一種tbx5蛋白的表達方法
2023-05-19 06:59:56 1
專利名稱：一種tbx5蛋白的表達方法
技術領域：
本發明涉及生物技術及生物醫藥製品領域，具體地說，涉及一種 TBX5蛋白的表達方法。
背景技術：
生物科技的迅猛發展，人們能利用DNA重組技術，將所需的編碼蛋白的DNA序列克隆到表達載體上，實現目的蛋白的大量表達。使用細菌或者真核細胞表達外源蛋白的可行性在生物技術領域有巨大潛力，近十年來，利用基因工程手段生產商業化的蛋白質需求急劇增加。大腸埃希氏菌(E. coli)已經是世界上最廣泛使用的用於蛋白表達系統。由於大腸埃希氏菌的遺傳背景清楚，易於生長和控制，花費低廉，重組蛋白的表達效率高，因此長 期以來，大腸埃希氏菌是實驗室和工業水平生產蛋白的最廣泛的方法。目前有各種各樣的大腸埃希氏菌菌株及與之匹配的具各種特性的質粒可供選擇。如PET系列，pGEX系列等。pET系統是在E. coli中克隆和表達重組蛋白的最廣泛也最強大的系統。目的基因被克隆到PET質粒載體後，受噬菌體T7強轉錄及可選擇的翻譯信號控制，宿主細胞提供表達所需要的17 RNA聚合酶。通過加入誘導劑IPTG誘導目的基因表達。表達載體除具有蛋白表達所需要的啟動子外，在終止子前有6個His編碼序列，便於蛋白的親和層析純化。外源蛋白在E. coli中的表達，可能以可溶形式存在，也可能以包涵體形式存在。尤其在高水平表達的條件下，更容易形成包涵體。對於可溶性蛋白和包涵體，均可用BugBuster等蛋白抽提試劑或超聲裂解的方法裂解菌體抽提蛋白。近年來隨著生物技術的進步，特別是基因工程的突飛猛進，表達蛋白已經變得很容易，相對而言，純化卻是一個非常繁雜的工作，所以越來越多的研究者把需要表達的目標蛋白和親和純化用的標籤融合表達，這樣純化相對得比較容易，即使如此，由於蛋白的多樣性，純化依然是比較複雜而專業的工作，尤其對於不熟悉純化的研究者而言，它成為一個項目的瓶頸。蛋白純化的方法取決於多目的蛋白的屬性，細胞內形成的區域與形式，PET載體，宿主菌背景及表達蛋白的應用。通常純化蛋白使用的是親和層析的方法。親和層析是蛋白質或生物大分子與結合在介質上的配基特異結合，如採用結合有鎳的瓊脂糖在變性或非變性條件下對融合蛋白進行分離純化。鎳對6XHis-tag蛋白具有特異吸附能力，能夠高效一步純化帶有6個組氨酸親和標籤的蛋白。該系統在天然或變性條件下，對來源於各種表達系統(如杆狀病毒，哺乳細胞，酵母以及細菌)中的His標籤蛋白，均有很好的純化效果。但在研究過程中，經常遇到蛋白保留在層析柱中難洗脫的現象，採用更強的洗脫條件如500mM咪唑，仍不能洗脫，直接用500mM咪唑加到6M鹽酸胍去洗脫，也有一大部分目的蛋白仍然吸附在親和柱上。所以，對於那些用這些常用方法難於洗脫的蛋白，找到一種能夠充分洗脫的方法具有重要意義。TBX5基因於1997年在Holt-Oram症候群(HOS)中被鑑別並克隆，是近年來發現的、在心臟發育過程中起重要作用的一個轉錄因子。人TBX5基因定位於12q24. 1，屬於T-box轉錄因子家族，編碼518個胺基酸，在胚胎心臟和發育中的肢體組織中表達。TBX5基因在脊椎動物進化過程中高度保守。在心臟發育，尤其是房室腔初始分化過程中起著十分關鍵的作用。在心臟發育早期，TBX5在整個心臟均勻表達；當線性心管形成時，TBX5表達呈梯度方式，後部最強，向前漸弱；當心管環化時，TBX5表達不均勻的情況愈加明顯，只在未來左心室區域表達，在未來右心室和流出道區域不表達，直到心臟發育成熟，這種表達方式都保持不變。TBX5基因在早期心臟發育中的這種動態的表達方式對於心臟的正常發育，尤其是心房和左心室的正常發育是必須的。而TBX5基因表達受到精確調控，TBX5基因表達量過低或過高都將導致心臟和手畸形的發生。TBX5與另兩個轉錄因子NKX2. 5、GATA4之
間存在著複雜的相互作用，在心臟發育中起主要作用，共同調控許多下遊基因的表達。尤其最近的研究發現，採用TBX5，GATA4和MEF2C這三個轉錄因子可以把成纖維細胞轉分化為心肌細胞，從而用於心臟再生醫學的治療與研究。但其具體的作用機制及作用途徑仍不清楚。因此，為了更透切地研究TBX5的基因功能，需要得到高濃度和高純度的TBX5蛋白。以往採用的蛋白表達系統所獲得的蛋白濃度低，不能滿足研究及以後臨床應用的需要，因此迫切需要建立一種高效表達及分離純化TBX5蛋白的方法。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種高效簡便的生產高濃度、高純度野生型TBX5蛋白的新方法，尤其是涉及此蛋白的分離純化方法。本發明的野生型TBX5蛋白的表達方法，包括如下步驟
(1)誘導表達基於原核系統誘導表達，裂解菌體；
(2)分離純化利用鎳柱親和層析來分離純化所得菌體裂解上清中的TBX5蛋白。在上述表達方法中，所述的原核系統誘導表達是重組表達質粒轉化感受態細菌後，加入LB培養液，37°C振蕩培養過夜，然後按2:1或者3:1體積比，轉換到minimal M9中並加入0. 5mM IPTG，誘導表達。在上述表達方法中，所述的原核系統誘導表達是重組表達質粒轉化BL21後，加入LB培養液，37°C振蕩培養過夜，然後加大LB體積37°C振蕩培養至OD值到達I. 5以上後轉入minimal M9，加入0.5mM IPTG，在18°C或37°C溫度下誘導表達。在上述表達方法中，所述的重組表達質粒是pET-30aSH_TBX5，所述重組表達質粒pET-30aSH-TBX5是將克隆獲得的TBX5基因PCR產物，經Nco I/Hind III雙酶切後，與pET載體連接，然後轉化大腸桿菌，再挑選陽性克隆進行鑑定。在上述表達方法中，所述裂解菌體為超聲波機械破碎菌體。在上述表達方法中，所述的分離純化是預裝鎳親和層析柱，採用5倍柱體積蒸餾水洗柱，然後用5倍柱體積的結合緩衝液平衡柱，將離心得到的菌體上清過柱，收集流出液，然後用含和不含IOmM咪唑的洗滌緩衝液進行洗滌；最後用洗脫液進行洗脫，收集目的蛋白。在上述表達方法中，所述洗脫液的配方按質量百分數計算，含有10%甘油，2%SDS，餘量為水。可以選擇在常溫或者37°C攪拌30分鐘，加速蛋白的洗脫。本發明所述的TBX5 蛋白在 NCBI 網站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)的基因 ID為6910。
本發明中的各原料均可從生物化學試劑公司購買得到，可按照本領域常規方法配製而成，這些方法為本領域普通技術人員所通曉。與現有技術相比，本發明的有益效果是
本發明採用高濃度的蛋白誘導表達方法，提高了細菌中目的蛋白的產量，裂解菌體過程中沒有進行包涵體的變性和復性，而是直接從超聲裂解的上清中純化蛋白，使得目的蛋白的回收率和活性得到了最大程度的保持，而且通過優化洗脫方案使得目的蛋白的獲取量較之現有方法也有了較大的提高。本發明的TBX5與鎳親和柱的結合較牢固，不易被普通方法所洗脫。本發明的洗脫液配方中同時含有甘油和SDS，且兩者以一定比例的混合， 使得結合牢固的TBX5蛋白容易被洗脫下來。
圖I是TBX5在不同溫度和不同時間梯度時的表達。圖2是採用高濃度的方法來誘導TBX5蛋白的表達。圖3是不同的洗脫方式對TBX5蛋白的洗脫效果。圖4是TBX5分離純化後的Dot blotting檢測。
具體實施例方式 以下通過實施例來進一步描述本發明，應該理解的是，這些實施例僅用於例證的目的，決不限制本發明的保護範圍。實施例I本發明所需溶液的製備
D10XTBE Tris base 108g MddH2O 600ml 充分溶解，加Boric acid 55g，0.5M EDTA(pH8. 0) 20ml，定容至 Ho2) 0. 7% 瓊脂糖凝膠0. 7gAgarose，加 I X TBElOOml，微波煮沸。3)30%丙烯醯胺29g丙烯醯胺和Ig亞甲雙丙烯醯胺溶於60ml水中，37°C加熱至完全溶解，補加水至終體積100ml，查證該溶液pH值小於7. 0，置於棕色瓶中室溫保存。4) 10%過硫酸胺Ig過硫酸胺溶解於IOmlddH2O中，4°C保存。5)1. 5mol/L Tris (pH8. 8)80ml ddH20 中加 18. 15g Tris base,加濃鹽酸調節至pH8. 8，定容至 IOOmlo6) lmol/L Tris (pH6. 8) :80ml ddH20 中加 12. Ilg Tris base,加濃鹽酸調節至pH6. 8，定容至 IOOmlo7) 5 X SDS 電泳緩衝液15. Ig Tris base，94g Glycine, 50ml 10%SDS，加水定容
到Ho8)4X SDS 上樣緩衝液200mM Tris HCL (pH=6. 8) 4ml, SDS I. 6g，溴酚藍 0. 08g，40%甘油8ml，加水定容至20ml
9) LB Medium 10g胰蛋白腖，5g酵母提取物，IOgNaCl，加900ml水，調節pH至7. 5，定
容至IL後高溫高壓滅菌。10) 5XM9 Salts :Na2HP04*7H20 64g, KH2PO4 15g, NaCl 2. 5g, NH4Cl 5g，加水定容至1L,高溫高壓滅菌。11)M9 minimal medium 5XM9 Salts 200ml, IM MgSO4 2ml, 20% 葡萄糖 20ml, IMCaCl2 IOOul，IM卡那黴素lml，加水定容至至1L。12 )脫色液30%甲醇和10%冰乙酸
13) TPTG 2g IPTG溶於水中，定容至10ml，濾膜過慮後分裝，-20°C保存。14)結合緩衝液=NaCl 29. 25g，Tris-HCl 3. 152g，尿素 360g,加水定容至 1L，pH7. 9。15)洗滌緩衝液結合緩衝液加imidazole至終濃度為10mM。16)洗脫液20%甘油和4%SDS按體積比I: I混合。實施例2重組TBX5蛋白誘導表達
重組表達質粒Pet-30aSH-TBX5轉化BL21後，鋪板，挑克隆到含卡那黴素的lml LB中37°C振蕩培養過夜。次日將菌液全部倒入200ml含有卡那黴素的LB中，37°C，230rpm振蕩培養，至OD值為I. 5時，轉換培養液為M9 minimal medium繼續振蕩培養lh，至OD值達到2-2. 5，然後加入0. 5mM的IPTG，分別在37°C和18°C這兩種不同的溫度下進行誘導。在37°C誘導的蛋白，分別在3h，4h，5h，6h和7h取樣進行SDS-PAGE分析表達情況。在18°C誘導的蛋白，於12-16h後檢測OD值，並取樣進行SDS-PAGE分析表達情況。結果顯示TBX5蛋白在37°C的表達量遠高於18°C時的表達量，並且蛋白在3h時已開始大量表達(圖1)，M表示分子量marker，A表示誘導溫度為37°C，B表示18°C誘導過夜表達。0h、3h、4h、5h、6h、7h分別代表37°C誘導下不同時間點取樣的蛋白表達情況。-TPTG代表未加誘導劑的陰性對照。實施例3高濃度表達法
挑甘油菌到含卡那黴素的lml LB中37°C振蕩培養過夜。次日將菌液全部倒入400ml含有卡那黴素的LB中，37°C，230rpm振蕩培養，至OD值為I. 5時，按2:1轉換培養液為M9minimal medium,再額外添加2倍的葡萄糖,繼續振蕩培養Ih,至OD值達到3. 5-4,然後加入
0.5mM的IPTG，在37°C下進行誘導。整個誘導過程始終檢測培養液的pH值，應維持在6. 0以上。3h後取樣進行SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況。結果顯示高濃度法獲取的蛋白質量比普通誘導表達高(圖2)。I表示未加IPTG作為陰性對照，2表示加入IPTG誘導3h的蛋白表達情況;A表示常規誘導方法，B表示高濃度誘導方法。實施例4細菌的裂解
7000rpm離心20分鐘收集菌體。棄上清，儘量去除培養基。加入30ml結合緩衝液。將重懸菌液置於15ml離心管中，超聲破碎。超聲過程中保持菌液處於冰浴或鹽冰浴中。超聲條件依賴於所使用的超聲儀功率、探頭種類、容器的大小形狀。避免連續超聲導致的大量產熱，分成短時間、多次超聲，且始終保持在冰浴上進行超聲。一般超聲30s，間隔30s，共超聲6-7次，離心收集上清，再次用結合緩衝液重懸沉澱，重複以上超聲步驟，直至徹底重懸沉澱。實施例5重組TBX5蛋白的分離純化
整個過程在4°C的冷庫中進行。用結合緩衝液平衡好Ni親和層析柱後，將超聲裂解得到的菌體上清緩慢過柱，用10倍體積的結合緩衝液洗滌，然後再用含IOmM咪唑的洗滌緩衝液充分洗滌非特異性結合的雜蛋白。每一步都需收集樣品進行SDS-PAGE電泳檢測洗滌情況。最後用10%甘油和2%SDS配製成的洗脫液進行洗脫，收集特異性結合的目的蛋白。採用以下三種洗脫方式
(I)常溫下，採用傳統的500mM的imidazole洗脫液進行過柱洗脫(圖3A)。
(I)常溫下，用洗脫液溶解結合有目的蛋白的柱凝膠，溫和攪拌30分鐘，離心後取上清保存(圖3B)。(2)在37°C用洗脫液溶解結合有目的蛋白的柱凝膠，溫和攪拌30分鐘，離心後取上清保存(圖3C)。採用本發明的B和C兩種洗脫方式，TBX5的蛋白洗脫量與傳統的A方法相比，效率有較大提高。實施例6目的蛋白的Dot blotting檢測
將各次分離純化後的蛋白樣品滴加到硝酸纖維素膜上，用鼠抗人TBX5單克隆抗體4°C孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗在室溫孵育2h，加顯色液後暗室顯影衝片，得到特異性的蛋白點(圖4)，A表示陰性對照，B、C、D表示不同批次分離純化獲取的TBX5樣品。實施例7蛋白定量
採用LOWRY法進行蛋白定量。將100倍體積的試劑A與I倍體積的試劑B混合，吸取2. 5、5、10、20和40ii g標準蛋白BSA至終體積為330 的水中，取IOyl樣品加水至330 u I0每管加入Iml試劑A和B的混合液,充分混勻後室溫放置lOmin。每管加入IOOii I試劑C，立即混勻，室溫下靜置45min，在600nm波長檢測吸光度值。製作標準曲線，根據標準曲線計算蛋白的濃度。在200mlLB誘導表達體系中，採用傳統方法獲得的TBX5蛋白總量為3. 58mg，而採用本發明的誘導表達及分離純化方法得到的蛋白總量為12mg。權利要求
1.一種TBX5蛋白的表達方法，其特徵在於包括如下步驟 (1)誘導表達基於原核系統誘導表達，裂解菌體； (2)分離純化利用鎳柱親和層析來分離純化所得菌體裂解上清中的TBX5蛋白。
2.如權利要求I所述的表達方法，其特徵在於，所述的原核系統誘導表達是重組表達質粒轉化感受態細菌後，加入LB培養液，37°C振蕩培養過夜，然後按2:1或者3:1體積比，轉換到minimal M9中並加入O. 5mM IPTG，誘導表達。
3.如權利要求2所述的表達方法，其特徵在於，所述的原核系統誘導表達是重組表達質粒轉化BL21後，加入LB培養液，37°C振蕩培養過夜，然後加大LB體積37°C振蕩培養至OD值到達I. 5以上後轉入minimal M9，加入0.5mM IPTG，在18°C或37°C溫度下誘導表達。
4.如權利要求2所述的表達方法，其特徵在於，所述的重組表達質粒是pET-30aSH-TBX5，所述重組表達質粒pET-30aSH_TBX5是將克隆獲得的TBX5基因PCR產物， 經Nco I/Hind III雙酶切後，與pET載體連接，然後轉化大腸桿菌，再挑選陽性克隆進行鑑定。
5.如權利要求I所述的表達方法，其特徵在於，所述裂解菌體為超聲波機械破碎菌體。
6.如權利要求I所述的表達方法，其特徵在於，所述的分離純化是預裝鎳親和層析柱，採用5倍柱體積蒸餾水洗柱，然後用5倍柱體積的結合緩衝液平衡柱，將離心得到的菌體上清過柱，收集流出液，然後用含和不含IOmM咪唑的洗滌緩衝液進行洗滌；最後用洗脫液進行洗脫，收集目的蛋白。
7.如權利要求6所述的表達方法，其特徵在於，所述洗脫液的配方按質量百分數計算，含有10%甘油，2%SDS，餘量為水。
全文摘要
本發明公開了一種TBX5蛋白的表達方法。包括如下步驟(1)誘導表達基於原核系統誘導表達，裂解菌體；(2)分離純化利用鎳柱親和層析來分離純化所得菌體裂解上清中的TBX5蛋白。本發明採用高濃度的蛋白誘導表達方法，提高了細菌中目的蛋白的產量，裂解菌體過程中沒有進行包涵體的變性和復性，而是直接從超聲裂解的上清中純化蛋白，使得目的蛋白的回收率和活性得到了最大程度的保持，而且通過優化洗脫方案使得目的蛋白的獲取量較之現有方法也有了較大的提高。
文檔編號C12N15/70GK102703492SQ201210219310
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月29日 優先權日2012年6月29日
發明者餘細勇, 李倩倩, 李曉紅, 王建軍 申請人:廣東省人民醫院