特異性結合vcam-1並抑制白細胞與內皮細胞之間粘附和變移的人重組單克隆抗體的製作方法

2023-05-18 18:55:06 1

專利名稱：特異性結合vcam-1並抑制白細胞與內皮細胞之間粘附和變移的人重組單克隆抗體的製作方法
特異性結合VCAM-1並抑制白細胞與內皮細胞之間粘附和變移的人重組單克隆抗體
技術領域：
本發明涉及特異性結合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)以抑制白細胞與活化的內皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內皮細胞變移的人重組單克隆抗體；和含有該人重組單克隆抗體的炎性疾病或癌症的預防性和治療性組合物。
背景技木在從血流遷移至組織的過程中，包括白細胞在內的免疫細胞經過活化的內皮細胞從而引起免疫應答，並且許多細胞粘附分子(CAM)，如整聯蛋白、選擇蛋白、ICAM(胞內粘附分子)和VCAM(血管細胞粘附分子)，涉及白細胞與內皮細胞的粘附及其向組織的遷移。細胞粘附分子在功能上被分為涉及白細胞與內皮細胞相互作用的選擇蛋白、涉及白細胞與內皮細胞粘附的整聯蛋白和免疫球蛋白如ICAM和VCAM。這些細胞粘附分子在很多生理反應如免疫應答、炎症和血栓形成中發揮重要作用。VCAM-I是血管內皮細胞粘附分子其中之一，其與在大多數白細胞——不包括嗜中性粒細胞——的表面上表達的整聯蛋白(VLA-4)發生相互作用。VCAM-I通過炎性信號而被表達，並引起白細胞粘附於血管內皮細胞，和隨後白細胞跨內皮遷移至受損組織中。儘管近年來關注於VCAM-1-VLA-4的相互作用，但VCAM-I中和抗體的發展還未被積極地研究。雖然M/K-2. 7——抗小鼠VCAM-I的單克隆抗體——在近期已被開發，並在膠原蛋白引起的關節炎小鼠模型中顯示出對關節炎的抑制效果，但該抗體僅對小鼠模型具有特異性，因此應對該抗體的可用性進ー步測試以用於臨床應用。進一歩，VCAM-I由7個IgG樣結構域組成，並且其結構域1和4實質上參與與其配體整聯蛋白(α4β1 或 α 4β 7)的結合(1995，PNAS，92 :ρ5714 ;1995，The journal of immunology,155 :p3135 %=)。在這方面，迫切需要開發如下完全人單克隆抗體其抑制VCAM-I抗原與整聯蛋白的相互作用從而有效抑制白細胞向內皮細胞的粘附和變移，並使免疫原性的危險最小化。

發明內容技術問題因此，本發明人已開發人VCAM-I特異性人重組單克隆抗體，其具有人源性重鏈 (VH)和輕鏈(VL)結構域，其中該人重組單克隆抗體特異性識別人內皮細胞表面上表達的 VCAM-1，並結合VCAM-I抗原的結構域1或2，以顯示抑制U397前單核細胞白細胞與活化的內皮細胞之間的相互作用的強活性，從而實現本發明。技術方案本發明的ー個目的是提供特異性結合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)以抑制白細胞與活化的內皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內皮細胞變移的人重組單克隆抗體。本發明的另ー個目的是給出提供炎性疾病、心血管疾病或癌症的診斷信息的方法，包括如下步驟檢測人重組單克隆抗體與疑患炎性疾病或癌症的對象的生物樣本中的 VCAM-I之間的抗原-抗體反應。本發明的又ー個目的是提供利用人重組單克隆抗體抑制白細胞與活化的內皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內皮細胞變移的方法。本發明的又ー個目的是提供用於炎性疾病、心血管疾病或癌症的診斷性組合物， 其含有人重組單克隆抗體。本發明的又ー個目的是提供用於炎性疾病、心血管疾病或癌症的預防性或治療性組合物，其含有人重組單克隆抗體和藥學可接受的載體。本發明的又ー個目的是提供用於治療炎性疾病、心血管疾病或癌症的方法，包括如下步驟給予用於炎性疾病或癌症的預防性或治療性組合物。有利效果根據本發明所述的人重組單克隆抗體對人內皮細胞上表達的VCAM-I顯示強親和力，並有效抑制VCAM-I介導的白細胞與活化的內皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內皮細胞變移，從而被用於預防和治療炎性疾病，如哮喘和關節炎、移植排斥、心血管疾病和附圖描述

圖1顯示根據本發明一個實施方式所述的人重組單克隆抗體可變區的胺基酸序列；圖2是ELISA (酶聯免疫吸附試驗)的結果，顯示抗原特異性抗VCAM-I人單克隆抗體對抗原——根據其人VCAM-I結構域——的親和力，其中VD2表示重組人VCAM-I結構域D1-D2/FC嵌合體，VD4表示重組人VCAM-I結構域D11_D44/Fc嵌合體，VD7表示重組人 VCAM-I結構域Dl-D7/Fc嵌合體；圖3顯示人VCAM-I抗原特異性抗VCAM-I人單克隆抗體對抗原的結合能力或親和力，其中抗原-抗體親和カ通過1 1結合模式、利用BIAC0RE儀(BIACORE AB，Sweden)測定，從而計算抗原-抗體親和カ常數，KD值；圖4是分析抗VCAM-I人單克隆抗體對純化的人重組VCAM-I抗原與人白細胞之間粘附的抑制活性的結果，其中其抑制活性通過相比於非抗體治療組螢光強度的降低被確定；圖5是分析抗VCAM-I人單克隆抗體對人白細胞與TNF- α (腫瘤壞死因子-α )活化的人內皮細胞之間粘附的抑制活性的結果，其中其抑制活性通過相比於非抗體治療組螢光強度的降低被確定；圖6是分析抗VCAM-I人單克隆抗體對人白細胞通過TNF- α (腫瘤壞死因子-α ) 活化的人內皮細胞變移的抑制活性的結果，其中其抑制活性通過相比於非抗體治療組變移白細胞量的減少被測定；圖7是根據本發明ー個實施方式分析對I h0A(RaS同源基因家族，成員A)活性的抑制活性的結果；圖8是根據本發明ー個實施方式分析對ROS (活性氧物質)活性的抑制活性的結果；圖9是根據本發明ー個實施方式分析內化的結果；
圖10顯示根據本發明一個實施方式的人重組單克隆抗體的重鏈和⑶R序列；圖11顯示根據本發明一個實施方式的人重組單克隆抗體的輕鏈和⑶R序列；圖12顯示根據本發明一個實施方式的動物實驗的概括；圖13是根據本發明ー個實施方式所述通過體外粘附試驗分析VCAM-IAb對炎性細胞粘附的抑制效應的結果，其中(A)顯示結合的單核細胞的數量圖，(B)顯示代表性照片；圖14是根據本發明ー個實施方式所述通過體外變移試驗分析VCAM-IAb對炎性細胞變移的抑制效應的結果，其中(A)顯示4hrs後變移細胞的數量圖，(B)顯示IShrs後變移細胞的數量圖；圖15是根據本發明ー個實施方式所述測試VCAM-lAb(7HT)的體內結合能力的 en face共焦顯微鏡結果((A)PBS, (B)高劑量對照Ab，(C)低劑量VCAM-lAb，(D)高劑量 VCAM-IAb)；圖16是根據本發明ー個實施方式測量小鼠體重和供食消耗變化的結果；圖17是根據本發明ー個實施方式的小鼠血液的血液學分析結果((A)總膽固醇水平(T-CHO)、HDL-膽固醇水平(HDL-C)和LDL-膽固醇水平(LDL-C ； (B)甘油三酯水平(TG) 和葡萄糖水平(GLU) ； (C)穀氨酸草醯乙酸轉氨酶水平(GOT)和穀氨酸丙酮酸轉氨酶水平 (GPT) ； (D)白蛋白水平(ALB))；圖18是根據本發明ー個實施方式測量主動脈弓動脈粥樣硬化斑塊形成及其大小的結果；圖19是顯示根據本發明一個實施方式所述En face法分析動脈中形成的動脈粥樣硬化斑塊的結果的圖；圖20是顯示根據本發明一個實施方式所述En face法分析動脈中形成的動脈粥樣硬化斑塊的結果的圖；圖21是根據本發明ー個實施方式所述通過H&E染色對肝臟切片進行病理分析從而測試VCAM-I抗體注射的毒性的結果；圖22是根據本發明ー個實施方式所述通過H&E染色對腎臟切片進行病理分析從而測試VCAM-I抗體注射的毒性的結果；和圖23是根據本發明ー個實施方式所述通過H&E染色對脾臟切片進行病理分析從而測試VCAM-I抗體注射的毒性的結果。最佳實施方式下文中，將參考實施例對本發明進行詳細描述。但是，提供下列實施例僅以示例本發明為目的，因此其不意為限制本發明。在實現上述目的的一方面中，本發明涉及人重組單克隆抗體，其特徵在於其特異性結合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)，從而抑制白細胞與活化的內皮細胞之間的粘附和白細胞通過活化的內皮細胞變移。提供以下術語描述是為了更好地理解說明書，並且提供本文所用的術語僅以示例為目的，並不意為本發明受限於這些術語。應當注意的是，如本說明書和所附權利要求書中所用，除非上下文另外明確表示，単數物體意為包括多個對象。如本文所用，「抗體」包括參考對特定抗原具有免疫反應性的免疫球蛋白分子，並包括多克隆和單克隆抗體。該術語還包括基因工程改造的形式，如嵌合抗體(例如，人源化鼠抗體)和雜結合抗體(例如，雙特異性抗體)。術語「抗體」還包括抗體的抗原結合形式，包括具有抗原結合能力的片段(例如， Fab，、F(ab，)2、Fab、Fv和rlgG)。該術語還指重組單鏈Fv片段(scFv)。術語抗體還包括ニ價或雙特異性分子、雙抗體、三抗體和四抗體。ニ價和雙特異性分子被述及幹，例如， Kostelny 等(1992，J. Immunol. 148 15467)、Pack 禾ロ Pluckthun (1992，Biochemistry 31 1579)、Hollinger 等(1993，supra)、Gruber 等(1994，J. Immunol. :5368)、Zhu 等(1997， Protein Sci. 6 :781)、Hu等(1996,Cancer Res. 56 :3055)、Adams等(1993,Cancer Res. 53 4026)和 McCartney 等(I995，Protein Eng. 8 :301)。此外，本文所用的術語「單克隆抗體」，指已得自基本相同的抗體克隆的抗體分子， 其對於特異表位顯示單一的結合特異性和親和力。一般，免疫球蛋白具有重鏈和輕鏈。每條重鏈和輕鏈包含恆定區和可變區(該區域也被稱為「結構域」)。輕鏈和重鏈可變區包含三個高變區，稱為「互補決定區」(下文中被稱為「⑶R」)和四個「框架」區。⑶R主要負責結合抗原表位。各鏈的⑶R—般被稱為 ⑶R1、⑶R2和⑶R3，從N端開始依次編號，並且還一般通過特定⑶R所在的鏈確定。如本文所用，術語「人源化抗體」是得自人免疫球蛋白的分子，並意為構成抗體的全部胺基酸序列——包括互補決定區和框架區——由人免疫球蛋白組成。術語「人重組單克隆抗體」指單分子組成的抗體分子，得自人免疫球蛋白。人源化抗體用於人類治療一般具有至少三個潛在的優勢。第一，其可與人免疫系統更好地進行相互作用，例如，從而通過補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)更有效地消滅目標細胞。第二，人免疫系統不識別抗體作為外源的。第三，在人體循環中的半衰期將類似於天然存在的人抗體，允許給予較小劑量或較低頻率的用藥。因此，根據本發明所述的人單克隆抗體對人內皮細胞上表達的VCAM-I顯示強親和力，並有效抑制白細胞粘附於表達VCAM-I的活化內皮細胞。此外，由於其重鏈和輕鏈結構域均得自人細胞以顯示低免疫原性，根據本發明所述的人單克隆抗體可用於治療炎性疾病或癌症，該炎性疾病可選自腫瘤壞死因子-α (TNF-α)介導的疾病、腸道疾病、動脈硬化和心肌梗塞， 並優選選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關節強直性脊椎炎、膿毒症、內毒素休克、血流動カ休克、膿毒症症候群、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、癌症、自身免疫性疾病、AIDS相關的機會性感染、關節炎、類風溼性脊椎炎、痛風、關節強直性痛風、克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發性硬化症、麻風結節性紅斑(ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。根據本發明的優選實施方式，本發明的人重組單克隆抗體可含有重鏈可變區，該重鏈可變區包含⑶Rl，具有胺基酸序列SEQ ID N0. 2 ；⑶R2，具有胺基酸序列SEQ ID N0. 3 ； 和⑶R3，具有胺基酸序列SEQ ID N0. 4。同吋，本發明的人重組單克隆抗體可通過如下製備使已知治療性抗體的框架區(FR)連接於互補決定區(CDR)。更優選地，本發明的人重組單克隆抗體可以是包含SEQ ID NO. 1限定的重鏈胺基酸序列的人重組單克隆抗體(參見圖1)。進一歩，根據本發明的優選實施方式，本發明的人重組單克隆抗體可含有輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含⑶町，具有胺基酸序列SEQ ID N0. 6 ；⑶R2，具有胺基酸序列SEQ ID N0. 7 ；和胺基酸序列SEQ ID N0. 8。同吋，本發明的人重組單克隆抗體可通過如下製備使已知治療性抗體的框架區(FR)連接於互補決定區(CDR)。更優選地，本發明的人重組單克隆抗體可以是包含SEQ ID NO. 5限定的輕鏈胺基酸序列的人重組單克隆抗體(參見圖1)。更優選地，本發明的人重組單克隆抗體可以是包含所有輕鏈和重鏈可變區的人單克隆抗體。也就是說，本發明的人重組單克隆抗體可包括重鏈可變區——其包含SEQ ID NO. 2限定的重鏈CDRl ；SEQ ID NO. 3限定的重鏈CDR2 ；和SEQ ID NO. 4限定的重鏈CDR3—— 和輕鏈可變區——其包含SEQ ID NO. 6限定的輕鏈⑶Rl ；SEQ ID NO. 7限定的輕鏈⑶R2 ； 和SEQ ID NO. 8限定的輕鏈⑶R3。同吋，本發明的人重組單克隆抗體可通過如下製備使已知治療性抗體的框架區(FR)連接於互補決定區(CDR)。最優選地，本發明的人重組單克隆抗體可以是包含SEQ ID NO. 1限定的重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO. 5限定的輕鏈胺基酸序列的人重組單克隆抗體(參見圖1)。此外，根據本發明的優選實施方式，本發明的人重組單克隆抗體可含有重鏈可變區，該重鏈可變區包含⑶Rl，具有胺基酸序列SEQ ID N0. 10 ；⑶R2，具有胺基酸序列SEQ ID NO. 11 ；和⑶R3，具有胺基酸序列SEQ ID N0. 12。同吋，本發明的人重組單克隆抗體可通過如下製備使已知治療性抗體的框架區(FR)連接於互補決定區(CDR)。更優選地，本發明的人重組單克隆抗體可以是包含SEQ ID N0. 9限定的重鏈胺基酸序列的人重組單克隆抗體 (參見圖10)。進一歩，根據本發明的優選實施方式，本發明的人重組單克隆抗體可含有輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含⑶R1，具有胺基酸序列SEQ ID N0. 14 ；⑶R2，具有胺基酸序列SEQ ID N0. 15 ；和胺基酸序列SEQ ID N0. 16。同吋，本發明的人重組單克隆抗體可通過如下製備使已知治療性抗體的框架區(FR)連接於互補決定區(CDR)。更優選地，本發明的人重組單克隆抗體可以是包含SEQ ID N0. 13限定的輕鏈胺基酸序列的人重組單克隆抗體(參見圖11)。更優選地，本發明的人重組單克隆抗體可以是包含所有輕鏈和重鏈可變區的人單克隆抗體。也就是說，本發明的人重組單克隆抗體可含有重鏈可變區——其包含SEQ ID NO. 10限定的重鏈CDRl ；SEQ ID NO. 11限定的重鏈CDR2 ；和SEQ ID NO. 12限定的重鏈 ⑶R3——和輕鏈可變區——其包含SEQ ID N0. 14限定的輕鏈⑶Rl ；SEQ ID N0. 15限定的輕鏈⑶R2;和SEQ ID N0. 16限定的輕鏈⑶R3。同吋，本發明的人重組單克隆抗體可通過如下製備使已知治療性抗體的框架區(FR)連接於互補決定區(CDR)。最優選地，本發明的人重組單克隆抗體可以是包含SEQ ID N0. 9限定的重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 13限定的輕鏈胺基酸序列的人重組單克隆抗體(參見圖11)。在這方面，人重組單克隆抗體提供對人VCAM-I的親和力，根據ー個優選的實施方式，人重組單克隆抗體與人VCAM-I抗原的締合/解離常數(KD值)可以是0.1 X KTi3M至 7. 0 X IO-9M,其可通過利用BIAC0RE分析測定各抗體與人VCAM-I抗原的締合/解離常數(KD 值)而得到。也就是說，人VCAM-I抗原作為配體被固定於傳感器晶片(傳感器晶片CM5， BIAC0RE, BR-1003-99)，然後各抗體稀釋液利用BIAC0RE儀被施加於固定的配體，以引起抗原與抗體的締合和解離，從而測定締合(Ka)/解離(Kd)常數KD值和卡方△ (x2)值—— 即與可信度相關的統計學值。本發明的人重組單克隆抗體可通過用於生成單克隆抗體的公知方法容易地生成。 例如，製備單克隆抗體的方法可通過利用得自免疫動物的B白細胞生成雜交瘤(Koeher andMilstein, 1976, Nature, 256 :495)或利用噬菌體展示法進行，但不限於此。利用噬菌體展示的抗體庫是以直接得自B淋巴細胞的抗體基因在噬菌體表面表達抗體的方法，而無需製備雜交瘤。與通過B細胞無限増殖化生成單克隆抗體相關的很多困難可通過噬菌體展示法克服。常規的噬菌體展示包括1)將具有隨機序列的寡核苷酸插入相應於噬菌體衣殼蛋白pill(或pIV)N端的區域；幻表達天然衣殼蛋白和所述具有隨機序列的寡核苷酸編碼的多肽的融合蛋白；3)處理可結合於所述寡核苷酸編碼的多肽的受體物質；4)利用低pH 或具有結合競爭力的分子洗脫結合於受體的肽-噬菌體顆粒ホ)擴增宿主細胞中通過淘選洗脫的噬菌體；6)重複所述步驟以得到所需量的噬菌體；和7)由通過淘選而選擇的噬菌體克隆的DNA測序確定活性肽的序列。在優選的實施方式中，本發明的人重組單克隆抗體的製備方法可通過噬菌體展示法進行。本發明所屬領域技術人員通過參考公知的噬菌體展示技術可容易地進行上述步驟，所述公知噬菌體展示技術公開於，例如，Barbas等(METHODS :A Companion to Methods in Enzymology 2 :119,1991 and J. Virol.2001 Jul ；75(14) :6692-9)和 Winter 等(Ann. Rev. Immunol. 12 :433,1994)。可用於構建抗體庫的噬菌體可以是絲狀噬菌體，例如，fd、 M13、Π、IfU Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pfl和Pf3，但不限於此。同樣，可用於異源基因在絲狀噬菌體表面表達的載體可以是噬菌體載體，如fUSE5、fAFFl、fd-CATl或fdtetDOG ；或噬菌粒載體,如pHEm、pComb3、pComb8或pSEX，但不限於此。進一歩，輔助噬菌體，其可用於提供成功再感染重組噬菌體所需的天然衣殼蛋白， 可由Mi;3K07或VSCM13示例，但不限於此。在本發明的具體實施例中，對人VCAM-I具有特異性的人抗體通過噬菌體展示技術被作為scFv獲得，並作為單噬菌體克隆篩選得到，從而獲得對人VCAM-I具有特異性的20 種單克隆噬菌體。在本發明的具體實施例中，檢查通過重組技術獲得的VCAM-I的分子量和純度，然後用於製備單克隆抗體。VCAM-I與來自具有多祥性的人天然scFv庫細胞的庫噬菌體發生反應，然後淘選和篩選牢固結合VCAM-I抗原的單克隆抗體(參見表1)。所選單克隆抗體通過指紋分析得到確認，然後經測序確定抗體VH和VL的⑶R區。通過NCBI網站(http:// www, ncbi. nlm. nih. Rov/iRblast/)的IgBLAST程序檢查上述抗體與種系抗體組之間的同源性。因此，得到20種對VCAM-I具有特異性的噬菌體抗體。進一歩，根據本發明的具體實施例，構建表達載體，該表達載體包含編碼所選20 種人抗體噬菌體的重鏈和輕鏈的多核苷酸或其片段，具有免疫活性。在構建表達載體吋，表達調控元件如啟動子、終止子和增強子；靶向膜或分泌的序列可結合目的被適當地選擇和聯合應用，其取決於意圖生成人抗體輕鏈和重鏈或其片段的宿主細胞。本發明的表達載體包括質粒載體、粘粒載體、細菌噬菌體載體、病毒載體或類似物，但不限於此。適當的表達載體包括靶向膜或分泌的信號序列或前導序列以及表達調控元件如啟動子、操縱子、起始密碼子、終止密碼子、多腺苷酸化信號和增強子，並可取決於其目的以多種形式構建。進一歩，根據本發明一個實施方式，本發明提供鑑定結合人重組單克隆抗體的人 VCAM-I抗原結構域位置的方法。已報告VCAM-I由7個IgG樣結構域組成，並且其結構域1和4實質上參與與其配體——整聯蛋白(α4β1或α4β7)——的結合。因此，為確定對於根據本發明所述的人重組單克隆抗體來說具有特異性的VCAM-I抗原表位，在具體實施例中進行下列程序。本發明人在表達和純化人VCAM-I抗原的各結構域(VD2、VD4、VD7)後通過ELISA 分析了 20種抗體的抗原結合區。因此，抗原結合區取決於抗體類型而不同，其中，獲得結合結構域1或2的抗體Η6和7ΗΤ (參見圖2)。進一歩，根據本發明所述的人重組單克隆抗體提供了對人VCAM-I抗原的親和力。 在本發明的具體實施例中，抗體與人VCAM-I抗原的締合/解離常數(KD值)通過BIAC0RE 分析被測定，從而確定親和力。發現抗體Η6和7ΗΤ對人VCAM-I具有強親和力(參見圖3)。 因此，發現Η6抗體對人VCAM-I抗原具有優越的結合能力，達約0. 6ηΜ的水平，並且7ΗΤ抗體對人VCAM-I抗原具有結合能力，達約6. 3ηΜ的水平。因此，根據本發明所述的人重組單克隆抗體可用於檢測VCAM-I的組合物和方法， 包括如下步驟檢測人重組單克隆抗體與生物樣本中的VCAM-I之間的抗原-抗體反應。進一歩，在本發明的具體實施例中，發現根據本發明所述的人重組單克隆抗體(Η6)抑制人白細胞(U937細胞)與用重組人VCAM-I或人TNF-α刺激的人內皮細胞 (HUVEC)之間的粘附，因為白細胞與活化的內皮細胞之間的相互作用由VCAM-I介導。根據本發明的一個實施方式，用不同濃度的抗體處理人VCAM-I固定的固體支撐板或HUVEC單層板。為檢查抗體是否抑制螢光標記的U937細胞和抗原的結合，測量螢光強度。結果，抗體顯示對於粘附的抑制活性。特別是，發現抗體即使在低濃度下也呈現強抑制活性(參見圖 4 禾ロ 5)。此外，在本發明中，確定在人白細胞(U937細胞)與人TNF-a刺激的人內皮細胞 (HUVEC)之間的相互作用中，根據本發明所述的人重組單克隆抗體抑制人白細胞進入人內皮細胞單層的滲透性，因為白細胞與活化的內皮細胞之間的相互作用由VCAM-I介導。在本發明的實施例中，用抗體處理在跨孔板(transwell plate)鋪的HUVEC單層，然後通過計數跨孔底部收集的U937細胞來確定HUVEC單層的U937細胞滲透性。結果，上述抗體對於滲透性顯示出強抑制活性(參見圖6)。進一歩，確定在用VCAM-I抗體(7HT)處理表達VCAM-I的小鼠的動脈內皮細胞吋， 炎性細胞的粘附和變移被有效抑制。其後，還確定在將抗體腹膜內注射到高脂肪飲食餵養的小鼠中吋，VCAM-I抗體(7HT)特異性結合動脈內皮細胞(圖11)。為檢查VCAM-I抗體 (7HT)對心血管疾病的治療效果，將ApoE-/-小鼠分為四組。第1組給予PBS，並以正常飲食餵養一周兩次；第2組給予對照抗體，4BT(10mg/kg)，並以高脂肪飲食餵養一周兩次；第 3組給予VCAM-I抗體，7HT (低劑量lmg/kg)，並以高脂肪飲食餵養一周兩次；以及第4組給予VCAM-I抗體，7HT (高劑量10mg/kg)，並以高脂肪飲食餵養一周兩次，進行12周。然後， 對主動脈損傷實施en-face技術以分析動脈硬化，發現第4組的動脈硬化相比於第2組顯著減輕(圖17和18)。此外，隨後製備和分析冷凍心臟切片以觀察主動脈弓中形成的動脈硬化。結果，發現第3和4組的動脈硬化減輕(圖19至21)。通過血液學分析，確定該結果並非歸因於膽固醇代謝/排洩(圖15)。實驗期間體重和消耗的飼料量沒有明顯差異(圖 14)。實驗後，進行毒性測試以檢查抗體的肝臟毒性(圖15)。經確定VCAM-I抗體(7HT)抑制VCAM-I的功能，導致動脈硬化緩解。
因此，由於本發明的人重組單克隆抗體對人內皮細胞上表達的VCAM-I具有強親和力，其可用於需要VCAM-I抗原識別的任何應用。特別是，其有效抑制白細胞至活化內皮細胞的粘附和變移，從而提供有效的對於VCAM-I介導的疾病如炎性疾病、心血管疾病和癌症的診斷和治療方法。因此，根據另ー個實施方式，本發明給出了提供炎性疾病、心血管疾病或癌症的診斷信息的方法，包括如下步驟檢測人重組單克隆抗體與疑患炎性疾病或癌症的對象的生物樣本中的VCAM-I之間的抗原-抗體反應；和用於炎性疾病、心血管疾病或癌症的診斷性組合物。也就是說，含有特異性結合人VCAM-I的單克隆抗體的診斷性組合物可用於診斷 VCAM-I表達相關的疾病或VCAM-I介導的疾病，例如，炎性疾病、心血管疾病或癌症。炎性疾病可選自腫瘤壞死因子-a (TNF- α )介導的疾病和腸道疾病，但不限於此。優選地，腫瘤壞死因子_α (TNF-α)介導的疾病可選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關節強直性脊椎炎、膿毒症、內毒素休克、血流動カ休克、膿毒症症候群、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、自身免疫性疾病、AIDS相關的機會性感染、關節炎、類風溼性脊椎炎、痛風、關節強直性痛風、 克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發性硬化症、麻風結節性紅斑(ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。進一歩，心血管疾病可選自心肌梗塞、心臟病發作、中風、心率失常、高血壓、高血脂和動脈硬化。進一歩，癌症可選自腦瘤和脊髄瘤、頭部和頸部癌症、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、間皮瘤、食管癌、胃癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、腎癌、前列腺癌、睪丸癌、生殖細胞腫瘤、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多發性骨髄瘤、肉瘤、惡性黑素瘤和皮膚癌。進一歩，診斷性組合物可包含根據本發明所述的人重組單克隆抗體。如本文所用，術語「生物樣本」可以是組織、細胞、全血、血清、血漿液、組織解剖樣本(腦、皮膚、淋巴結、脊髄)、細胞培養物上清液、破碎的真核生物細胞和細菌表達系統，但不限於此。通過使經處理或未經處理的生物樣本與本發明抗體發生反應，可檢測VCAM-I或 VCAM-I相關疾病的存在。如本文所用，術語「抗原-抗體複合物」指樣本中的VCAM-I抗原與識別抗原的本發明單克隆抗體的組合物質。這種抗原-抗體複合物的形成可通過選自如下的任意方法檢測比色法、電化學方法、螢光法、發光法、顆粒計數法、目測評估和閃爍計數法。但是，該方法不限於上述實例，並且具有多種應用。在本發明中，多種標記可用於檢測抗原-抗體複合物。其具體實例可選自酶、螢光物質、配體、發光物質、微粒和放射性同位素，但不限於此。適合用作標記的物質實例包括乙醯膽鹼酯酶、鹼性磷酸酶、β -D-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶和β -內醯胺酶，作為酶；螢光素、Eu3+、Eu3+螯合物和穴狀化合物，作為螢光劑；生物素衍生物，作為配體；吖啶酷、異氨基苯ニ醯胼衍生物，作為發光劑；膠體金、有色乳膠，作為微粒；和57Co、3H、125I、125I-Bonton Hunter試劑，作為放射性同位素。優選地，通過利用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)可檢測抗原-抗體複合物。ELISA技術包括直接ELISA，其利用識別粘附於支撐體的抗原的標記抗體；間接ELISA，其利用標記的第二抗體，該標記的第二抗體識別抗原-抗體複合物的捕獲抗體，其中抗原粘附於支撐體；直接夾心ELISA，其利用另ー種標記的抗體，該標記的抗體識別粘附於支撐體的抗原-抗體複合物的抗原；和間接夾心ELISA，其利用另ー種標記的第二抗體，該標記的第二抗體在與識別粘附於支撐體的抗原-抗體複合物的抗原的抗體反應後識別抗體。單克隆抗體可具有可檢測的標記，否則可通過處理可捕獲單克隆抗體並具有可檢測標記的另ー種抗體來檢測抗原-抗體複合物。本發明的人重組單克隆抗體，其特異性結合人VCAM-1，可単獨或與常規的載體一起以藥物組合物的形式用於預防和治療炎性疾病、心血管疾病或癌症。因此，在還有另一個實施方式中，本發明提供了炎性疾病、心血管疾病或癌症的預防性或治療性組合物，包含人重組單克隆抗體和藥學可接受的載體；和治療炎性疾病、心血管疾病或癌症的方法，包括向對象給予所述組合物的步驟。如本文所用，術語「對象」包括馬、狗、貓、豬、山羊、兔、倉鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、
蜥蜴、蛇、綿羊、牛、魚和鳥，並且意為任何動物(例如，人)。如本文所用，術語「預防」意為通過給予含有根據本發明所述的人重組單克隆抗體和藥學可接受的載體的組合物來使疾病的出現受限或延緩的所有行為。如本文所用，術語「治療」意為通過給予含有根據本發明所述的人重組單克隆抗體和藥學可接受的載體的組合物來使疾病轉好或有益地改變的所有行為。本發明的人重組單克隆抗體也可與其他抗體、生物活性劑或生物活性物質聯合應用，以用於多種用途。例如，本發明的人重組單克隆抗體可在以內皮中VCAM-I表達為特徵的疾病的治療中與其他抗VCAM-I抗體聯合應用。或者，本發明的人重組單克隆抗體可與識別炎性事件中所確定的其他內皮細胞受體(例如，ELAMU ICAMl等)的抗體和已知的炎性疾病治療藥物聯合應用。炎性疾病可選自腫瘤壞死因子-a (TNF- α )介導的疾病和腸道疾病，但不限於此。優選地，腫瘤壞死因子-a (TNF-α)介導的疾病可選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關節強直性脊椎炎、膿毒症、內毒素休克、血流動カ休克、膿毒症症候群、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、自身免疫性疾病、AIDS相關的機會性感染、關節炎、類風溼性脊椎炎、痛風、關節強直性痛風、 克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發性硬化症、麻風結節性紅斑(ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。進一歩，心血管疾病可選自心肌梗塞、心臟病發作、中風、心率失常、高血壓、高血脂和動脈硬化。進一歩，癌症可選自腦瘤和脊髄瘤、頭部和頸部癌症、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、間皮瘤、食管癌、胃癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、腎癌、前列腺癌、睪丸癌、生殖細胞腫瘤、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多發性骨髄瘤、肉瘤、惡性黑素瘤和皮膚癌。含有本發明的人重組單克隆抗體的組合物可以以藥學上有效的量以單劑或多劑給予。在此方面，組合物可以以溶液、粉末、氣溶膠、膠囊、腸溶片劑或膠囊或栓劑形式給予。 多種給予方式被考慮，包括腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、ロ服、局部、鼻內、肺內和直腸內，但本發明不限於這些示例性給予方式。但是，由於肽在ロ服給予時被分解，ロ服給予的組合物的活性成分應被包被或配製成以防止在胃中降解。此外，藥物組合物可利用某種能夠將活性成分輸送至目標細胞中的設備給予。含有本發明的人重組單克隆抗體的組合物可以藥學有效量被給予。「藥學有效量」 指在可適用於醫療或預防的合理利益/危險比下足以預防或治療疾病的量。有效劑量水平可根據如下確定疾病的嚴重程度；藥物活性；患者的年齢、重量、健康狀況和性別；患者的藥物敏感性；給予時間、途徑和釋放速率；治療持續時間；或包括與本發明組合物混合或同時施用的藥物的因素或其他醫學領域公知的因素。此外，含有本發明單克隆抗體的組合物可単獨或聯合其他治療劑給予，或者也可以相繼或同時的方式與常規的治療劑一起給予。在以藥學有效量給予本發明藥物組合物的情況下，本發明的人重組單克隆抗體， 其對VCAM-I具有強親和力，特異性結合內皮細胞上表達的VCAM-I並導致VCAM-I被中和。 最終，本發明的人重組單克隆抗體抑制白細胞與白細胞粘附和白細胞通過內皮細胞變移， 從而治療炎性疾病、心血管疾病和癌症。炎性疾病可選自腫瘤壞死因子-α (TNF-α)介導的疾病和腸道疾病，但不限於此。優選地，腫瘤壞死因子-a (TNF-a)介導的疾病可選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關節強直性脊椎炎、膿毒症、內毒素休克、血流動カ休克、膿毒症症候群、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、自身免疫性疾病、AIDS相關的機會性感染、關節炎、類風溼性脊椎炎、痛風、關節強直性痛風、克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發性硬化症、麻風結節性紅斑 (ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。進一歩，心血管疾病可選自心肌梗塞、心臟病發作、中風、心率失常、高血壓、高血脂和動脈硬化。進一歩，癌症可選自腦瘤和脊髄瘤、頭部和頸部癌症、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、間皮瘤、食管癌、胃癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、腎癌、前列腺癌、睪丸癌、生殖細胞腫瘤、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多發性骨髄瘤、肉瘤、惡性黑素瘤和皮膚癌。進一歩，根據又一方面，本發明提供了利用根據本發明所述的人重組單克隆抗體抑制白細胞與活化的內皮細胞粘附和白細胞通過活化的內皮細胞變移的方法。也就是說，VCAM-I結合炎症和免疫排斥中活化的白細胞上表達的VLA-4(非常晩期的抗原-4)和 α4β1整聯蛋白，並在促進內皮細胞與白細胞——包括單核細胞和T細胞——的相互作用中具有關鍵作用。根據本發明所述的單克隆抗體特異性結合VCAM-1，從而抑制白細胞與活化的內皮細胞之間的粘附和白細胞通過活化的內皮細胞變移。本文引用了多個出版物，在此將其全部內容引入作為參考。通過常規的實驗，本領域技術人員將知道或理解，本文考慮多種等同的實施方式。因此這種等同方式被意為包括在權利要求中。發明方式下文中，將參考實施例更詳細地描述本發明。但是，提供下列實施例僅為示例本發明的目的，因此其不意為本發明受限於此。1.製備人和小鼠的VCAM-I抗原1. 1.複製人 VCAM-I
包含人VCAM-I 基因的質粒(hMU012650) (Kugi # IRAU_75_G02)購自 KUGI (Korean UniGene ^formation)，由韓國生物科學與生物技術研究所(KRIBB)人類基因組功能分析中心提供。該質粒用作模板DNA，並且為了僅表達VCAM-I的D1-D2結構域和D1-D4結構域， 對於 VCAM-I 的 D1-D2 結構域各基因用正向引物(5，-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTTAAAATCGAGACC ACCCC-3，)和反向引物(5，-TAGCGGCCGACGCGGCCAATTGCAATTCTTTTACAGCCTG-3，)擴增，對於 VCAM-I 的 D1-D4 結構域各基因用正向引物(5，-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTTAAAATCGAGACCACCC C-3，)和反向引物(5，-TAGCGGCCGACGCGGCCAAGAGCTCCACCTGGATTCCCT-3')擴增。在 sfil 處理後，用連接酶分別將基因克隆到pI602-Fc載體和僅pI602-His載體(通過KRIBB構建的載體)中。在下列PCR條件下得到PCR產物對於50 μ 1的總反應體積，IOOng模板在 94°C下反應2min，然後在94°C下反應30sec，在55°C下反應30sec，和在72°C下反應Imin和 30sec(Dl-D4)和45sec (D1-D2)，進行30個循環，然後在72°C下反應lOmin。此外，檢查克隆的 pYK602-FC-VCAM-l-Dl-D2、pYK602-His-VCAM-l-Dl-D2, pYK602-FC-VCAM-l-Dl-D4 和 pYK602-His-VCAM-l-Dl-D4 載體的鹼基序列。1. 2.表達和純化VCAM-I蛋白質在多種蛋白質中，包含hVCAM-Fc-嵌合體(R&D系統，cat# :862_VC)和mVCAM-l_Fc 嵌合體(R&D系統，Cat# :643-VM)的整個分子是商業採購的，並如下進行具有各VCAM-I結構域的片段的表達和純化。首先，將5Χ1(^93Ε細胞在10個150mm直徑板中鋪平板，並在第二天， 用 PEI Q3966 =Polysciences, Inc, USA)處理克隆的 pYK602-VCAM-l-Dl_D2 載體和 PYK602-VCAM-1-D1-D4載體各20 μ g，以進行轉染。第二天，將培養基更換為無血清DMEM，然後每隔一天收集上清液，然後在10% SDS-PAGE凝膠中進行電泳並進行蛋白質印跡以分析表達水平。將上清液-其中 hVCAM-l-Dl-D2-Fc 和 hVCAM-l-Dl-D4_Fc 的表達被確定-
收集，並用0. 22μπι Top-過濾器(Millipore, Cat# =SCGP T05 RE)過濾，得到足量的蛋白質。在使用前如下純化蛋白質。首先，用PBS洗滌Econo-柱(Bio-Rad Cat. No 737-1006， 1 X5cm)，裝填500 μ 1蛋白質A(Amersham Cat. No. 17-1279-30)。在進行裝填的過程中，將 10ml PBS (pH 7. 4)施加於柱以洗滌小珠，並施加30ml的20mM磷酸鈉緩衝液(pH 7. 0)作為結合緩衝液。隨後，用蠕動泵(Bio-Rad Cat. No. 73ト8142)以0. 5ml/min的流速對其施加得到的上清液。結合至柱後，用PBS以aiil/min的流速將其洗滌lhr，然後進行洗脫。用 500 μ 1 0. IM甘氨酸-HCl (pH 2. 5)進行洗脫，並添加1/10體積的IM Tris-HCl (pH 9. 0)以進行中和。在6個洗脫餾分中，蛋白質主要在#1和#2餾分中被洗出。將這兩餾分置於10Κ 透析膜，然後在4L PBS中進行ο/η透析。上述過程均在4°C冷室中進行。定量後，將產物等分並儲存於_70°C下。純化後，在10% SDS-PAGE凝膠上確定產物。得到hVCAM-l-Dl-D2_Fc
和 hVCAM-l-Dl-D4-Fc，其量分別為 2. 8mg禾Π 800 μ g。將上清液-其中 hVCAM-l-Dl-D2_his
和hVCAM-l-Dl-D4-his 的表達被確定——收集，用 0. 22 μ m iTop-過濾器(Millipore，Cat# SCGP T05 RE)過濾，並用實驗室規模 TFF 系統(LabScale TFF System) (Millipore, Cat# XX42LSS11)的 pellicon XL 膜(Millipore, 8K, cat# :ΡΧΒ0 08A 50)濃縮至 1/10 體積。將 10倍體積的IMAC緩衝液(300mM KCl、50mM KH2P04、5mM咪唑，pH 8.0)加至該濃縮液，並用 IMAC緩衝液更換。根據製造商的說明，用ftOfiniaTM蛋白質純化系統(Bio-Rad)的生物規模的微型試驗 IMAC 盒(Bio-kle Mini profinity IMAC cartridge) (cat# :732-4610) 以lml/min的速率進行純化。將洗脫液在4°C下利用膜(10K，132574 :SPECTRAP0R, USA) 在4LPBS溶液中透析4hr或更長，然後再在4L預先冷卻的PBS溶液中透析過夜。ο/η透折後，將所得物轉移至e-管，並通過Bradford法測定蛋白質濃度。因此，得到400 μ g hVCAM-l-Dl-D4-his 和 hVCAM-l-Dl-D2_Fc 蛋白，並在 10% SDS-PAGE 凝膠中進行檢查。2.構建庫噬菌體將具有多祥性的2. 7X 101°人scFv庫細胞在包含50 μ g/ml氨苄青黴素和2%葡萄糖的SB培養基(30g細菌用胰蛋白腖、20g酵母提取物、IOg MOPS, pH 7.0)中於37°C下培養2-;3hrS (0D600 = 0. 5)。然後，用VCSM13輔助噬菌體感染該細胞，接著在包含70 μ g/ ml卡那黴素(kanamycin)和ImM IPTG的培養基中於30°C下培養16hrs。對細胞進行離心 (4500rpm, 15min, 4°C )，並得到上清液，該上清液被溶於補充4% PEG 6000和3% NaCl的溶液中，然後在冰中反應lhr。再次離心反應物(8000rpm，20min，4°C )。將小球溶於PBS，再次離心(12000rpm，10min,4°C )。由此，得到包含庫噬菌體的上清液，該上清液被轉移至新管中，並儲存於4°C。3.通過噬菌體展示進行生物淘選當由7個IgG樣結構域組成的VCAM-I結合其配體α 4β1整聯蛋白(α 4 β 1整聯蛋白)吋，已知其結構域1和4充當結合基序。因此，利用人VCAM-l-Dl-D4(hVCAM-l-Dl-D4) 和整個VCAM-I分子進行淘選。在此實施例中，將對hVCAM-l-Dl-D4的淘選方法和結果進行
fejdio3. 1.對 hVCAM-l-Dl-D2 和 hVCAM-l_Dl_D4 抗原的生物淘選首先將塗有10 μ g/ml人重組VACM-I (R&D系統，809-VR)抗原的免疫吸附管 (Nunc 470319)用脫脂乳/PBS封閉，並與製備的庫噬菌體(1 XlO12Cfu) —起在室溫下培養 Ι-airs。用TBST (0. 05% )將該管洗滌三次。將結合的噬菌體用Iml新制的IOOmM三乙胺溶液在室溫下洗脫lOmin。將洗脫的噬菌體用IM Tris (pH 7.4)中和，並感染進大腸桿菌 (E. coli) (ER2537)，和在37°C下培養lhr。將被感染的大腸桿菌在包含2%葡萄糖和氨苄青黴素的LB-瓊脂糖培養基板(直徑15cm)上鋪平板，並在37°C下培養16hr。將培養的大腸桿菌分散在5mL SB中，並將其50ml接種在20ml SB-氨苄青黴素-葡萄糖中，得到包含根據<1.構建庫噬菌體〉的方法所述的結合噬菌體的溶液，然後用於下輪淘選。對於第1輪淘選後的第2-4輪淘選，免疫吸附管分別塗有hVCAM-l-Dl-D2和hVCAM_l_Dl_D4抗原中每一種，並進行每一輪淘選(參見表1)。表1hVCAM-1-Dl-D 和 hVCAM-l_Dl_D4 抗原的淘選結果
權利要求
1.人重組單克隆抗體，其特異性結合人血管細胞粘附分子-I(VCAM-I)以抑制白細胞與活化的內皮細胞之間的粘附和白細胞通過所述活化的內皮細胞變移。
2.根據權利要求1所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體結合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)的結構域1或2。
3.根據權利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體含有重鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO. 2限定的重鏈⑶Rl、SEQ ID NO. 3限定的重鏈⑶R2 和SEQ ID NO. 4限定的重鏈⑶R3;和輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO. 6限定的輕鏈CDRUSEQ ID NO. 7限定的輕鏈CDR2和SEQ ID NO. 8限定的輕鏈CDR3。
4.根據權利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體含有SEQID NO. 1限定的重鏈胺基酸序列。
5.根據權利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體含有SEQID NO. 5限定的輕鏈胺基酸序列。
6.根據權利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體與人VCAM-I 抗原的締合/解離常數(KD值)為0. 1 X 10、至7. OX 10—1。
7.根據權利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體含有重鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO. 10限定的重鏈⑶R1、SEQ ID NO. 11限定的重鏈⑶R2 和SEQ ID N0. 12限定的重鏈⑶R3 ；和輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含SEQ ID N0. 14限定的輕鏈CDRU SEQ ID N0. 15限定的輕鏈CDR2和SEQ IDN0. 16限定的輕鏈CDR3。
8.根據權利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體含有SEQID N0. 9限定的重鏈胺基酸序列。
9.根據權利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體含有SEQID N0. 13限定的輕鏈胺基酸序列。
10.提供炎性疾病、心血管疾病或癌症的診斷信息的方法，包括如下步驟檢測權利要求1-9中任一項所述的人重組單克隆抗體與疑患炎性疾病或癌症的對象的生物樣本中的 VCAM-I之間的抗原-抗體反應。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述炎性疾病選自腫瘤壞死因子-α(TNF-a) 介導的疾病和腸道疾病。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述腫瘤壞死因子-a(TNF-a)介導的疾病選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關節強直性脊椎炎、膿毒症、內毒素休克、血流動カ休克、膿毒症症候群、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、癌症、自身免疫性疾病、AIDS相關的機會性感染、關節炎、類風溼性脊椎炎、痛風、關節強直性痛風、克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發性硬化症、麻風結節性紅斑(ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。
13.根據權利要求10所述的方法，其中所述心血管疾病選自心肌梗塞、心臟病發作、中風、心率失常、高血壓、高血脂和動脈硬化。
14.抑制白細胞與活化的內皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內皮細胞變移的方法，其利用權利要求1-9中任一項所述的人重組單克隆抗體。
15.用於炎性疾病、心血管疾病或癌症的診斷性組合物，其含有權利要求1-9中任ー項所述的人重組單克隆抗體。
16.根據權利要求15所述的組合物，其中所述炎性疾病選自腫瘤壞死因子-a (TNF- α )介導的疾病和腸道疾病。
17.根據權利要求16所述的組合物，其中所述腫瘤壞死因子-α(TNF-α)介導的疾病選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關節強直性脊椎炎、膿毒症、內毒素休克、血流動カ休克、膿毒症症候群、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、癌症、自身免疫性疾病、AIDS相關的機會性感染、關節炎、類風溼性脊椎炎、痛風、關節強直性痛風、克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發性硬化症、麻風結節性紅斑(ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。
18.根據權利要求15所述的組合物，其中所述心血管疾病選自心肌梗塞、心臟病發作、 中風、心率失常、高血壓、高血脂和動脈硬化。
19.用於炎性疾病、心血管疾病或癌症的預防性或治療性組合物，其含有權利要求1-9 中任一項所述的人重組單克隆抗體和藥學可接受的載體。
20.根據權利要求19所述的組合物，其中所述炎性疾病選自腫瘤壞死因子-a (TNF- a )介導的疾病和腸道疾病。
21.根據權利要求20所述的組合物，其中所述腫瘤壞死因子-a(TNF-α)介導的疾病選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關節強直性脊椎炎、膿毒症、內毒素休克、血流動カ休克、膿毒症症候群、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、癌症、自身免疫性疾病、AIDS相關的機會性感染、關節炎、類風溼性脊椎炎、痛風、關節強直性痛風、克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發性硬化症、麻風結節性紅斑(ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。
22.根據權利要求19所述的組合物，其中所述心血管疾病選自心肌梗塞、心臟病發作、 中風、心率失常、高血壓、高血脂和動脈硬化。
23.治療炎性疾病、心血管疾病或癌症的方法，包括如下步驟向對象給予權利要求19 所述的組合物。
全文摘要
本發明涉及人重組單克隆抗體，其特異性結合人血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)以抑制白細胞與活化的內皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內皮細胞的變移；和涉及包含該人重組單克隆抗體的用於炎性疾病或癌症的預防性和治療性組合物。根據本發明所述的人重組單克隆抗體對人內皮細胞上表達的VCAM-1顯示強親和力，並有效抑制VCAM-1介導的白細胞與活化的內皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內皮細胞的變移，從而被用於預防和治療炎性疾病如哮喘和關節炎、移植排斥、心血管疾病和癌症。
文檔編號C07K16/18GK102574916SQ201080047819
公開日2012年7月11日 申請日期2010年10月22日 優先權日2009年10月23日
發明者姜慶在, 尹志容, 成炳濟, 文慶德, 李東垠, 李東憲, 李廷泰, 柳修娟, 沈炫輔 申請人:韓華石油化學株式會社