一種重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法
2023-05-18 19:59:06
一種重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法
【專利摘要】本發明涉及一種重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法。本發明在誘導產生包涵體後，通過優化的裂解方法破碎菌體，初步去除了一部分雜質，接著通過對包涵體進行一系列處理，使得包涵體形成可溶性目標蛋白，避免了使用尿素、鹽酸胍等變性劑對包涵體的變性溶解和復性。而鎳柱親和層析使得可以純化獲得的蛋白量比較大，具有純度高，操作簡單等優點。本發明從不溶性包涵體中分離純化出來可溶性的目的蛋白，避免了反覆變性復性的繁瑣步驟以及復性過程中的蛋白沉澱的危險，並且所獲得的蛋白純度可以達到電泳純。
【專利說明】-種重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法。
【背景技術】
[0002] 豬圓環病毒II型（Porcine circovirus type 2, PCV2)是引起斷奶仔豬多系統衰 竭症候群（PMWS)的主要病原。自1991年首次在加拿大發生PMWS以來，現在全世界大多數 養豬國家均有該病的報導，給全世界養豬業造成了重大的經濟損失。PCV 2基因組11個 開放閱讀框（open reading frames, ORFs)中0RF 2是主要的開放閱讀框。在PCV2中， 0RF2起始密碼子起始於第1033或1034位核苷酸，共有702個鹼基，編碼234個胺基酸(基 因序列反義鏈上0RF2終止子由TAA變為AAG，而造成0RF2閱讀框加長，全長705bp，其終止 子為TGA)，編碼分子量約為30kDa的主要功能蛋白一Cap蛋白。Cap蛋白作為病毒的主要 結構蛋白，構成PCV2的核衣殼，而且也是PCV2的主要免疫保護性抗原，能誘導動物機體產 生特異性免疫應答，是研製PCV2亞單位疫苗的理想靶抗原。目前市場上銷售的豬圓環病毒 疫苗有全毒株疫苗即滅活疫苗和減毒活疫苗，以及通過昆蟲細胞培養以及腺病毒表達系統 進行生產的衣殼蛋白亞單位疫苗。但是全毒株病毒有毒力恢復的潛在危險，而通過昆蟲細 胞培養獲和腺病毒表達系統獲得的亞單位疫苗價格昂貴。
[0003] 大腸桿菌是一種廉價且技術成熟的表達系統，其遺傳背景清楚、繁殖能力強、培養 周期短、目標基因表達水平高，某些外源基因在大腸桿菌中的表達量可達總蛋白的5 %? 30 %，且下遊工藝簡單、易於控制，抗汙染能力強，代謝途徑和基因表達調控機制比較清楚， 已有大量可供選擇利用的表達載體。被美國FDA批准為安全的基因工程受體生物，運用非 常廣泛。另外，目前報導研究豬圓環病毒衣殼蛋白作為亞單位疫苗的研究很多，但是用於工 業化生產的研究並不是很透徹。
[0004] 高超[豬圓環病毒2型0RF2基因原核表達蛋白間接ELISA檢測方法的建立及應 用[J] ·中國獸醫學報，2008,28⑶：888-891.]利用PCV2 0RF2內含的Eco/PI酶切位點， 及載體上含有的ΧΑοΙ酶切位點，從已構建的克隆質粒PMD-0RF2上切除含5'端核定位信號 區域，將截短的0RF2基因片段克隆到pGEX-6p-l表達載體上，並將重組表達質粒轉化入大 腸桿菌感受態BL21中，通過IPTG誘導表達重組菌，重組蛋白表達產物以包涵體形式存在於 菌體中，進行超聲波裂解菌體，包涵體洗滌、溶解及尿素梯度透析復性，最後電洗脫法純化 重組蛋白。本發明在誘導產生包涵體後，通過優化的裂解方法破碎菌體，初步去除了一部分 雜質，接著通過對包涵體進行一系列處理，使得包涵體形成可溶性目標蛋白，避免了使用尿 素、鹽酸胍等變性劑對包涵體的變性溶解和復性。而鎳柱親和層析使得可以純化獲得的蛋 白量比較大，具有純度高，操作簡單等優點，為開發商業化的豬圓環病毒基因工程亞單位疫 苗以及相關研究提供了工業化的理論基礎及為重組疫苗進行商業化提供了理論依據。
【發明內容】
[0005] 鑑於此，本發明提供了一種重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法。
[0006] 本發明採取的技術方案如下： 一種重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，包括重組菌的誘導表達、菌體 破碎和裂解、鎳柱親和層析純化、透析。
[0007] 所述重組菌的製備：豬圓環病毒II型病毒的開放閱讀框0RF2基因的576bp整合到 載體pET28a上，導入到宿主大腸桿菌BL-21 (DE3)中，得到重組菌。
[0008] 所述菌體破碎和裂解的步驟包括：用PBS緩衝液洗滌菌體，溶菌酶處理30min，離 心後去除部分雜蛋白，經過兩次的TritonX-100的裂解洗滌，獲得含目的蛋白的沉澱，用含 有0. 5% (v/v)脫氧膽酸鈉的PBS緩衝液溶解沉澱，獲得可溶性目的蛋白。
[0009] 具體步驟如下： ⑴：洗滌菌體，按每克溼重菌體用15ml PBS緩衝液重複洗滌，高速離心，棄上清，離心 條件為 8000rpm，4°C，5 min ; ⑵：溶菌酶破壞細胞壁，使用濃度為1?l〇mg/ml的溶菌酶裂解大腸桿菌，37°C，震蕩 30min，高速離心，棄上清，收集沉澱； ⑶加入去汙劑TritonX-ΙΟΟ,使終濃度為0. 5% (v/v)，充分混勻，此時溶液變得粘稠， 說明細菌細胞內的核酸釋放出來，細菌裂解，加入DNase I，終濃度lug/ml，充分混勻，待溶 液不再粘稠，說明核酸被降解，高速離心，棄上清，收集沉澱；為了使菌體充分裂解，再次用 PBS緩衝液重懸沉澱，加入TritonX-ΙΟΟ,使終濃度為0. 5%(v/v)，充分混勻，高速離心，收集 沉澱； ⑷：獲得含包涵體沉澱，使用含有0. 5% v/v脫氧膽酸鈉的PBS緩衝液溶解沉澱，靜置 30min，離心，上清含有較多目的蛋白，而且該目的蛋白為可溶性，即為所獲得的上清液。 [0010] 所述PBS緩衝液為pH=7. 4、50mM PBS緩衝液。
[0011] 所述鎳柱親和層析純化的步驟包括：上樣即步驟四所獲得的上清液，後用 bufferA平衡鎳柱，bufferB洗漆雜蛋白，bufferC洗脫並收集目的蛋白。
[0012] 具體步驟如下： ① 鎳柱的平衡 (1) 5倍柱體積的bufferA洗漆鎳柱； (2) 1M NaOH洗滌柱子，確保NaOH與鎳柱至少結合30min ; (3) 去離子水衝洗鎳柱，使得鎳柱pH小於9 ; (4) 5倍柱體積的bufferA平衡鎳柱； ② 上樣：樣品需要經過高速離心去除顆粒較大的雜質，或者用〇. 45um孔徑的濾膜過 濾； ③ 緩衝液平衡柱料：上完樣品後用10倍柱體積的bufferA再平衡鎳柱； ④ bufferB洗漆雜蛋白； ⑤ bufferC洗脫並收集目的蛋白。
[0013] 所用 bufferA 為 pH=7. 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl ; bufferB 為 ρΗ=7· 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl，lOOmM 咪唑； bufferC 為 ρΗ=7· 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl，250mM 咪唑。
[0014] 本發明的技術路線如圖1所示。
[0015] 本發明從不溶性包涵體中分離純化出來可溶性的目的蛋白，避免了反覆變性復性 的繁瑣步驟以及復性過程中的蛋白沉澱的危險，並且所獲得的蛋白純度可以達到電泳純。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發明的技術路線圖。
[0017] 圖2為目的蛋白的SDS-PAGE以及western blot檢測結果，其中1-3上樣，穿流峰， 100mM咪唑洗脫峰，4-6 250mM咪唑洗脫峰。
[0018] 圖3純化的目的蛋白的SDS-PAGE。
【具體實施方式】
[0019] 1重組細菌的誘導表達 本實驗室所用病毒毒株來自福州大北農生物科技有限公司，通過擴增獲得該 豬圓環病毒II型病毒的開放閱讀框0RF2基因的576bp，其中整合到該基因上Nco I和 Xho I兩個酶切位點，雙酶切該基因，並且用相同的酶切體系消化pET28a載體，酶連0RF2基 因和pET28a載體，轉化到克隆菌種T0P10中，測序驗證，然後將該質粒導入到宿主大腸桿菌 BL-21(DE3)中，IPTG誘導表達，通過SDS-PAGE以及Western blot技術分析，檢測到有目的 蛋白的表達，並且該目的蛋白以包涵體形式存在。
[0020] 2工程菌的發酵 將保存的工程菌種在含有的kana抗性的LB培養基平板上畫線，37°C活化過夜，挑取表 面光滑，顆粒較大的菌落，37°C擴大培養10h，培養條件為37°C，200rpm。將菌液按1:100轉 接到含有kana抗性的LB液體培養基中。待菌體生長到對數期時加入誘導物IPTG，終濃度 為lmg/ml，繼續培養10h，培養條件為37°C，200rpm。
[0021] 所用kana抗生素濃度為50ug/ml。
[0022] 所用LB培養基配方如下： Yeast extract (0. 5% w/w) NaCl (1% w/w) Tryptone (1% w/w)〇
[0023] 3細菌的優化破碎方法 高速離心收穫菌體，其中每l〇〇ml培養液約含菌體0. 5~0. 7g，破碎菌體。其中破碎菌體 方法較多，高壓均質裂解法、超生裂解法、化學裂解液裂解法、酶解法、反覆凍融法等等各種 方法。
[0024] 本實驗通過一種新的方法來從包涵體中獲取可溶性目的蛋白。
[0025] 步驟詳細如下： ⑴：洗滌菌體，按每克溼重菌體用15ml PBS重選洗滌。高速離心，棄上清。離心條件為 8000rpm,4°C ,5 min〇
[0026] ⑵：溶菌酶破壞細胞壁。使用濃度為1?10mg/ml的溶菌酶裂解大腸桿菌，37°C， 震蕩30min。高速離心，棄上清，收集沉澱。由於大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，單獨使用溶菌酶 效果不理想。
[0027] ⑶去汙劑裂解大腸桿菌PBS重懸沉澱，加入去汙劑TritonX-100,終濃度為0. 5%， 充分混勻，此時溶液變得粘稠，說明細菌細胞內的核酸釋放出來，細菌裂解，加入DNase I， 終濃度lug/ml，充分混勻，此時可以使用功率較小的超聲波清洗器來加速溶液的混勻，但必 須加入冰，確保溫度不至於升高太快。待溶液不再粘稠，說明核酸被降解，高速離心，棄上 清。收集沉澱。為了使菌體充分裂解，再次用PBS重懸沉澱，加入TritonX-ΙΟΟ,充分混勻， 高速離心，收集沉澱。
[0028] (4):經過前幾步的裂解菌體以及去汙劑的使用，可以獲得含包涵體沉澱，使用含有 0. 5%的脫氧膽酸鈉的PBS溶解沉澱，靜置30min，離心，上清含有較多目的蛋白，而且該目的 蛋白為可溶性。該方法的優點是破碎菌體時雖然使用了溶菌酶，但是離心後將該雜蛋白去 除，並且經過兩次的TritonX-100的裂解洗滌，去除了較多的雜蛋白，為以後的純化帶來了 方便。
[0029] 其中PBS緩衝液為50mM的磷酸鹽緩衝液，ρΗ=7· 4。
[0030] 4鎳柱親和層析 詳細步驟如下： ①鎳柱的平衡 (1) 5倍柱體積的bufferΑ洗漆鎳柱； (2) 1M NaOH洗滌柱子，確保NaOH與鎳柱至少結合30min ; (3) 去離子水衝洗鎳柱，使得鎳柱pH小於9 ; (4) 5倍柱體積的bufferA平衡鎳柱。
[0031] ②上樣，樣品需要經過高速離心去除顆粒較大的雜質，或者用0. 45um孔徑的濾 膜過濾。對於每毫升柱料流速不超過〇. 2ml/min。
[0032] ③緩衝液平衡柱料，上完樣品後用10倍柱體積的buff erA再平衡鎳柱。
[0033] ④bufferB洗漆雜蛋白。經過大量實驗的摸索，發現100mM的咪唑可以洗脫下絕 大多數雜蛋白。
[0034] ⑤bufferC洗脫並收集目的蛋白。
[0035] SDS-PAGE以及western blot檢測結果如圖2所示。標有箭頭的為純化的目的蛋 白，以及western blot檢測結果。
[0036] 所用 bufferA 為 pH=7. 4 ;20mM Na3P04 ;0· 5M NaCl ; bufferB 為 ρΗ=7· 4 ;20mM Na3P04 ;0· 5M NaCl; lOOmM 咪唑； bufferC 為 ρΗ=7· 4 ;20mM Na3P04 ;0· 5M NaCl; 250mM 咪唑； ⑥純化的目的蛋白的透析和濃縮 將純化的目的蛋白放入到透析袋中，在PBS緩衝液透析4h，然後重新換緩衝液透析過 夜。隨後將透析袋取出，並用聚乙二醇20000進行濃縮，獲得的蛋白濃度較高，達到0. 3mg/ ml，如圖3。
[0037] 5總結展望 目前對不溶性蛋白，尤其是包涵體的純化依然是個難題，本實驗通過優化破碎菌體，減 少了純化時的雜蛋白的汙染，其次，使用較溫和的表面活性劑溶解包涵體。通過該步驟可以 使50%的包涵體溶解。並且通過鎳柱親和層析獲得非常純的重組蛋白，為工業化純化包涵 體提供了新的思路。
【權利要求】
1. 一種重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，其特徵在於：包括重組 菌的誘導表達、菌體破碎和裂解、鎳柱親和層析純化、透析；所述菌體破碎和裂解的步驟 包括：用PBS緩衝液洗滌菌體，溶菌酶處理30min，離心後去除部分雜蛋白，經過兩次的 TritonX-ΙΟΟ的裂解洗滌，獲得含目的蛋白的沉澱，用含有0. 5%v/v脫氧膽酸鈉的PBS緩衝 液溶解沉澱，獲得可溶性目的蛋白。
2. 根據權利要求1所述的重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，其特徵在 於：所述菌體破碎和裂解的步驟，具體步驟如下： ⑴：洗滌菌體，菌體用PBS緩衝液重複洗滌，高速離心，棄上清，離心條件為8000rpm， 4°C , 5 min ； ⑵：溶菌酶破壞細胞壁，使用濃度為1?l〇mg/ml的溶菌酶裂解大腸桿菌，37°C，震蕩 30min，高速離心，棄上清，收集沉澱； ⑶加入去汙劑TritonX-ΙΟΟ,使終濃度為0. 5%v/v，充分混勻，此時溶液變得粘稠，說明 細菌細胞內的核酸釋放出來，細菌裂解，加入DNase I，終濃度lug/ml，充分混勻，待溶液不 再粘稠，說明核酸被降解，高速離心，棄上清，收集沉澱；為了使菌體充分裂解，再次用PBS 緩衝液重懸沉澱，加入TritonX-ΙΟΟ,使終濃度為0. 5%(v/v)，充分混勻，高速離心，收集沉 澱； ⑷：獲得含包涵體沉澱，使用含有0. 5% v/v脫氧膽酸鈉的PBS緩衝液溶解沉澱，靜置 30min，離心，取上清，得到可溶性目的蛋白。
3. 根據權利要求1或2所述的重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，其特 徵在於：所述PBS緩衝液為pH=7. 4、50mM PBS緩衝液。
4. 根據權利要求1所述的重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，其特徵在 於：所述鎳柱親和層析純化的步驟包括：上樣後用bufferA平衡鎳柱，bufferB洗漆雜蛋白， bufferC洗脫並收集目的蛋白。
5. 根據權利要求4所述的重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，其特徵在 於：所用 bufferA 為 pH=7. 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl ; bufferB 為 ρΗ=7· 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl，lOOmM 咪唑； bufferC 為 ρΗ=7· 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl，250mM 咪唑。
6. 根據權利要求4所述的重組豬圓環病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，其特徵在 於：所述鎳柱親和層析純化，具體步驟如下： ① 鎳柱的平衡 (1) 5倍柱體積的bufferA洗漆鎳柱； (2) 1M NaOH洗滌柱子，確保NaOH與鎳柱至少結合30min ; (3) 去離子水衝洗鎳柱，使得鎳柱pH小於9 ; (4) 5倍柱體積的bufferA平衡鎳柱； ② 上樣：樣品需要經過高速離心去除顆粒較大的雜質，或者用〇. 45um孔徑的濾膜過 濾； ③ 緩衝液平衡柱料：上完樣品後用10倍柱體積的bufferA再平衡鎳柱； ④ bufferB洗漆雜蛋白； ⑤ bufferC洗脫並收集目的蛋白。
【文檔編號】C12R1/19GK104109704SQ201410324737
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月9日 優先權日:2014年7月9日
【發明者】呂暾, 王立波, 喬春曉, 王偉東, 莊星來, 洪晶, 林拱陽, 陳晟生 申請人:福州大學, 福州大北農生物技術有限公司