至70小時的OD繪製圖5中。結果指示大多數菌株在37°C下在RMG中生長50代後是穩定的。終點(穩定期)上清液也通過HPLC對木糖和乙醇濃度進行分析。在 這些培養物中的低殘餘木糖和高乙醇濃度支持該菌株在木糖上生長和發酵良好這一事實。基於上述測試管評估(低殘餘木糖、高乙醇濃度和較高的0D)和隨後用高濃度葡 萄糖和/或木糖(至多20%)以及葡萄糖和木糖及乙酸鹽的混合物進行的微滴定板生長篩 選的結果，在高糖和存在乙酸鹽的情況下選擇生長較好的菌株，如菌株#26，命名為ZW658， 它表現出最好的總體性能。實施例3戊糖磷酸鹽塗徑酶活件的測定由整合基因(描述於實施例1中)編碼的四種木糖利用酶的活性如一般方法所 述進行測量，選擇三個菌株適應高糖和37° V (實施例1)並比較在進一步適應的菌株 ZW658(實施例2)中的相同酶的活性。表1顯示了以微摩爾產物/mg蛋白/分鐘表示的結^ ο
表1腳獻翻刪織運雲力舗雜甫纖Φ白備舌十牛
權利要求
包含運動發酵單胞菌甘油醛 3 磷酸脫氫酶基因啟動子的分離的核酸分子，所述啟動子在選自 190位、 89位、或 190和 89位兩者的位置上具有鹼基取代；其中所述位置編號是相對於運動發酵單胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛 3 磷酸脫氫酶的天然ATG翻譯起始密碼子。
2.權利要求1的分離的核酸分子，其中所述鹼基取代是a)在-190位，T取代G；和b)在-89位，T取代C。
3.權利要求2的分離的核酸分子，所述分離的核酸分子包含選自SEQID N0:4、5、6、7、 89、10、11、和12的序列。
4.包含權利要求1的分離的核酸分子的嵌合基因，所述核酸分子可操作地連接至異源 核酸分子。
5.權利要求3的嵌合基因，其中所述異源核酸分子編碼蛋白或肽。
6.權利要求3的嵌合基因，其中所述異源核酸分子編碼調控RNA分子，所述調控RNA分 子選自反義RNA、核酶、和幹擾RNA。
7.包含權利要求1的分離的核酸分子的載體。
8.包含權利要求2的分離的核酸分子的載體。
9.包含權利要求3的分離的核酸分子的載體。
10.轉化選自發酵單胞菌屬細胞和發酵細菌屬細胞的細菌細胞的方法，所述方法包括 將權利要求1的分離的核酸分子導入所述細胞。
11.轉化選自發酵單胞菌屬細胞和發酵細菌屬細胞的細菌細胞的方法，所述方法包括 將權利要求2的分離的核酸分子導入所述細胞。
12.轉化選自發酵單胞菌屬細胞和發酵細菌屬細胞的細菌細胞的方法，所述方法包括 將權利要求3的分離的核酸分子導入所述細胞。
13.根據權利要求10所述的方法，其中所述導入包括將權利要求1的分離的核酸分子 整合進所述細胞的基因組中或保持在所述細胞內穩定複製的質粒上。
全文摘要
鑑定了運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子的突變體，所述啟動子引導可操作地連接的異源核酸的表達改善。這些啟動子是高表達啟動子，它們用於在發酵單胞菌屬、發酵細菌屬、和其他相關細菌中表達嵌合基因。
文檔編號C12N15/09GK101981184SQ200980110636
公開日2011年2月23日 申請日期2009年3月25日 優先權日2008年3月27日
發明者C·麥卡欽, L·陶, L·麥科爾, M·A·弗蘭登, M·張, P·G·凱米, P·V·維塔寧, Y·仇, Y·張 申請人:納幕爾杜邦公司;可持續能源聯盟有限責任公司